この作品は日の出 (R01GM11755) に P.W.J、g. h. と j. h. 訓練助成フェローシップ国立がん研究所 (NIH) (CA009110) からサポートされていた

ここで説明するすべての方法は、制度的動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) ジョンズ ・ ホプキンス大学のによって承認されています。野生型 c57bl/6 j マウスの実験を行った。
1. 収穫前期クロマチンの作製と胎児または新生児の卵巣に広がる
<ol><li>14.5-19.5 日のポストの coitum (dpc) で胚を抽出するには、頚部転位または CO2窒息 IACUC ガイドラインによると妊娠中の女性を犠牲に。 注: 生後 1-5 卵巣 1.3 のステップに進みます。図 1は、胎生期および出生後隔世で濃縮減数分裂前期段階をまとめたものです。</li>
	<li>V 字形の開口部を作る生殖不能のはさみを使って腹部骨盤腔を開きます。母体の子宮角を分析、胎盤から胚を分離・ リン酸バッファー生理食塩水 (PBS) 37 ° C で x に予め温めておいた 1 の 3 mL を含む 35 mm のペトリ皿に胚を転送 注: 37 ° C で設定 fliptop インキュベーターは、温度を維持するために使用できます。さらに、温度調節されたガラス ステージは卵巣の操作中に温度を維持するためにも使用できます。</li>
	<li>3.5 インチ手術ハサミ胚または IACUC ガイドラインに従って斬首を通して子犬を犠牲に。さらに郭清する前に予め温めておいた PBS に首のない胚または子犬を配置します。</li>
	<li>37 ° C で予め温めておいた PBS の 3 mL を含む別の 35 ミリメートルのシャーレで一度に 1 つの胚または子犬を解剖します。前肢の下と後脚と尾図 2A-Bに記載されている上直接前方半分に沿って、胚の後部の半分の腹側正中線に沿って切断することによって進みます。</li>
	<li>3.5 インチ手術用はさみを使って腹部を開きます。転置または肝臓や腸、37 ° C で予め温めておいた PBS の 3 mL を含む新しい 35 mm のペトリ皿に卵巣を公開のループを削除する細い鉗子を使用して (図 2 bにガイドを参照してください)。卵巣はすぐ下および腹腔内 (図 2 b-C) の後部壁に向かって腎臓の後ろにあります。男性と女性の生殖腺の差異化のためのガイドは、図 2 Dで提供しています。 注: 最適な条件の急速に解剖卵巣を妊娠中の女性が犠牲になる後。</li>
	<li>郭清範囲と時計メガネの場所の下の細いピンセットのペアを使用して各女性胎児から両方の卵巣を削除または複数の井戸の別の井戸に予め温めておいた PBS の含む 0.5 〜 1.0 mL をプレートし 37 ° C で維持</li>
	<li>きれいな時計ガラスまたは卵巣 comp を浸すようにして 9 ウェル プレートの小さな井戸に、0.5 mL ハイポ抽出バッファー (17 mM クエン酸ナトリウム二水和物、ショ糖 50 ミリメートル、5 ミリメートルの EDTA、0.5 mM DTT、30 mM トリス-HCl、プロテアーゼ阻害剤、pH 8.2) に卵巣の各ペアを配置します。letely。しかし、少なくとも 15 分間、30 分以上を孵化させなさい。 注意: は、新鮮なハイポ抽出バッファーを作成し、DTT 添加の 2 時間以内の使用します。</li>
	<li>疎水性障壁の PAP のペンを使って、インキュベーション中に図 3Aに示すように、きれいなガラス 25 x 75 mm2、1 mm 厚の顕微鏡スライド上 2 22 x 22 mm2の正方形を描画します。 注: スライドは、早めに準備することができます。</li>
	<li>きれいなスライドに 100 mM ショ糖の 45-50 μ L をピペットし、ドロップする卵巣の 1 つのペアを転送します。</li>
	<li>2 つの 27 G 針の鋭い端を使用して、ショ糖液に細胞を放出する卵巣を離れてをいじめます。鉗子、卵巣の大きい部分を取り外し、慎重に細胞を分散させるためにショ糖溶液をピペットします。</li>
	<li>固定液の場所 40 μ L (1% パラホルムアルデヒド (PFA)、0.2% 洗剤 (材料の表を参照)、pH 9.2) 準備されたスライドのそれぞれの正方形。200 μ l ピペット チップのスライド表面に固定液を均等に します。</li>
	<li>定着剤を含むスライドのそれぞれの正方形の上にショ糖ミックスの 20 μ L をピペットします。 注: これは卵巣スライドごとの 1 つのペアを使用してに相当します。</li>
	<li>一晩室温で湿気の多い密室でスライドを孵化させなさい。 注: 一晩インキュベートを範囲で指定できます (12-15 時間) 室温で。</li>
	<li>室ふたを開き、完全に風乾するスライドを許可します。</li>
	<li>0.4% 湿潤剤 PBS 溶液 50 mL を含む Coplin jar 内のスライドを洗う 2 min のため空気が乾燥、(材料の表を参照)、immunolabelling プロトコル (手順 6) に進んでください。 メモ: 後で使用するため-80 ° C でスライドを保存することがありますがこれは興味の蛋白質によって異なります。最適な結果を得るのためには、immunolabelling プロトコル (手順 6) にすぐを進みます。</li>
</ol>2. 中期私採卵
<ol><li>それぞれのマウスから分離したから胞状卵胞の数を最大にするには、5 IU 妊馬血清性腺刺激ホルモン (PMSG、として知られている馬絨毛性ゴナドトロピン (eCG)) の性的成熟の処女雌マウス腹腔内注入します。 注: 最適な卵の収量、マウス必要があります時代の 1 ~ 3 カ月収穫卵母細胞の数が年齢とともに減少します。PMSG を準備するには、溶解 5,000 IU の-20 ° C で 600 μ L の単回使用の因数で滅菌 PBS (5 U/0.1 mL) ストアの 100 mL ボトル</li>
	<li>44-48 時間後準備コレクション中、最小必須培地アルファ (MEMα) 培 5% ウシ胎児血清 (FBS) と 3 mg/mL ウシ血清アルブミン (BSA;MEMΑ/BSA/FBS)。0.2 μ m 孔フィルターを通してメディアを滅菌します。MEMα/BSA/FBS マウスごとの 1 つのガラス皿に中小 5% CO2インキュベーターで 37 ° C に暖かいの 2.5 mL をデカントします。 注: 他のコレクションや、市販 (M2 と M16) 文化メディアもよく使用されますように。 注意: 操作手順中に周囲の空気露出を最小限に抑えるために限られた期間のための時間で 1 つ 5% CO2インキュベーターから培養皿を削除することをお勧めします。</li>
	<li>頚部転位または IACUC ガイドラインによると CO2窒息を介してマウスを犠牲に。</li>
	<li>大規模な V 字形の開口部を作る生殖不能のはさみを使って腹部骨盤腔を開きます。マウスの頭に向かって腸鉗子を使用して、転置します。それぞれの子宮角; を検索します。卵巣は胸郭に近位現在します。微細鉗子で卵管を押し、解剖はさみ (図 4) を使用して卵巣に脂肪のスーペリアーをカットします。卵管を押しながら微細鉗子の別のセットの MEMα、BSA、FBS 媒体を含んでいるコレクションの皿に滑液包と場所から卵巣をリリースし続けます。 注: 手順 1、37 ° C で卵巣を維持し、5% CO2で維持することが不可欠です。温度と CO2のレベルの最適なメンテナンスを可能にするのには、5% CO2ミックスにフック fliptop インキュベーターを使用できます。さらに、温度調節されたガラス ステージは卵母細胞の操作中に温度を維持するためにも使用ください。</li>
	<li>27 ゲージ針 (または同じようなサイズ) 1 mL 注射器を使用して手動で大きいから胞状卵胞を穿刺によって卵丘卵子複合体をリリースします。</li>
	<li>解剖顕微鏡で観察しながら手動式マイクロメータ-シリンジ (図 5) または毛管、口運営ガラス ピペットを使用して GV 段卵母細胞を収集します。のみから胞状卵胞からリリースされている卵を収集します。GV 卵子は約 90 の直径を持つ μ m GV 卵母細胞顆粒膜細胞の 2-3 層に囲まれています可能性があり、合計約 200 μ m の直径を持ちます。</li>
	<li>きれいな時計ガラスまたは中期に到達する 6 時間 MEMα/BSA/FBS 媒体を含んでいる 9 ウェル プレートの卵母細胞を培養 5% CO2インキュベーターで 37 ° C で私。</li>
	<li>手順 4 に進みます。</li>
</ol>3. 中期 II (MII) 採卵
<ol><li>それぞれのマウスから分離した卵母細胞を最大にするには、5 IU PMSG の性的に成熟した処女雌マウス腹腔内注入します。44-48 時間後 5 IU ひと絨毛性ゴナドトロピン (hCG) の腹腔内注入します。 注: 最適な卵の収量、マウス必要があります時代の 1 ~ 3 カ月収穫卵母細胞の数が年齢とともに減少します。HCG を準備する溶解ボトル 200 mL の PBS に 10,000 U (5 U/0.1 mL)。-20 ° C で 600 μ L の単回使用の因数で保存します。</li>
	<li>12-14 時間後 2.2 の手順で上記のよう MEMα、BSA、FBS コレクション媒体を準備します。</li>
	<li>頚部転位または IACUC ガイドラインによると CO2窒息を介してマウスを犠牲に。</li>
	<li>大規模な V 字形の開口部を作る生殖不能のはさみを使って腹部骨盤腔を開きます。マウスの頭に向かって腸鉗子を使用して、転置します。それぞれの子宮角を見つけて、卵巣は現在の胸郭に近位。微細鉗子で卵管を押し、解剖はさみ (図 4) を使用して卵巣に脂肪のスーペリアーをカットします。卵巣と卵管を削除し、MEMα、BSA、FBS 媒体を含んでいるコレクションの皿に置きます。 注: 手順 1 と 2、37 ° C で卵巣を維持し、5% CO2で維持することが不可欠です。温度と CO2のレベルの最適なメンテナンスを可能にするのには、5% CO2ミックスにフック fliptop インキュベーターを使用できます。さらに、温度調節されたガラス ステージは卵母細胞の操作中に温度を維持するためにも使用ください。</li>
	<li>27 G で 1 mL 注射器 (または同じようなサイズ) を使用してまたは鉗子をシャープ、MII 卵子を解放する卵管膨大部の穴を引き裂きます。 注: 膨大部で卵子を傷つけないように気をつけてください。卵子が表示されます (図 4)、乳頭が腫れて、半透明表示されます。</li>
	<li>手動式マイクロメータ-シリンジ (図 5) または毛管、口運営ガラス ピペットを使用してコレクションの中新しい皿に MII 卵子卵管の膨大部を収穫します。</li>
	<li>手順 4 に進みます。</li>
</ol>4. 卵を denuding 基礎と透明帯除去
<ol><li>MEMα 中 3 mg/ml BSA の裸に周囲の卵丘細胞 (2.5 mL/マウス) 37 ° c、5% CO2時計ガラスの卵母細胞に補われるヒアルロニダーゼの 300 IU/mL を準備します。 注: ヒアルロニダーゼ効果は準備の 1 時間後に大幅減少します。MII 卵子, ヒアルロニダーゼ治療は必要ではありません。</li>
	<li>裸にする周囲の卵丘細胞卵母細胞に 3 分間 MEMα/BSA のヒアルロニダーゼ 300 IU/mL に卵子積雲細胞複合体を公開します。 注意: それは卵母細胞に損傷を与える、ヒアルロニダーゼへの 3 分露出を超えないようにします。</li>
	<li>卵母細胞を洗って、卵母細胞を新鮮な温め MEMα/BSA の中皿に転送します。小さな口運営ガラス ピペットまたは毛細血管 (約 90 μ m は、卵母細胞の直径よりもわずかに大きい) を使用して、ピペットの複合体を上下の卵丘細胞を完全に分離します。次のステップを準備している間、インキュベーターで回復する卵を許可します。</li>
	<li>酸性タイロード液、MEMα/BSA、37 ° c (500 μ L/マウス) Waymouth のメディアを温めます。小さな 9 よくガラス プレートの各ウェルに場所 300 μ L。</li>
	<li>透明帯 (ZP) を削除するには、タイロード液に 5-10 卵を転送します。ソリューションにのみ 30-45 秒の卵母細胞を公開します。 注: ソリューションにはあまりにもほとんど露出は削除されません、ZP 完全に破裂と広がってから染色体の卵子を回避します。あまりにも多くの露出は損傷し、卵母細胞を殺します。解剖顕微鏡の下で ZP ディゾルブを見て露出時間の最適化に役立ちます。 注意: は新鮮なタイロード液を使用してその機能が年齢とともに低下として重要です。ZP の制服消化できるように卵母細胞のグループごとにタイロード液の新鮮な井戸を使用します。</li>
	<li>ZP 除去後すぐに温めた MEMα/BSA/FBS 媒体に転送することによって卵子を洗います。このステップを繰り返します。 注: は、転送、卵子が一緒に固執する簡単に、ガラス ピペットまたは ZP の毛細血管除去に注意してください。前ぬれガラス ピペットまたは Waymouth の中の毛細血管と、一緒に付着卵が最小限になります。</li>
	<li>転送でき、Waymouth の中 5% CO2インキュベーターで 37 ° C で 30 分の回復する卵。</li>
	<li>手順 5 に進みます。</li>
</ol>5. MI と MII 卵母細胞クロマチン スプレッド
<ol><li>PAP のペンを使用すると、図 6 aに示すように、スライド ガラスに 11 x 44 mm2矩形を描きます。</li>
	<li>定着剤の薄層を使用してスライドをコート (0.2% 1% パラホルムアルデヒド H2O、pH 9.2 トリトン X 100) のスライドに固定液 100 μ L を分注して、前後のスライドを揺動します。過剰な定着剤を取り除くためにスライドをタップします。</li>
	<li>できるだけ小さなメディアとして付いている小さな口ピペット針と 5-10 卵のピックアップ、固定液にスライド上 1 cm から卵子を堆積しながら定着剤コーティング スライド間でラインに針をドラッグします。卵母細胞が寄託されていること、彼らが破裂するため解剖顕微鏡を使用してこの手順を実行します。 注: 卵母細胞は、スライドにすぐにバーストする必要があります。卵子が、高さは、クロマチンの広がりの程度の影響を堆積させた。詳細についてはさらに図 6に代表的な結果を参照してください。</li>
	<li>スライド閉じた加湿チャンバー内で一晩に従うクロマチンを許可する室温で孵化させなさい。</li>
	<li>完全に風乾し、リンスし、0.4% 湿潤剤 H2O、pH 8.0 の 50 mL を含む Coplin jar でスライドするスライドを許可します。</li>
	<li>手順 6 に進みます。</li>
</ol>6. Immunolabelling
<ol><li>表 1に示す抗体希釈バッファー (ADB) を準備します。</li>
	<li>洗浄バッファー (WB) 溶液 (10 %pbs で希釈した ADB)、50 mL を格納した 2 つの Coplin jar と 50 mL WB と 0.05% 中性洗剤溶液を含む 1 つの Coplin jar の準備 (例えば、50 mL WB に 10% 洗剤の 250 μ L を追加)。</li>
	<li>WB の 50 mL を含む 1 つの Coplin jar のセクション 1 と 10 分のこのプロトコルの 5 で準備されたスライドを洗います。 注意: 任意の時点で immunolabelling の中にドライ スライドを聞かせてはいけません。</li>
	<li>Coplin jar 含む 50 mL WB と 0.05% 中性洗剤溶液に 10 分間スライドを洗います。10 分間 WB 溶液 50 mL を含む残り Coplin jar 内のスライドを洗います。</li>
	<li>ADB で希釈した選択された一次抗体の 100 μ L で余分な液体とカバーのスライドをタップします。4 ° c 密閉湿気の多い室内で一晩インキュベートします。 注: インキュベーションは、3 に 2 を短縮できる時間 37 ° C でCoverslip やパラフィルムでスライドを覆うことによって抗体 (例えば、50 μ L) のより小さいボリュームを使用します。</li>
	<li>0.2% 湿潤剤 PBS 溶液、pH 8.0 50 mL を含む Coplin jar にスライドをすすぐ。</li>
	<li>6.5 6.2 の手順を繰り返します。</li>
	<li>ADB で希釈した選択した二次抗体の 100 μ L で余分な液体とカバーのスライドをタップします。スライド 2 に 1 を孵化させなさい 37 ° c 湿度の高い密室での時間。</li>
	<li>2 回の Coplin jar 0.2% 湿潤剤 PBS 溶液、pH 8.0 50 mL を含む 10 分スライドを洗います。</li>
	<li>2 回 0.2% 湿潤剤 H2O 溶液、pH 8.0 50 mL を含む Coplin jar ファイルで 5 分用のスライドを洗います。</li>
</ol>7. マウント スライド
<ol><li>手順 2 で準備、前期クロマチンのスプレッド 4', 6-diamidino-2-phenylindole を含むメディアをマウントの 100 μ L を追加 (DAPI、1.5µg/mL)。MI と MII のクロマチンのスプレッドの準備手順 5 は、DAPI を含むメディアをマウントの 50 μ L を追加 (1.5µg/mL)。そっと離れて余分な液体をしみ。</li>
	<li>上 22 mm × 60 mm coverslip を置き、クリアのマニキュアをシールします。蛍光顕微鏡による評価まで 4 ° C または-20 ° C のスライド ボックスに格納します。 注: カバー スリップに軽くマニキュアでシーリングする前に余分なマウント中の解消をするをタップします。</li>
</ol>

<ol>
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著者が明らかに何もありません。

クロマチン普及準備は、年代順に女性哺乳類減数分裂とタンパク質の動的局在の研究に研究を許可します。胎児・新生児のクロマチン スプレッド行事が減数分裂前期の綿密な分析を可能にします。中期私と中期 II クロマチン スプレッドを使用と単一の妹を区別できますから染色分け体一対姉妹と一対の相同染色体倍数性の評価と同様。比較では、ここで説明したプロトコルできる有利な頻?...

精子、中に思春期と成人1発症時精巣生殖細胞の減数分裂の大波は準同期を急速に継続的に補充されます。男性とは対照的女性で減数分裂が胎児の発育中にのみ開始されます。誕生、次卵母細胞のまま前期の長期 dictyate 段階で逮捕された私は、そのまま卵核胞 (GV; 核膜) 思春期まで。思春期の発症時は、卵母細胞のサブセット周期的成長と成熟、減数分裂再開の開始をマークを受けることが選択されます。完全育てられた卵母細胞の減数分裂再開は胚胞崩壊 (GVBD) として知られているプロセスの GV の消失によって明示されます。卵母細胞は、染色体凝縮と極体押出続く分離を経る。卵母細胞は MII への進行時に逮捕になるし、が受精後にのみ 2 番目と最終的な減数分裂を完了する刺激されます。
雌の受胎は減数分裂前期の成功に大きく依存私進行。このための鍵は、物理的なリンケージを介したクロス オーバー組換え2を介して誘導の DNA 二重鎖切断 (Dsb) の修理 chiasmata として知られている相同染色体間の形成です。このプロセスは、そのシナプス3を容易にする相同染色体の間を形成する減数分裂 (SC) として知られている動的タンパク質豊富な足場のコンテキスト内で発生します。SC はジッパーのような三者構造中部の蛋白質によって接続されている 2 つの平行横要素から成る継続的な DNA 修理を通して一緒に同族体を保持しています。シナプス前、軸の要素と呼ばれる外側の要素の前駆体姉妹染色分け体を形成します。SYCP2 など SYCP3 減数分裂タンパク質は、初期前期中には姉妹染色分け体結束軸 colocalize 軸の要素を形成します。これらの後結合横フィラメント蛋白質、SYCP1 は、容易にアセンブリ中心的な要素と一直線に並べられた同族体4の間のシナプス部位として機能します。マウス卵母細胞の完全なシナプスによって示されます 20 の存在完全に準備を広げる重複 SYCP3 と SYCP1 のストレッチ、クロマチンを使用して視覚化することができます。シナプスが完了するという同族体間フォーム chiasmata を宛先とする成熟したクロス オーバーが飾られて mutL 相同物 (MLH1/3) ダイマーの正確な処理5,6を促進するために pachytene サブステージに入る時に,7. コヒーシン、コンデンシン、複雑な SMC5/6 など染色体 (SMC) 錯体の構造のメンテナンスが減数分裂8,9、全体構造と染色体ダイナミクスの制御のために重要 10、11,12。総称して、これらのイベントは紡錘体極次の SC の解体に反対する相同染色体の適切な双方向を確保します。
減数分裂の細胞周期は、ゲノム維持プログラム誘導と発癌の後続の修理のための様々 な蛋白質の役割について検討する強力なモデルです。さらに、哺乳類の減数分裂も、エピジェネティック修飾と刷り込み13の研究に関連するモデルです。ただし、女性減数分裂 (図 1) の哺乳類の胎児・新生児の卵巣で行われるこれらのイベントを評価するために技術的に困難です。前期 5 サブステージを分かれますことができます: leptonema、zygonema、pachynema、diplonema、dictyate。ここで、分離および胎児・新生児の卵巣と精巣 (図 2) を区別する方法をについて説明します。上記の方法から適応、この原稿も女性減数分裂前期の準備のためのビデオのデモとプロトコル (手順 1) の概要私クロマチン広がる14,15,16,17.このプロトコルにより前期の詳細なミクロ分析、immunolabelling、6-7 の手順で説明したようとつながれたとき私卵母細胞でのイベント。
卵はエラーを起こしやすいと第一減数分裂時に染色体紡錘イベントを表す子孫18,19の遺伝病の最も一般的なソース。本稿では (プロトコル手順 2)、GV 段の成熟した卵子を成熟雌マウスの発動を促された卵巣から抽出しプロトコルについて述べる.支持条件の下では、完全育てられた卵母細胞は黄体形成ホルモンに依存しない次の分離と培養20減数分裂の再開を受けます。減数分裂の再開後卵母細胞は減数分裂を経て進行し、中期 II で逮捕。卵母細胞は限り受精.中期 II で逮捕されました。手順 2-5、以前に報告されたプロトコルの収集、文化およびクロマチンを広める準備21MI と MII 卵子を準備する方法を説明するビデオ デモを適応させます。技術を広めるこのクロマチン染色体に関連付けられている蛋白質の明確な immunolabelling が可能です。さらに、このプロトコルし一価、二価染色体を区別するためにも使用できます、さらに単一の妹を解決できる卵母細胞の倍数性の評価を容易にする染色分け体。したがって、減数分裂タンパク質の局在パターンを明らかに加えこのプロトコルも MI と MII の間に染色体紡錘の潜在的な原因を解明するための非常に貴重なツールとして使用できます。

<table><tbody><tr><td>10X Phosphate buffered saline (PBS) pH 7.4</td><td>Quality Biological</td><td>119-069-161</td><td></td></tr><tr><td>60 mm x 15 mm petri dishes</td><td>Denville</td><td>T1106</td><td></td></tr><tr><td>35mm x 12mm petri dishes</td><td>Denville</td><td>T1103</td><td></td></tr><tr><td>Fine forceps</td><td>VWR</td><td>300-050</td><td></td></tr><tr><td>Micro dissection scissors</td><td>Ted Pella</td><td>1340</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting&amp;nbsp;scissors, sharp tip, 41/2&quot;</td><td>VWR</td><td>82027-578</td><td></td></tr><tr><td>Watch glass square 1 5/8</td><td>Carolina Biological Supply Company</td><td>742300</td><td>Autoclave before each use</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma</td><td>S8501</td><td></td></tr><tr><td>Trisodium Citrate Dihydrate</td><td>Sigma</td><td>S1804</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>1,4-Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma</td><td>646563</td><td>Add to hypotonic buffer immediately before use</td></tr><tr><td>50x Protease Inhibitor</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td>Add to hypotonic buffer immediately before use</td></tr><tr><td>Turberculin syringe with needle (1cc, 27 G x 1/2 in)</td><td>Becton, Dickinson (BD)</td><td>309623</td><td></td></tr><tr><td>Gold seal ultra frost glass slides (25X75mm, 1mm thick)</td><td>Thermo</td><td>3063-002</td><td></td></tr><tr><td>Super PAP pen, large (liquid blocker)</td><td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td><td>71310</td><td></td></tr><tr><td>16% Paraformaldehyde aqueous</td><td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td>Detergent in manuscript</td></tr><tr><td>Immuno stain moisture chamber</td><td>Evergreen</td><td>240-9020-Z10</td><td></td></tr><tr><td>Coplin jars</td><td>Fisher</td><td>08-815</td><td></td></tr><tr><td>Photo-flo 200</td><td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td><td>74257</td><td>Wetting agent in manuscript</td></tr><tr><td>Pregnant mare serum gonadotropin (PMSG)</td><td>Sigma</td><td>G4877</td><td>Store aliquots at -20C</td></tr><tr><td>Human chorionic gonadotropin (HCG)</td><td>Sigma</td><td>C0434</td><td>Store aliquots at -20C</td></tr><tr><td>PYREX Spot Plates with nine concave cavities</td><td>Fisher</td><td>13-748B</td><td>Autoclave before each use</td></tr><tr><td>Glass capillary</td><td>Fisher</td><td>22260943</td><td>For making oocyte collection needles</td></tr><tr><td>Brand Parafilm M</td><td>Sigma</td><td>BR701501</td><td>For making oocyte collection needles</td></tr><tr><td>Latex rubber tubing (3.2 mm inner diameter x 6.4 mm outer diameter)</td><td>Fisher</td><td>14-178-5B</td><td>For making oocyte collection needles</td></tr><tr><td>Latex rubber tubing (6.4 mm inner diameter x 11.1 mm outer diameter)</td><td>Fisher</td><td>14-178-5D</td><td>For making oocyte collection needles</td></tr><tr><td>Flexible silicone rubber nosepiece, hard plastic mouthpiece and 15 inches of latex tubing</td><td>Sigma</td><td>A5177-5EA</td><td>For making oocyte collection needles</td></tr><tr><td>Mitutoyo micrometer head</td><td>Mituoyo</td><td>150-208</td><td>For making oocyte collection needles</td></tr><tr><td>Syringe 5 mL</td><td>BD Biosciences</td><td>309646</td><td>For making oocyte collection needles</td></tr><tr><td>Syringe filter 0.45 &amp;mu;m filter</td><td>Corning</td><td>431220</td><td>For making oocyte collection needles</td></tr><tr><td>Glass Pasteur Pipette 5 3/4&quot;</td><td>Fisher</td><td>13-678-6A</td><td>For making oocyte collection needles</td></tr><tr><td>83 x 0.5 mm pipette tip</td><td>Denville</td><td>P3080</td><td>For making oocyte collection needles</td></tr><tr><td>&amp;alpha;-MEM</td><td>Invitrogen</td><td>11415049</td><td></td></tr><tr><td>Waymouth&#039;s media</td><td>Life Technologies</td><td>11220035</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Fisher</td><td>A3160602</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A3311</td><td>For oocyte culture media</td></tr><tr><td>500ml filter units 0.22um</td><td>Denville</td><td>F5227</td><td></td></tr><tr><td>Hyaluronidase</td><td>Sigma</td><td>H3506</td><td></td></tr><tr><td>Tyrode&amp;rsquo;s solution</td><td>Sigma</td><td>T1788</td><td>Store aliquots at -20C</td></tr><tr><td>Horse serum</td><td>Sigma</td><td>H-1270</td><td>For ADB/wash buffer</td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A1470</td><td>For ADB/wash buffer</td></tr><tr><td>VECTASHIELD antifade mounting medium with DAPI</td><td>Vector Labs</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Microscope cover slides (22mmx60mm)</td><td>Fisher</td><td>12-544-G</td><td></td></tr><tr><td>Clear nail polish</td><td>Amazon</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Microscopes&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SteREO Discovery.V8</td><td>Zeiss</td><td>495015-0001-000</td><td></td></tr><tr><td>Observer Z1</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Primary Antibodies&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-MLH1</td><td>Life Technologies</td><td>MA5-15431</td><td>Dilution factor- 1:100</td></tr><tr><td>Rabbit anti-SYCP1</td><td>Life Technologies</td><td>PA1-16763</td><td>Dilution factor- 1:1000</td></tr><tr><td>Goat anti-SCP3</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-20845</td><td>Dilution factor- 1:50</td></tr><tr><td>Human anti-centromere protein</td><td>Antibodies Incorporated</td><td>15-235</td><td>Dilution factor- 1:100</td></tr><tr><td>Rabbit anti- TOPOII</td><td>Abcam</td><td>ab109524</td><td>Dilution factor- 1:100</td></tr><tr><td>Mouse anti-Histone H4 (di methyl K20, tri methyl K20)</td><td>Abcam</td><td>ab78517</td><td>Dilution factor- 1:500</td></tr><tr><td>Rabbit anti-Rec8</td><td>Courtesy of Dr. Karen Schindler</td><td>N/A</td><td>Dilution factor- 1:10,000</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Secondary Antibodies&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Donkey anti-goat IgG (H+L) Alexa Fluor 568 conjugate</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>A-11057</td><td>Dilution factor- 1:500</td></tr><tr><td>Donkey anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 488 conjugate</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>A-21202</td><td>Dilution factor- 1:500</td></tr><tr><td>Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 647 conjugate</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>A-31573</td><td>Dilution factor- 1:500</td></tr><tr><td>Goat anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 568 conjugate</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>A-11004</td><td>Dilution factor- 1:500</td></tr><tr><td>Goat anti-Human IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>A-11013</td><td>Dilution factor- 1:500</td></tr><tr><td>Goat anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 568 conjugate</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>A-11011</td><td>Dilution factor- 1:500</td></tr></tbody></table>

chromatin spread preparations for the analysis of mouse oocyte progression from prophase to metaphase ii

クロマチン拡散技術は、配偶子、精子形成に特に様々 なタンパク質の動的局在を評価するために広く使用されています。これらのテクニックのシナプスと DNA 修復減数分裂において相同染色体対など中タンパク質と DNA の局在パターンの可視化を可能にします。いくつかのプロトコルは、文献に記載されている、哺乳類前期卵子を使用して一般的なクロマチン拡散技術が限られており、胎児の卵巣で減数分裂の開始のタイミングが難しい。比較では、前期の精母細胞はマイクロダイ セクションを必要とせずに高い利回りと少年の雄マウスから収集できます。しかし、少年と成人の精巣における減数分裂と後減数分裂生殖細胞集団の不均一性による特定の段階のセルの純粋な同期された人口を得ることが困難です。減数分裂の後の段階、卵母細胞成熟卵母細胞のグループは成熟雌マウスから収集および文化で減数分裂を再開する刺激できるので (mi) または減数分裂 II (MII) 減数分裂を受けてを評価すると便利です。ここでは、卵母細胞減数分裂クロマチンを広める準備法、胎児から新生児に解剖し、大人卵巣は、ビデオのデモを伴う説明。哺乳類卵母細胞の染色体紡錘イベントは、MI の間に特に頻繁に。行い卵形成の段階でさまざまな異なる突然変異や環境の露出の効果を特徴付けるこれらのテクニックを使用できます。内に記述された技術が減数分裂期哺乳類の卵形成過程の理解と染色体・ タンパク質ダイナミクスの性的に二形の機能を向上させる貴重なは配偶子形成の間の明確な相違点があると.

可視化し、卵母細胞の減数分裂期染色体を評価する 2 つの方法を説明しました。最初のテクニックは、胎生期および新生児の卵巣に前期の進行を評価への仕出し料理します。前期クロマチン普及準備、減数分裂、染色体、シナプスのペアリングを含む多数の動的プロセスを可視化するため非常に貴重な desynapsis、相同組換えと染色体のエピジェネティックな改造しま?...

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マウス卵母細胞の前期から中期 II への進行を分析するためのクロマチン スプレッド調製物 |遺伝学 |ビデオ

Chromatin Spread Preparations for the Analysis of Mouse Oocyte Progression from Prophase to Metaphase II

クロマチン広がるマウス卵母細胞の進行を前期から中期 II の分析のための準備

哺乳類の卵形成がエラーを起こしやすい、染色体の紡錘のために特に知られています。この原稿は、マウス前期, クロマチンを広める準備方法をについて説明します中期私と卵母細胞の II 上演します。クロマチン結合蛋白質と哺乳類の卵形成過程で染色体の形態の研究を可能にするこれらの基本的なテクニック。

Chromatin spread techniques have been widely used to assess the dynamic localization of various proteins during gametogenesis, particularly for ...

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15.3K ビュー.  Johns Hopkins University Bloomberg School of Public Health. 哺乳類の卵形成がエラーを起こしやすい、染色体の紡錘のために特に知られています。この原稿は、マウス前期, クロマチンを広める準備方法をについて説明します中期私と卵母細胞の II 上演します。クロマチン結合蛋白質と哺乳類の卵形成過程で染色体の形態の研究を可能にするこれらの基本的なテクニック。

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Isolation and Characterization of Mouse Antral Oocytes Based on Nucleolar Chromatin Organization

This protocol describes a simple and quick method to isolate and characterize mouse antral GV (Germinal Vesicle) oocytes as able (SN, Surrounded Nucleolus) or unable (NSN, Not Surrounded Nucleolus) to develop to the blastocyst stage after in vitro maturation (IVM) and in vitro fertilization (IVF). It makes use of Hoeschst33342 (or any other DNA intercalating dye) able to bind to the heterochromatin of the nucleolus showing a ring in the SN oocytes or not, like in the NSN oocytes. This represents the easiest and quickest way to sort both antral oocytes that can be eventually used for IVM or IVF procedures. 
Briefly, the protocol consists of the following steps: hormone injection to stimulate follicular growth; isolation of the oocytes at the GV stage from the antral compartment by puncturing the ovary with a sterile needle; preparation of thin glass pipettes for mouth pipetting of the oocytes; sorting of the oocytes with Hoechst33342 prepared at a supravital concentration; IVM, IVF or any other molecular/cellular analysis.
Unfortunately there are still few evidences to sort SN and NSN oocytes using less invasive techniques. If and once they will be identified, they could be potentially applied to human assisted reproductive technologies, although with several aspects that should be modified. To date, this technique has potential implications to dramatically increase IVM and IVF successful procedures in both endangered and species with economic interest.

Here we present a protocol for the characterization of mouse antral oocytes based on nucleolar organization.

核小体クロマチン組織に基づいてマウス洞卵母細胞の単離とキャラクタリゼーション

This protocol describes a simple and quick method to isolate and characterize mouse antral GV (Germinal Vesicle) oocytes as able (SN, Surrounded ...

発生生物学

Using Mouse Oocytes to Assess Human Gene Function During Meiosis I

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively correlated with maternal age, age alone is not always predictive of the risk of generating an aneuploid embryo. Therefore, gene variants might account for incorrect chromosome segregation during oogenesis. Given that access to human oocytes is limited for research purposes, a series of assays were developed to study human gene function during meiosis I using mouse oocytes. First, messenger RNA (mRNA) of the gene and gene variant of interest are microinjected into prophase I-arrested mouse oocytes. After allowing time for expression, oocytes are synchronously released into meiotic maturation to complete meiosis I. By tagging the mRNA with a sequence of a fluorescent reporter, such as green fluorescent protein (Gfp), the localization of the human protein can be assessed in addition to the phenotypic alterations. For example, gain or loss of function can be investigated by establishing experimental conditions that challenge the gene product to fix meiotic errors. Although this system is advantageous in investigating human protein function during oogenesis, adequate interpretation of results should be undertaken given that protein expression is not at endogenous levels and, unless controlled for (i.e. knocked out or down), murine homologs are also present in the system.

As the genetic variants associated with human disease begin to become uncovered, it is becoming increasingly important to develop systems with which to rapidly evaluate the biological significance of those identified variants. This protocol describes methods for evaluating human gene function during female meiosis I using mouse oocytes.

マウス卵母細胞を減数分裂の間に人間の遺伝子の機能を評価するために使用私

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively ...

遺伝学

Analysis of Chromosome Segregation, Histone Acetylation, and Spindle Morphology in Horse Oocytes

The field of assisted reproduction has been developed to treat infertility in women, companion animals, and endangered species. In the horse, assisted reproduction also allows for the production of embryos from high performers without interrupting their sports career and contributes to an increase in the number of foals from mares of high genetic value. The present manuscript describes the procedures used for collecting immature and mature oocytes from horse ovaries using ovum pick-up (OPU). These oocytes were then used to investigate the incidence of aneuploidy by adapting a protocol previously developed in mice. Specifically, the chromosomes and the centromeres of metaphase II (MII) oocytes were fluorescently labeled and counted on sequential focal plans after confocal laser microscope scanning. This analysis revealed a higher incidence in the aneuploidy rate when immature oocytes were collected from the follicles and matured in vitro compared to in vivo. Immunostaining for tubulin and the acetylated form of histone four at specific lysine residues also revealed differences in the morphology of the meiotic spindle and in the global pattern of histone acetylation. Finally, the expression of mRNAs coding for histone deacetylases (HDACs) and acetyl-transferases (HATs) was investigated by reverse transcription and quantitative-PCR (q-PCR). No differences in the relative expression of transcripts were observed between in vitro and in vivo matured oocytes. In agreement with a general silencing of the transcriptional activity during oocyte maturation, the analysis of the total transcript amount can only reveal mRNA stability or degradation. Therefore, these findings indicate that other translational and post-translational regulations might be affected.
Overall, the present study describes an experimental approach to morphologically and biochemically characterize the horse oocyte, a cell type that is extremely challenging to study due to low sample availability. However, it can expand our knowledge on the reproductive biology and infertility in monovulatory species.

This manuscript describes an experimental approach to morphologically and biochemically characterize horse oocytes. Specifically, the present work illustrates how to collect immature and mature horse oocytes by ultrasound-guided ovum pick-up (OPU) and how to investigate chromosome segregation, spindle morphology, global histone acetylation, and mRNA expression.

馬の卵母細胞における染色体分離、ヒストンアセチル化およびスピンドル形態の解析

The field of assisted reproduction has been developed to treat infertility in women, companion animals, and endangered species. In the horse, assisted ...

Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Zebrafish Spermatocytes

Meiosis is the key cellular process required to create haploid gametes for sexual reproduction. Model organisms have been instrumental in understanding the chromosome events that take place during meiotic prophase, including the pairing, synapsis, and recombination events that ensure proper chromosome segregation. While the mouse has been an important model for understanding the molecular mechanisms underlying these processes, not all meiotic events in this system are analogous to human meiosis. We recently demonstrated the exciting potential of the zebrafish as a model of human spermatogenesis. Here we describe, in detail, our methods to visualize meiotic chromosomes and associated proteins in chromosome spread preparations. These preparations have the advantage of allowing high resolution analysis of chromosome structures. First, we describe the procedure for dissecting testes from adult zebrafish, followed by cell dissociation, lysis, and spreading of the chromosomes. Next, we describe the procedure for detecting the localization of meiotic chromosome proteins, by immunofluorescence detection, and nucleic acid sequences, by fluorescence in situ hybridization (FISH). These techniques comprise a useful set of tools for the cytological analysis of meiotic chromatin architecture in the zebrafish system. Researchers in the zebrafish community should be able to quickly master these techniques and incorporate them into their standard analyses of reproductive function.

Nuclear surface spreads are an indispensable tool for studying chromosome events during meiosis. Here we demonstrate a method to prepare and visualize meiotic chromosomes during prophase I from zebrafish spermatocytes.

ゼブラフィッシュの精子細胞からのマイオサイト染色体の広がりの調製

Meiosis is the key cellular process required to create haploid gametes for sexual reproduction. Model organisms have been instrumental in understanding ...

Evaluation of the Spindle Assembly Checkpoint Integrity in Mouse Oocytes

Aneuploidy is the leading genetic abnormality causing early miscarriage and pregnancy failure in humans. Most errors in chromosome segregation that give rise to aneuploidy occur during meiosis in oocytes, but why oocyte meiosis is error-prone is still not fully understood. During cell division, cells prevent errors in chromosome segregation by activating the spindle assembly checkpoint (SAC). This control mechanism relies on detecting kinetochore (KT)-microtubule (MT) attachments and sensing tension generated by spindle fibers. When KTs are unattached, the SAC is activated and prevents cell-cycle progression. The SAC is activated first by MPS1 kinase, which triggers the recruitment and formation of the mitotic checkpoint complex (MCC), composed of MAD1, MAD2, BUB3, and BUBR1. Then, the MCC diffuses into the cytoplasm and sequesters CDC20, an anaphase-promoting complex/cyclosome (APC/C) activator. Once KTs become attached to microtubules and chromosomes are aligned at the metaphase plate, the SAC is silenced, CDC20 is released, and the APC/C is activated, triggering the degradation of Cyclin B and Securin, thereby allowing anaphase onset. Compared to somatic cells, the SAC in oocytes is not as effective because cells can undergo anaphase despite having unattached KTs. Understanding why the SAC is more permissive and if this permissiveness is one of the causes of chromosome segregation errors in oocytes still needs further investigation. The present protocol describes the three techniques to comprehensively evaluate SAC integrity in mouse oocytes. These techniques include using nocodazole to depolymerize MTs to evaluate the SAC response, tracking SAC silencing by following the kinetics of Securin destruction, and evaluating the recruitment of MAD2 to KTs by immunofluorescence. Together these techniques probe mechanisms needed to produce healthy eggs by providing a complete evaluation of SAC integrity.

Error in chromosome segregation is a common feature in oocytes. Therefore, studying the spindle assembly checkpoint gives important clues about the mechanisms needed to produce healthy eggs. The present protocol describes three complementary assays to evaluate spindle assembly checkpoint integrity in mouse oocytes.

マウス卵母細胞における紡錘体アセンブリチェックポイント完全性の評価

Aneuploidy is the leading genetic abnormality causing early miscarriage and pregnancy failure in humans. Most errors in chromosome segregation that give ...

Mouse Oocyte Microinjection, Maturation and Ploidy Assessment

Mistakes in chromosome segregation lead to aneuploid cells. In somatic cells, aneuploidy is associated with cancer but in gametes, aneuploidy leads to infertility, miscarriages or developmental disorders like Down syndrome. Haploid gametes form through species-specific developmental programs that are coupled to meiosis. The first meiotic division (MI) is unique to meiosis because sister chromatids remain attached while homologous chromosomes are segregated. For reasons not fully understood, this reductional division is prone to errors and is more commonly the source of aneuploidy than errors in meiosis II (MII) or than errors in male meiosis 1,2. 
In mammals, oocytes arrest at prophase of MI with a large, intact germinal vesicle (GV; nucleus) and only resume meiosis when they receive ovulatory cues. Once meiosis resumes, oocytes complete MI and undergo an asymmetric cell division, arresting again at metaphase of MII. Eggs will not complete MII until they are fertilized by sperm. Oocytes also can undergo meiotic maturation using established in vitro culture conditions 3. Because generation of transgenic and gene-targeted mouse mutants is costly and can take long periods of time, manipulation of female gametes in vitro is a more economical and time-saving strategy. 
Here, we describe methods to isolate prophase-arrested oocytes from mice and for microinjection. Any material of choice may be introduced into the oocyte, but because meiotically-competent oocytes are transcriptionally silent 4,5 cRNA, and not DNA, must be injected for ectopic expression studies. To assess ploidy, we describe our conditions for in vitro maturation of oocytes to MII eggs. Historically, chromosome-spreading techniques are used for counting chromosome number 6. This method is technically challenging and is limited to only identifying hyperploidies. Here, we describe a method to determine hypo-and hyperploidies using intact eggs 7-8. This method uses monastrol, a kinesin-5 inhibitor, that collapses the bipolar spindle into a monopolar spindle 9 thus separating chromosomes such that individual kinetochores can readily be detected and counted by using an anti-CREST autoimmune serum. Because this method is performed in intact eggs, chromosomes are not lost due to operator error.

Oocytes are prone to aneuploidy due to errors in chromosome segregation during meiotic maturation. Aneuploid eggs can cause infertility, miscarriages or developmental disorders like Down syndrome. Here, we describe methods to introduce materials of choice into oocytes and methods to study meiotic maturation and assess ploidy.

マウス卵母細胞のマイクロインジェクション、成熟および倍数性評価

Mistakes in chromosome segregation lead to aneuploid cells.  In somatic cells, aneuploidy is associated with cancer but in gametes, aneuploidy leads to ...

生物学

A Cell Free Assay to Study Chromatin Decondensation at the End of Mitosis

During the vertebrate cell cycle chromatin undergoes extensive structural and functional changes. Upon mitotic entry, it massively condenses into rod shaped chromosomes which are moved individually by the mitotic spindle apparatus. Mitotic chromatin condensation yields chromosomes compacted fifty-fold denser as in interphase. During exit from mitosis, chromosomes have to re-establish their functional interphase state, which is enclosed by a nuclear envelope and is competent for replication and transcription. The decondensation process is morphologically well described, but in molecular terms poorly understood: We lack knowledge about the underlying molecular events and to a large extent the factors involved as well as their regulation. We describe here a cell-free system that faithfully recapitulates chromatin decondensation in vitro, based on mitotic chromatin clusters purified from synchronized HeLa cells and X. laevis egg extract. Our cell-free system provides an important tool for further molecular characterization of chromatin decondensation and its co-ordination with processes simultaneously occurring during mitotic exit such as nuclear envelope and pore complex re-assembly.

The molecular mechanisms of the decondensation of highly compacted mitotic chromatin are ill-defined. We present a cell-free assay based on mitotic chromatin clusters isolated from HeLa cells and Xenopus laevis egg extract that faithfully reconstitutes the decondensation process in vitro.

無細胞アッセイは、有糸分裂の終了時クロマチン脱凝縮を勉強します

During the vertebrate cell cycle chromatin undergoes extensive structural and functional changes. Upon mitotic entry, it massively condenses into rod ...

Meiotic Spindle Assessment in Mouse Oocytes by siRNA-mediated Silencing

Errors in chromosome segregation during meiotic division in gametes can lead to aneuploidy that is subsequently transmitted to the embryo upon fertilization. The resulting aneuploidy in developing embryos is recognized as a major cause of pregnancy loss and congenital birth defects such as Down&#8217;s syndrome. Accurate chromosome segregation is critically dependent on the formation of the microtubule spindle apparatus, yet this process remains poorly understood in mammalian oocytes. Intriguingly, meiotic spindle assembly differs from mitosis and is regulated, at least in part, by unique microtubule organizing centers (MTOCs). Assessment of MTOC-associated proteins can provide valuable insight into the regulatory mechanisms that govern meiotic spindle formation and organization. Here, we describe methods to isolate mouse oocytes and deplete MTOC-associated proteins using a siRNA-mediated approach to test function. In addition, we describe oocyte fixation and immunofluorescence analysis conditions to evaluate meiotic spindle formation and organization.

Here, we present a protocol for specific siRNA-mediated mRNA depletion followed by immunofluorescence analysis to evaluate meiotic spindle assembly and organization in mouse oocytes. This protocol is suitable for in vitro depletion of transcripts and functional assessment of different spindle and/or MTOC-associated factors in oocytes.

siRNA媒介サイレンシングによるマウス卵母細胞における減数分裂紡錘体の評価

Errors in chromosome segregation during meiotic division in gametes can lead to aneuploidy that is subsequently transmitted to the embryo upon ...

Techniques for Imaging Prometaphase and Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes

Chromosome segregation in human oocytes is error prone, resulting in aneuploidy, which is the leading genetic cause of miscarriage and birth defects. The study of chromosome behavior in oocytes from model organisms holds much promise to uncover the molecular basis of the susceptibility of human oocytes to aneuploidy. Drosophila melanogaster is amenable to genetic manipulation, with over 100 years of research, community, and technique development. Visualizing chromosome behavior and spindle assembly in Drosophila oocytes has particular challenges, however, due primarily to the presence of membranes surrounding the oocyte that are impenetrable to antibodies. We describe here protocols for the collection, preparation, and imaging of meiosis I spindle assembly and chromosome behavior in Drosophila oocytes, which allow the molecular dissection of chromosome segregation in this important model organism.

Techniques for Imaging Prometaphase and Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes

We present protocols for the collection, preparation, and imaging of mature Drosophila oocytes. These methods allow the visualization of chromosome behavior and spindle assembly and function during meiosis.

固定における減数分裂Iのイメージング前中期および中期のための技術<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;卵母細胞

Chromosome segregation in human oocytes is error prone, resulting in aneuploidy, which is the leading genetic cause of miscarriage and birth defects. The ...

Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Mouse Spermatocytes

Mammalian meiosis is a dynamic developmental process that occurs in germ cells and can be studied and characterized. Using a method to spread nuclei on the surface of slides (rather than dropping them from a height), we demonstrate an optimized technique on mouse spermatocytes that was first described in 1997. This method is widely used in laboratories to study mammalian meiosis because it yields a plethora of high quality nuclei undergoing substages of prophase I. Seminiferous tubules are first placed in a hypotonic solution to swell spermatocytes. Then spermatocytes are released into a sucrose solution to create a cell suspension, and nuclei are spread onto fixative-soaked glass slides. Following immunostaining, a diversity of proteins germane to meiotic processes can be examined. For example, proteins of the synaptonemal complex, a tripartite structure that connects the chromosome axes/cores of homologs together can be easily visualized. Meiotic recombination proteins, which are involved in repair of DNA double-strand breaks by homologous recombination, can also be immunostained to evaluate progression of prophase I. Here we describe and demonstrate in detail a technique widely used to study mammalian meiosis in spermatocytes from juvenile or adult male mice.

Meiosis is the developmental process by which gametes are formed through a single round of DNA replication and two successive rounds of chromosome segregation. Mammalian meiosis can be examined by utilizing a technique to prepare meiotic chromosome spreads. Here, we demonstrate a method of preparing surface-spread nuclei from mouse spermatocytes.

マウス精母細胞から減数分裂期染色体の準備をスプレッドします。

Mammalian meiosis is a dynamic developmental process that occurs in germ cells and can be studied and characterized. Using a method to spread nuclei on ...