Este trabalho foi financiado pelo NIGMS (R01GM11755) para P.W.J e por uma bolsa de subsídio de formação do Instituto Nacional de câncer (NIH) (CA009110) para G.H. e J.H.

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo cuidado institucional do Animal e Comissão de utilização (IACUC) da Universidade de Johns Hopkins. Experimentos foram realizados em camundongos C57BL/6J de tipo selvagem.
1. colheita de ovários Fetal ou Neonatal e preparação da prófase cromatina se espalha
<ol><li>Para extrair os embriões em 14,5 – 19,5 dias post-coitum (dpc) sacrificar as fêmeas grávidas através do deslocamento cervical ou CO2 asfixia, de acordo com as diretrizes IACUC. Nota: Para os ovários de 1 – 5 dia pós-natal, pule para a etapa 1.3. A Figura 1 resume as fases de prófase meiótica enriquecidas em diferentes idades embrionárias e pós-natal.</li>
	<li>Abra a cavidade abdominopelvic usando uma tesoura esterilizada, fazendo uma abertura em forma de V. Dissecar para fora o corno uterino materno, separar os embriões da placenta e transferir os embriões em 35mm placas de Petri contendo 3 mL de pré-aquecido 1x salino de tampão fosfato (PBS) a 37 ° C. Nota: Uma incubadora fliptop definir a 37 ° C pode ser usada para manter a temperatura. Além disso, um estágio de vidro temperatura regulada também pode ser usado para manter a temperatura durante a manipulação do ovário.</li>
	<li>Com uma tesoura cirúrgica de 3,5 polegadas, sacrifica embriões ou filhotes através de decapitação de acordo com as diretrizes IACUC. Coloque embriões decapitados ou filhotes em PBS pré-aquecido antes da dissecação mais.</li>
	<li>Dissecar um embrião ou filhote de cada vez em um prato de petri 35mm separado contendo 3 mL de PBS pré-aquecido a 37 ° C. Prossiga por corte ao longo da linha mediana ventral da parte posterior do embrião, ao longo da metade anterior abaixo os membros dianteiros e diretamente acima do-patas e cauda, conforme descrito na Figura 2A–B.</li>
	<li>Abra o abdômen com uma tesoura cirúrgica de 3,5 polegadas. Usando pinças de ponta fina deslocar ou remover o fígado e loops de intestino, expondo os ovários em um prato de petri 35mm nova contendo 3 mL de PBS pré-aquecido a 37 ° C (consulte guia Figura 2B). Os ovários estão localizados imediatamente abaixo e atrás do rim em direção à parede posterior da cavidade peritoneal (Fig. 2B-C). Um guia para a diferenciação entre machos e fêmeas gônadas é fornecido na Figura 2D. Nota: Para condições ideais, rapidamente disse para fora dos ovários após a fêmea grávida é sacrificada.</li>
	<li>Remover os dois ovários de cada feto feminino usando um par de pinças de ponta fina sob um escopo de dissecação e coloque em vidros de um relógio ou poços separados de um poço multi placa contendo 0,5 a 1,0 mL de PBS pré-aquecido e mantêm a 37 ° C.</li>
	<li>Coloque cada par de ovários em 0,5 mL hipo-solução tampão (17mm citrato trissódico dihidratado, sacarose 50 mM, 5 mM EDTA, 0.5 mM DTT, 30 mM Tris-HCl, inibidor de protease, pH 8,2) em um vidro de relógio limpo ou um pequeno poço de uma placa de 9-bem, certificando-se de imergir o comp de ovários activaçã. Incube durante pelo menos 15 minutos, mas não mais de 30 min. Nota: Fazer hipo-solução tampão fresco e usar até 2 horas após a adição de TDT.</li>
	<li>Durante a incubação, usando uma barreira hidrofóbica PAP caneta, desenhe dois quadrados de2 22 x 22 mm em um vidro limpo 25 x 75 mm2, 1mm espessura de microscópio como mostrado na Figura 3A. Nota: Os Slides podem ser preparados antes do tempo.</li>
	<li>Pipetar 45 a 50 µ l de sacarose 100 mM numa lâmina limpa e um par de ovários de transferência para a gota.</li>
	<li>Usando as extremidades afiadas de duas agulhas 27 G, arreliar os ovários separados para liberar as células para a solução de sacarose. Com a pinça, Retire pedaços grandes de ovário e pipetar cuidadosamente a solução de sacarose para dispersar as células.</li>
	<li>Lugar de 40 µ l de solução fixador (1% paraformaldeído (PFA), 0,2% de detergente (veja Tabela de materiais), pH 9,2) em cada quadrado do slide preparado. Com uma ponta de pipeta 200 µ l, espalhe a solução fixador uniformemente sobre a superfície do slide.</li>
	<li>Pipete 20 µ l da mistura de sacarose para cada Praça do slide contendo o fixador. Observação: Isso equivale a usar um par de ovários por slide.</li>
	<li>Incube os slides em uma câmara fechada e úmido durante a noite em temperatura ambiente. Nota: A incubação durante a noite pode variar em torno de (12-15 hrs) à temperatura ambiente.</li>
	<li>Abra a tampa da câmara e permitir que os slides secar completamente.</li>
	<li>Lave os slides em uma jarra de Coplin contendo 50 mL de solução de PBS agente umectante 0,4% (ver Tabela de materiais) por 2 min, secar ao ar e proceder ao protocolo encontrava (etapa 6). Nota: Pode ser possível armazenar as lâminas a-80 ° C para uso posterior, mas isso varia dependendo da proteína de interesse. Para obter melhores resultados imediatamente no protocolo encontrava (etapa 6).</li>
</ol>2. metáfase eu oócito coleção
<ol><li>Para maximizar o número de folículos antrais isoladas de cada mouse, intraperitonealmente injete camundongos fêmeas virgens sexualmente maduros com 5 UI de gonadotrofina de soro de égua grávida (PMSG, também conhecido como equinos gonadotrofina coriônica (eCG)). Nota: Para o rendimento ideal do oócito, ratos devem ser 1 a 3 meses de idade, como o número de oócitos colhidos irá diminuir com a idade. Para preparar a PMSG, dissolver garrafa de 5.000 UI em 100 mL de PBS estéril (5ml de U/0.1) loja alíquotas de uso único de 600 µ l a-20 ° C.</li>
	<li>Depois de 44 – 48 h, prepare o suporte de coleção, mínimo essencial médio alfa (MEMα) suplementado com 5% de soro fetal bovino (FBS) e 3 mg/mL albumina de soro bovino (BSA; MEMΑ/BSA/FBS). Esterilize a mídia através de um filtro de poro de 0,2 µm. Decante a 2,5 mL de MEMα/BSA/FBS médio em um prato de vidro por rato e aquecido a 37 ° C numa incubadora 5% CO2 . Nota: Outros coleção e meios de cultura que estão comercialmente disponíveis (M2 e M16) também são comumente usados. Atenção: Recomendamos retirar pratos de cultura 5% CO2 incubadora uma em uma hora de duração limitada minimizar a exposição de ar ambiente durante as etapas de manipulação.</li>
	<li>Sacrifica os ratos através do deslocamento cervical ou CO2 asfixia, de acordo com as diretrizes IACUC.</li>
	<li>Abra a cavidade abdominopelvic com uma tesoura esterilizada, fazendo uma abertura em forma de V. Usando fórceps, deslocar os intestinos na direcção da cabeça do rato. Localize cada corno uterino; os ovários são apresentar proximal para a caixa torácica. Segure o oviduto com pinça fina e cortar a gordura superior para o ovário usando tesouras de dissecação (Figura 4). Continue a segurar o oviduto e com outro conjunto de pinças bem libertar o ovário da bursa e coloque no prato de coleção contendo meio de MEMα/BSA/FBS. Nota: Como na etapa 1, é imperativo a manter os ovários a 37 ° C e em 5% CO2. Uma incubadora de fliptop ligada a 5% CO2 mistura pode ser usada para permitir a manutenção ideal de temperatura e os níveis de CO2 . Além disso, um estágio de vidro temperatura regulada também deve ser usado para manter a temperatura durante a manipulação do oócito.</li>
	<li>Utilizando uma seringa de 1 mL com agulha de calibre 27 (ou tamanho similar), liberar complexos de cumulus oócito por punção manualmente os grandes folículos antrais.</li>
	<li>Observando-se através de um microscópio de dissecação, recolha ovócitos GV-encenado utilizando uma pipeta de vidro boca-operado ou capilar ou uma manual micrômetro-seringa (Figura 5). Apenas recolha ovócitos que são liberados de folículos antrais. Ovócitos GV tem um diâmetro de aproximadamente 90 µm. ovócitos GV pode ser rodeados por 2-3 camadas de células da granulosa e ter um diâmetro total de cerca de 200 µm.</li>
	<li>Cultura de oócitos em um vidro de relógio limpo ou uma placa de 9 contendo meio de FBS/MEMα/BSA para 6 h chegar a metáfase eu a 37 ° C numa incubadora 5% CO2 .</li>
	<li>Prossiga para a etapa 4.</li>
</ol>3. metáfase II (MII) oócito coleção
<ol><li>Para maximizar os oócitos isolados de cada mouse, intraperitonealmente injete camundongos fêmeas virgens sexualmente maduros com 5 IU de PMSG. Depois de 44 – 48 h, injete intraperitonealmente com 5 UI de gonadotrofina coriônica humana (hCG). Nota: Para o rendimento ideal do oócito, ratos devem ser 1 a 3 meses de idade, como o número de oócitos colhidos irá diminuir com a idade. Para preparar o hCG, dissolver uma garrafa de 10.000 U em 200 mL de PBS (5ml de U/0.1). Armazenar em alíquotas de uso único de 600 µ l a-20 ° C.</li>
	<li>Após 12-14 hrs, prepare o suporte de coleção de MEMα/BSA/FBS, conforme descrito no passo 2.2, acima.</li>
	<li>Sacrifica os ratos através do deslocamento cervical ou CO2 asfixia, de acordo com as diretrizes IACUC.</li>
	<li>Abra a cavidade abdominopelvic com uma tesoura esterilizada, fazendo uma abertura em forma de V. Usando fórceps, deslocar os intestinos na direcção da cabeça do rato. Localize cada corno uterino, os ovários estão presentes proximal para a caixa torácica. Segure o oviduto com pinça fina e cortar a gordura superior para o ovário usando tesouras de dissecação (Figura 4). Em seguida, remover o ovário e o oviduto e coloque no prato de coleção contendo meio de MEMα/BSA/FBS. Nota: Como nas etapas 1 e 2, é imperativo a manter os ovários a 37 ° C e em 5% CO2. Uma incubadora de fliptop ligada a 5% CO2 mistura pode ser usada para permitir a manutenção ideal de temperatura e os níveis de CO2 . Além disso, um estágio de vidro temperatura regulada também deve ser usado para manter a temperatura durante a manipulação do oócito.</li>
	<li>Usando uma seringa de 1 mL com um 27 G (ou tamanho similar) ou fórceps em ponto, abrir um buraco da ampola do oviduto para liberar os oócitos MII. Nota: Tenha cuidado para não danificar os oócitos na ampola. A ampola aparecerá inchadas e translúcido, tal que os oócitos são visíveis (Figura 4).</li>
	<li>Colheita MII oócitos da ampola do oviduto para uma nova placa com meio de coleção usando uma pipeta de vidro boca-operado ou capilar ou uma manual micrômetro-seringa (Figura 5).</li>
	<li>Prossiga para a etapa 4.</li>
</ol>4. oócito desnudamento e remoção da Zona pelúcida
<ol><li>Prepare 300 UI/mL de hialuronidase em meio MEMα suplementado com 3 mg/mL BSA para DDE oócitos de em torno de células do cumulus (2.5 mL/mouse) em um vidro de relógio e manter a 37 ° C, 5% de CO2. Nota: Eficácia de hialuronidase diminui acentuadamente após 1h de preparação. Para oócitos MII, hialuronidase tratamento não é necessário.</li>
	<li>Expor a complexos de célula cumulus-oócito a 300 UI/mL de hialuronidase em MEMα/BSA para 3 min para DDE oócitos de em torno de células do cumulus. Cuidado: Não exceda 3 min exposição a hialuronidase, que danificará os ovócitos.</li>
	<li>Para lavar os oócitos, transferência de oócitos para um fresco aquecido prato médio MEMα/BSA. Usando uma pipeta de vidro pequena boca-operado ou capilar (um pouco maior que o diâmetro do ovócito, que é aproximadamente 90 µm), pipetar os complexos acima e para baixo para separar completamente as células do cumulus. Permitir que os oócitos recuperar na incubadora, enquanto se prepara para a próxima etapa.</li>
	<li>Aquecer a solução do ácido Tyrode, MEMα/BSA e mídia do Waymouth a 37 ° C (500 µ l/mouse). Lugar de 300 µ l em cada poço de placas de vidro 9-bem pequeno.</li>
	<li>Para remover a zona pelúcida (ZP) transferi oócitos de 5 – 10 para solução de Tyrode. Expor os oócitos para apenas 30-45 s para a solução. Nota: Muito pouca exposição à solução não irá remover o ZP completamente, que impedirá os oócitos estourando e cromossomos de espalhar. Demasiada exposição irá danificar e matar o oócito. Assistindo o dissolver ZP sob o microscópio de dissecação pode auxiliar na otimização do tempo de exposição. Cuidado: Usando a solução de Tyrode fresco é fundamental, como sua função declina com a idade. Uso um bem fresco de solução de Tyrode para cada grupo de oócitos tratados para garantir a digestão uniforme da ZP.</li>
	<li>Imediatamente após a remoção de ZP, lave os oócitos pela transferência para aquecido médio MEMα/BSA/FBS. Repita essa etapa de lavagem. Nota: Tenha cuidado ao transferir, como oócitos facilmente vão ficar juntos e a pipeta de vidro ou remoção seguinte capilar da ZP. Pre-molhando a pipeta de vidro ou capilar em meio do Waymouth minimizará oócitos coladas.</li>
	<li>Transferência e permitir que os oócitos recuperar durante 30 minutos no meio do Waymouth a 37 ° C numa incubadora 5% CO2 .</li>
	<li>Prossiga para a etapa 5.</li>
</ol>5. MI e MII oócito cromatina Spreads
<ol><li>Usando uma caneta PAP, desenhe um retângulo de2 de 11 x 44 mm sobre a lâmina de vidro, como mostrado na figura 6A.</li>
	<li>Revestir o slide com uma fina camada de fixador (1% paraformaldeído, 0,2% Triton-X100 em H2O, pH 9,2) por Pipetar 100 µ l de fixador para o slide e balançando o slide e para trás. Toque o slide para se livrar do excesso fixador.</li>
	<li>Buscar entre 5-10 ovócitos com uma agulha de pipeta de boca pequena com como pouco mídia quanto possível e arraste a agulha em linha através do slide fixador-revestido enquanto depositando os oócitos de 1 cm acima do slide na solução de fixador. Execute esta etapa usando um microscópio de dissecação para garantir que os oócitos foram depositados e que eles tem estourado. Nota: Os oócitos devem estourar imediatamente no slide. A altura em que os oócitos são depositados impacto o grau da cromatina se espalhando. Ver resultados representativos na Figura 6 para mais detalhes.</li>
	<li>Incube à temperatura ambiente em uma câmara fechada umidificada durante a noite para permitir que a cromatina aderir.</li>
	<li>Permitir que os slides secar completamente e enxágue slides em uma jarra de Coplin contendo 50 mL de 0,4% agente umectante-H2O, pH 8.0.</li>
	<li>Prossiga para a etapa 6.</li>
</ol>6. encontrava
<ol><li>Prepare o tampão de diluição de anticorpo (ADB) descrito na tabela 1.</li>
	<li>Preparar duas Coplin frascos contendo 50 mL de solução-tampão (WB) lavagem (10% ADB diluído em PBS) e uma jarra de Coplin contendo solução de detergente WB e 0,05% 50 mL (por exemplo, adicionar 250 µ l de 10% de detergente para 50ml WB).</li>
	<li>Lave os slides que foram preparados em seção 1 e 5 do presente protocolo por 10 min em uma jarra de Coplin contendo 50 mL de WB. Atenção: Não seque os slides em qualquer ponto durante a encontrava.</li>
	<li>Lave os slides para 10 min no Coplin frasco contendo 50 mL WB e 0,05% de solução de detergente. Em seguida, lave os slides no restante Coplin frasco contendo 50 mL de solução de WB por 10 min.</li>
	<li>Toque fora slide excesso de líquido e a tampa com 100 µ l de anticorpos primários selecionados diluído em ADB. Incube a 4 ° C durante a noite em uma câmara fechada e úmida. Nota: A incubação pode ser encurtada para 2 a 3 horas a 37 ° C. Utilize volumes menores de anticorpo (por exemplo, 50 µ l), cobrindo o slide com uma lamela ou parafilm.</li>
	<li>Lave os slides em uma jarra de Coplin contendo 50 mL de solução de 0,2% agente umectante-PBS, pH 8.0.</li>
	<li>Repita as etapas de 6,2 a 6,5.</li>
	<li>Toque fora slide excesso de líquido e a tampa com 100 µ l de anticorpos secundários selecionados diluído em ADB. Incubar 1 a 2 horas a 37 ° C em uma câmara fechada e úmida.</li>
	<li>Lave slides 2 vezes por 10 min em Coplin frascos contendo 50 mL de solução de 0,2% agente umectante-PBS, pH 8.0.</li>
	<li>Lave slides 2 vezes por 5 min em Coplin frascos contendo 50 mL de solução de 0,2% agente umectante-H2O, pH 8.0.</li>
</ol>7. montagem slides
<ol><li>Para prófase cromatina se espalha preparada no passo 2, adicionar 100 µ l de meio de montagem, contendo 4' 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 1.5µg / mL). Para MI e MII cromatina se espalha preparado no passo 5, adicionar 50 µ l de meio de montagem contendo DAPI (1.5µg / mL). Delicadamente borre fora excesso de líquido.</li>
	<li>Coloque uma lamela de 22 x 60 mm na parte superior e selar com esmaltes claros. Armazenar em uma caixa de slides em 4 ° C ou a-20 ° C até avaliação através de microscopia de fluorescência. Nota: Toque levemente no deslizamento da tampa para livrar-se de meio de montagem em excesso antes de vedação com esmalte.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Morelli, M. A., Cohen, P. 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P., Hached, K., Wassmann, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+spreads+with+centromere+staining+in+mouse+oocytes.">Chromosome spreads with centromere staining in mouse oocytes.</a> Methods Mol Biol. 957 (1), 203-212 (2013).</li><li>Stein, P., Schindler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+oocyte+microinjection,+maturation+and+ploidy+assessment.">Mouse oocyte microinjection, maturation and ploidy assessment.</a> J Vis Exp. (53), (2011).</li></ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Preparações de propagação de cromatina permitem aos pesquisadores estudar cronologicamente fêmea mamífera meiose e a localização dinâmica das proteínas envolvidas. Os spreads de cromatina embrionário e neonatal permitem a análise detalhada dos eventos durante a prófase meiótica. Metáfase I e metáfase II propagações de cromatina podem ser usadas para distinguir a única irmã cromátides irmãs de emparelhado irmãs e cromossomos homólogos emparelhados, bem como avaliar a ploidia. Em comparação, o pro...

Durante a espermatogênese, grandes ondas semisíncronas de meiose células germinativas são uma reposta rápida e continuamente, no testículo no início da puberdade e ao longo da vida adulta1. Em contraste com os machos, meiose em fêmeas é iniciada somente durante o desenvolvimento fetal. Após o nascimento, oócitos permanecem presos em um estágio de Dictióteno prolongada da prófase I com uma intacta vesícula germinal (GV; envelope nuclear) até a puberdade. No início da puberdade, um subconjunto de ovócitos ciclicamente são selecionados para sofrer o crescimento e maturação, marcando o início da retomada meiótica. Meiótica retomada em oócitos já crescidos manifesta-se pelo desaparecimento do GV em um processo conhecido como vesícula germinal avaria (GVBD). O oócito então sofre condensação cromossomo e segregação, seguido por extrusão de corpo polar. Oócitos tornar-se preso em cima de progressão para MII e são estimulados para completar a segunda e última divisão meiótica somente após a fertilização.
Fertilidade feminina é altamente dependente do sucesso da prófase meiótica eu progressão. Chave para isso é a formação de uma ligação física entre cromossomos homólogos, conhecido como o chiasmata, que é mediada pela reparação de quebras da cadeia dupla induzidas DNA (DSBs) através de de recombinação de cruzamento2. Este processo ocorre dentro do contexto de um andaime ricos em proteínas dinâmico, conhecido como o complexo de synaptonemáticos (SC) que se forma entre os cromossomos homólogos para facilitar sua sinapse3. A SC é uma estrutura tripartida do zipper-como que consiste de dois elementos laterais paralelos conectados por proteínas da região central que detém homologs juntos ao longo de reparo de ADN em curso. Antes da sinapse, precursores dos elementos laterais, chamados de elementos de axiais, formam-se entre irmã cromátides irmãs. Synaptonemáticos complexo proteínas tais como SYCP2 e SYCP3 formam elementos axiais que colocalize para os eixos de coesão cromátide-irmã durante a prófase inicial. Estes mais tarde serve como ligação locais para a proteína de filamento transversal, SYCP1, o que facilita a montagem do elemento central e sinapse entre homologs alinhado4. Em oócitos de rato, synapsis completa é indicado pela presença de 20 completamente sobreposição de trechos de SYCP3 e SYCP1, que podem ser visualizados usando cromatina espalhar os preparativos. Sinapse é concluído com a entrada no subestágio paquíteno, segundo o qual os crossovers maduros que estão destinados a chiasmata forma entre homologs estão decorados com mutL dímeros de homólogo (MLH1/3) para promover sua transformação precisos5,6 , 7. a manutenção estrutural dos complexos de cromossomos (SMC), incluindo cohesin, nÃ e o SMC5/6 complexos, são importantes para a regulação da dinâmica do cromossomo e estrutura em toda a meiose8,9, 10,11,12. Coletivamente, esses eventos garantir bi-orientação correta dos cromossomos homólogos para opostas polos do eixo após a desmontagem do SC.
O ciclo celular meiótico é um poderoso modelo para examinar os papéis de várias proteínas na manutenção do genoma devido a indução programada e subsequente reparação de DNA DSBs. Além disso, a meiose mamíferos é também um modelo relevante para o estudo das alterações epigenéticas e imprinting genômico13. No entanto, é tecnicamente difícil de avaliar esses eventos durante a meiose feminina, que terá lugar nos ovários fetais e Neonatais em mamíferos (Figura 1). Prófase, que pode ser dividida em 5 substages: leptonema, zygonema, pachynema, diplonema e Dictióteno. Aqui, descrevemos como isolar e distinguir entre fetais e Neonatais ovários e testículos (Figura 2). Adaptado de métodos anteriormente descritos, este manuscrito também descreve um protocolo (etapa 1), com vídeo de demonstração para a preparação da prófase meiótica feminino eu cromatina espalha14,15,16,17 . Quando acoplado com encontrava, como descrito nos passos 6-7, este protocolo permite análise microscópica detalhada da prófase eu eventos em oócitos.
A ovogênese é propenso a erros e eventos de missegregation do cromossomo durante a primeira divisão meiótica representam a fonte mais comum de doença genética na descendência18,19. Este manuscrito (etapa 2 do protocolo), descrevemos um protocolo no qual oócitos maduros GV-encenado são extraídos aprontados ovários de camundongos fêmeas adultos. Sob condições de apoia, já crescidos oócitos submeter-se independente de hormônio luteinizante retomada da meiose após isolamento e cultura20. Após retomada meiótica, oócitos progridem através da meiose, em seguida, prendam na metáfase II. Oócitos permanecem presos em metáfase II, a não ser fertilizado. Nas etapas 2 a 5, adaptamo-nos protocolos anteriormente relatados com vídeo de demonstração para descrever como coletar, cultura e preparar MI e MII oócitos por cromatina espalhar preparações21. Esta cromatina espalhando técnica permite encontrava clara de proteínas associadas com cromossomos. Além disso, esse protocolo também pode ser usado para distinguir entre cromossomos bivalentes e univalentes e ainda mais pode resolver a única irmã cromátides irmãs para facilitar a avaliação da ploidia de ovócitos. Portanto, além de revelar os padrões de localização de proteínas meióticas, esse protocolo também pode servir como uma ferramenta inestimável para elucidar as causas potenciais de missegregation do cromossomo durante MI e MII.

<table><tbody><tr><td>10X Phosphate buffered saline (PBS) pH 7.4</td><td>Quality Biological</td><td>119-069-161</td><td></td></tr><tr><td>60 mm x 15 mm petri dishes</td><td>Denville</td><td>T1106</td><td></td></tr><tr><td>35mm x 12mm petri dishes</td><td>Denville</td><td>T1103</td><td></td></tr><tr><td>Fine forceps</td><td>VWR</td><td>300-050</td><td></td></tr><tr><td>Micro dissection scissors</td><td>Ted Pella</td><td>1340</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting&amp;nbsp;scissors, sharp tip, 41/2&quot;</td><td>VWR</td><td>82027-578</td><td></td></tr><tr><td>Watch glass square 1 5/8</td><td>Carolina Biological Supply Company</td><td>742300</td><td>Autoclave before each use</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma</td><td>S8501</td><td></td></tr><tr><td>Trisodium Citrate Dihydrate</td><td>Sigma</td><td>S1804</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>1,4-Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma</td><td>646563</td><td>Add to hypotonic buffer immediately before use</td></tr><tr><td>50x Protease Inhibitor</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td>Add to hypotonic buffer immediately before use</td></tr><tr><td>Turberculin syringe with needle (1cc, 27 G x 1/2 in)</td><td>Becton, Dickinson (BD)</td><td>309623</td><td></td></tr><tr><td>Gold seal ultra frost glass slides (25X75mm, 1mm thick)</td><td>Thermo</td><td>3063-002</td><td></td></tr><tr><td>Super PAP pen, large (liquid blocker)</td><td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td><td>71310</td><td></td></tr><tr><td>16% Paraformaldehyde aqueous</td><td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td>Detergent in manuscript</td></tr><tr><td>Immuno stain moisture chamber</td><td>Evergreen</td><td>240-9020-Z10</td><td></td></tr><tr><td>Coplin jars</td><td>Fisher</td><td>08-815</td><td></td></tr><tr><td>Photo-flo 200</td><td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td><td>74257</td><td>Wetting agent in manuscript</td></tr><tr><td>Pregnant mare serum gonadotropin (PMSG)</td><td>Sigma</td><td>G4877</td><td>Store aliquots at -20C</td></tr><tr><td>Human chorionic gonadotropin (HCG)</td><td>Sigma</td><td>C0434</td><td>Store aliquots at -20C</td></tr><tr><td>PYREX Spot Plates with nine concave cavities</td><td>Fisher</td><td>13-748B</td><td>Autoclave before each use</td></tr><tr><td>Glass capillary</td><td>Fisher</td><td>22260943</td><td>For making oocyte collection needles</td></tr><tr><td>Brand Parafilm M</td><td>Sigma</td><td>BR701501</td><td>For making oocyte collection needles</td></tr><tr><td>Latex rubber tubing (3.2 mm inner diameter x 6.4 mm outer diameter)</td><td>Fisher</td><td>14-178-5B</td><td>For making oocyte collection needles</td></tr><tr><td>Latex rubber tubing (6.4 mm inner diameter x 11.1 mm outer diameter)</td><td>Fisher</td><td>14-178-5D</td><td>For making oocyte collection needles</td></tr><tr><td>Flexible silicone rubber nosepiece, hard plastic mouthpiece and 15 inches of latex tubing</td><td>Sigma</td><td>A5177-5EA</td><td>For making oocyte collection needles</td></tr><tr><td>Mitutoyo micrometer head</td><td>Mituoyo</td><td>150-208</td><td>For making oocyte collection needles</td></tr><tr><td>Syringe 5 mL</td><td>BD Biosciences</td><td>309646</td><td>For making oocyte collection needles</td></tr><tr><td>Syringe filter 0.45 &amp;mu;m filter</td><td>Corning</td><td>431220</td><td>For making oocyte collection needles</td></tr><tr><td>Glass Pasteur Pipette 5 3/4&quot;</td><td>Fisher</td><td>13-678-6A</td><td>For making oocyte collection needles</td></tr><tr><td>83 x 0.5 mm pipette tip</td><td>Denville</td><td>P3080</td><td>For making oocyte collection needles</td></tr><tr><td>&amp;alpha;-MEM</td><td>Invitrogen</td><td>11415049</td><td></td></tr><tr><td>Waymouth&#039;s media</td><td>Life Technologies</td><td>11220035</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Fisher</td><td>A3160602</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A3311</td><td>For oocyte culture media</td></tr><tr><td>500ml filter units 0.22um</td><td>Denville</td><td>F5227</td><td></td></tr><tr><td>Hyaluronidase</td><td>Sigma</td><td>H3506</td><td></td></tr><tr><td>Tyrode&amp;rsquo;s solution</td><td>Sigma</td><td>T1788</td><td>Store aliquots at -20C</td></tr><tr><td>Horse serum</td><td>Sigma</td><td>H-1270</td><td>For ADB/wash buffer</td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A1470</td><td>For ADB/wash buffer</td></tr><tr><td>VECTASHIELD antifade mounting medium with DAPI</td><td>Vector Labs</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Microscope cover slides (22mmx60mm)</td><td>Fisher</td><td>12-544-G</td><td></td></tr><tr><td>Clear nail polish</td><td>Amazon</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Microscopes&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SteREO Discovery.V8</td><td>Zeiss</td><td>495015-0001-000</td><td></td></tr><tr><td>Observer Z1</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Primary Antibodies&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-MLH1</td><td>Life Technologies</td><td>MA5-15431</td><td>Dilution factor- 1:100</td></tr><tr><td>Rabbit anti-SYCP1</td><td>Life Technologies</td><td>PA1-16763</td><td>Dilution factor- 1:1000</td></tr><tr><td>Goat anti-SCP3</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-20845</td><td>Dilution factor- 1:50</td></tr><tr><td>Human anti-centromere protein</td><td>Antibodies Incorporated</td><td>15-235</td><td>Dilution factor- 1:100</td></tr><tr><td>Rabbit anti- TOPOII</td><td>Abcam</td><td>ab109524</td><td>Dilution factor- 1:100</td></tr><tr><td>Mouse anti-Histone H4 (di methyl K20, tri methyl K20)</td><td>Abcam</td><td>ab78517</td><td>Dilution factor- 1:500</td></tr><tr><td>Rabbit anti-Rec8</td><td>Courtesy of Dr. Karen Schindler</td><td>N/A</td><td>Dilution factor- 1:10,000</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Secondary Antibodies&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Donkey anti-goat IgG (H+L) Alexa Fluor 568 conjugate</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>A-11057</td><td>Dilution factor- 1:500</td></tr><tr><td>Donkey anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 488 conjugate</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>A-21202</td><td>Dilution factor- 1:500</td></tr><tr><td>Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 647 conjugate</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>A-31573</td><td>Dilution factor- 1:500</td></tr><tr><td>Goat anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 568 conjugate</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>A-11004</td><td>Dilution factor- 1:500</td></tr><tr><td>Goat anti-Human IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>A-11013</td><td>Dilution factor- 1:500</td></tr><tr><td>Goat anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 568 conjugate</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>A-11011</td><td>Dilution factor- 1:500</td></tr></tbody></table>

chromatin spread preparations for the analysis of mouse oocyte progression from prophase to metaphase ii

Técnicas de propagação de cromatina foram amplamente utilizadas para avaliar a localização dinâmica de várias proteínas durante a gametogênese, particularmente para a espermatogênese. Essas técnicas permitem para visualização dos padrões de localização de DNA e proteína durante eventos meióticos como cromossomos homólogos emparelhamento, synapsis e DNA de reparação. Enquanto alguns protocolos têm sido descritos na literatura, técnicas de propagação de cromatina geral usando oócitos mamíferos prófase são limitadas e difícil devido a hora de início da meiose em ovários fetais. Em comparação, espermatócitos prófase podem ser coletados de ratos machos juvenis com rendimentos mais elevados, sem a necessidade de microdissection. No entanto, é difícil obter uma população sincronizada pura de células em estágios específicos devido à heterogeneidade das populações meiótica e pós meiótica de células germinativas do testículo de jovens e adulto. Para fases posteriores da meiose, é vantajoso para avaliar oócitos passando por meiose I (MI) ou meiose II (MII), porque grupos de oócitos maduros podem ser colhidos em ratos fêmeas adultos e estimulados a retomar a meiose em cultura. Aqui, métodos para preparações de cromatina meiótica espalhar usando oócitos dissecado de fetal, neonatal e adultos ovários são descritos com demonstrações em vídeo de acompanhamento. Eventos de missegregation cromossomo em oócitos mamíferos são frequentes, particularmente durante MI. Estas técnicas podem ser usadas para avaliar e caracterizar os efeitos de mutações diferentes ou exposições ambientais durante várias fases da oogénese. Como existem diferenças distintas entre a ovogênese e espermatogênese, as técnicas descritas dentro são de valor inestimáveis para aumentar nossa compreensão da oogénese mamíferos e as características sexualmente dimórficas de cromossomo e proteína dinâmica durante a meiose .

Descrevemos duas técnicas para visualizar e avaliar os cromossomos meióticos em oócitos. A primeira técnica é servida para avaliar a progressão da prófase em ovários embrionários e Neonatais. Prófase cromatina propagação preparações são incrivelmente valiosas para a visualização de numerosos processos dinâmicos durante a meiose, incluindo cromossomo emparelhamento, synapsis e desynapsis, recombinação homóloga e epigenético cromossomo remodelação. Aqui, temos demons...

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Preparações de propagação de cromatina para análise da progressão de oócitos de camundongos da prófase à metáfase II | Genética | Vídeo

Chromatin Spread Preparations for the Analysis of Mouse Oocyte Progression from Prophase to Metaphase II

Preparações de espalhamento da cromatina para a análise da progressão de prófase para a metáfase II em oócitos de camundongos.

Oogénese nos mamíferos é conhecido por ser propenso a erro, especialmente devido à missegregation do cromossomo. Este manuscrito descreve métodos de preparação de cromatina espalhado para prófase rato, metáfase I e II-encenado oócitos. Estas técnicas fundamentais permitem o estudo de proteínas da cromatina-limite e a morfologia do cromossomo durante a ovogênese mamífera.

Preparações de espalhamento de cromatina para a análise da progressão de oócitos de camundongo da prófase para a metáfase II

Chromatin spread techniques have been widely used to assess the dynamic localization of various proteins during gametogenesis, particularly for ...

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Universidad de Cartagena UDEC

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Biology

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Meiosis

SCIENTISTS IN ACTION

15.3K visualizações.  Johns Hopkins University Bloomberg School of Public Health. Oogénese nos mamíferos é conhecido por ser propenso a erro, especialmente devido à missegregation do cromossomo. Este manuscrito descreve métodos de preparação de cromatina espalhado para prófase rato, metáfase I e II-encenado oócitos. Estas técnicas fundamentais permitem o estudo de proteínas da cromatina-limite e a morfologia do cromossomo durante a ovogênese mamífera.

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Isolation and Characterization of Mouse Antral Oocytes Based on Nucleolar Chromatin Organization

This protocol describes a simple and quick method to isolate and characterize mouse antral GV (Germinal Vesicle) oocytes as able (SN, Surrounded Nucleolus) or unable (NSN, Not Surrounded Nucleolus) to develop to the blastocyst stage after in vitro maturation (IVM) and in vitro fertilization (IVF). It makes use of Hoeschst33342 (or any other DNA intercalating dye) able to bind to the heterochromatin of the nucleolus showing a ring in the SN oocytes or not, like in the NSN oocytes. This represents the easiest and quickest way to sort both antral oocytes that can be eventually used for IVM or IVF procedures. 
Briefly, the protocol consists of the following steps: hormone injection to stimulate follicular growth; isolation of the oocytes at the GV stage from the antral compartment by puncturing the ovary with a sterile needle; preparation of thin glass pipettes for mouth pipetting of the oocytes; sorting of the oocytes with Hoechst33342 prepared at a supravital concentration; IVM, IVF or any other molecular/cellular analysis.
Unfortunately there are still few evidences to sort SN and NSN oocytes using less invasive techniques. If and once they will be identified, they could be potentially applied to human assisted reproductive technologies, although with several aspects that should be modified. To date, this technique has potential implications to dramatically increase IVM and IVF successful procedures in both endangered and species with economic interest.

Here we present a protocol for the characterization of mouse antral oocytes based on nucleolar organization.

Isolamento e Caracterização do mouse Antral Oócitos Baseado em Nucleolar organização da cromatina

This protocol describes a simple and quick method to isolate and characterize mouse antral GV (Germinal Vesicle) oocytes as able (SN, Surrounded ...

Biologia do Desenvolvimento

Using Mouse Oocytes to Assess Human Gene Function During Meiosis I

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively correlated with maternal age, age alone is not always predictive of the risk of generating an aneuploid embryo. Therefore, gene variants might account for incorrect chromosome segregation during oogenesis. Given that access to human oocytes is limited for research purposes, a series of assays were developed to study human gene function during meiosis I using mouse oocytes. First, messenger RNA (mRNA) of the gene and gene variant of interest are microinjected into prophase I-arrested mouse oocytes. After allowing time for expression, oocytes are synchronously released into meiotic maturation to complete meiosis I. By tagging the mRNA with a sequence of a fluorescent reporter, such as green fluorescent protein (Gfp), the localization of the human protein can be assessed in addition to the phenotypic alterations. For example, gain or loss of function can be investigated by establishing experimental conditions that challenge the gene product to fix meiotic errors. Although this system is advantageous in investigating human protein function during oogenesis, adequate interpretation of results should be undertaken given that protein expression is not at endogenous levels and, unless controlled for (i.e. knocked out or down), murine homologs are also present in the system.

As the genetic variants associated with human disease begin to become uncovered, it is becoming increasingly important to develop systems with which to rapidly evaluate the biological significance of those identified variants. This protocol describes methods for evaluating human gene function during female meiosis I using mouse oocytes.

Usando oócitos de camundongo para avaliar a função de genes humanos durante a meiose I

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively ...

Genética

Analysis of Chromosome Segregation, Histone Acetylation, and Spindle Morphology in Horse Oocytes

The field of assisted reproduction has been developed to treat infertility in women, companion animals, and endangered species. In the horse, assisted reproduction also allows for the production of embryos from high performers without interrupting their sports career and contributes to an increase in the number of foals from mares of high genetic value. The present manuscript describes the procedures used for collecting immature and mature oocytes from horse ovaries using ovum pick-up (OPU). These oocytes were then used to investigate the incidence of aneuploidy by adapting a protocol previously developed in mice. Specifically, the chromosomes and the centromeres of metaphase II (MII) oocytes were fluorescently labeled and counted on sequential focal plans after confocal laser microscope scanning. This analysis revealed a higher incidence in the aneuploidy rate when immature oocytes were collected from the follicles and matured in vitro compared to in vivo. Immunostaining for tubulin and the acetylated form of histone four at specific lysine residues also revealed differences in the morphology of the meiotic spindle and in the global pattern of histone acetylation. Finally, the expression of mRNAs coding for histone deacetylases (HDACs) and acetyl-transferases (HATs) was investigated by reverse transcription and quantitative-PCR (q-PCR). No differences in the relative expression of transcripts were observed between in vitro and in vivo matured oocytes. In agreement with a general silencing of the transcriptional activity during oocyte maturation, the analysis of the total transcript amount can only reveal mRNA stability or degradation. Therefore, these findings indicate that other translational and post-translational regulations might be affected.
Overall, the present study describes an experimental approach to morphologically and biochemically characterize the horse oocyte, a cell type that is extremely challenging to study due to low sample availability. However, it can expand our knowledge on the reproductive biology and infertility in monovulatory species.

This manuscript describes an experimental approach to morphologically and biochemically characterize horse oocytes. Specifically, the present work illustrates how to collect immature and mature horse oocytes by ultrasound-guided ovum pick-up (OPU) and how to investigate chromosome segregation, spindle morphology, global histone acetylation, and mRNA expression.

Análise da segregação cromossômica, acetilação de histona e morfologia do fuso em ovócitos de cavalo

The field of assisted reproduction has been developed to treat infertility in women, companion animals, and endangered species. In the horse, assisted ...

Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Zebrafish Spermatocytes

Meiosis is the key cellular process required to create haploid gametes for sexual reproduction. Model organisms have been instrumental in understanding the chromosome events that take place during meiotic prophase, including the pairing, synapsis, and recombination events that ensure proper chromosome segregation. While the mouse has been an important model for understanding the molecular mechanisms underlying these processes, not all meiotic events in this system are analogous to human meiosis. We recently demonstrated the exciting potential of the zebrafish as a model of human spermatogenesis. Here we describe, in detail, our methods to visualize meiotic chromosomes and associated proteins in chromosome spread preparations. These preparations have the advantage of allowing high resolution analysis of chromosome structures. First, we describe the procedure for dissecting testes from adult zebrafish, followed by cell dissociation, lysis, and spreading of the chromosomes. Next, we describe the procedure for detecting the localization of meiotic chromosome proteins, by immunofluorescence detection, and nucleic acid sequences, by fluorescence in situ hybridization (FISH). These techniques comprise a useful set of tools for the cytological analysis of meiotic chromatin architecture in the zebrafish system. Researchers in the zebrafish community should be able to quickly master these techniques and incorporate them into their standard analyses of reproductive function.

Nuclear surface spreads are an indispensable tool for studying chromosome events during meiosis. Here we demonstrate a method to prepare and visualize meiotic chromosomes during prophase I from zebrafish spermatocytes.

Preparação do Cromossomo Meioético Se espalha de espermatocitocitos de zebrafish

Meiosis is the key cellular process required to create haploid gametes for sexual reproduction. Model organisms have been instrumental in understanding ...

Evaluation of the Spindle Assembly Checkpoint Integrity in Mouse Oocytes

Aneuploidy is the leading genetic abnormality causing early miscarriage and pregnancy failure in humans. Most errors in chromosome segregation that give rise to aneuploidy occur during meiosis in oocytes, but why oocyte meiosis is error-prone is still not fully understood. During cell division, cells prevent errors in chromosome segregation by activating the spindle assembly checkpoint (SAC). This control mechanism relies on detecting kinetochore (KT)-microtubule (MT) attachments and sensing tension generated by spindle fibers. When KTs are unattached, the SAC is activated and prevents cell-cycle progression. The SAC is activated first by MPS1 kinase, which triggers the recruitment and formation of the mitotic checkpoint complex (MCC), composed of MAD1, MAD2, BUB3, and BUBR1. Then, the MCC diffuses into the cytoplasm and sequesters CDC20, an anaphase-promoting complex/cyclosome (APC/C) activator. Once KTs become attached to microtubules and chromosomes are aligned at the metaphase plate, the SAC is silenced, CDC20 is released, and the APC/C is activated, triggering the degradation of Cyclin B and Securin, thereby allowing anaphase onset. Compared to somatic cells, the SAC in oocytes is not as effective because cells can undergo anaphase despite having unattached KTs. Understanding why the SAC is more permissive and if this permissiveness is one of the causes of chromosome segregation errors in oocytes still needs further investigation. The present protocol describes the three techniques to comprehensively evaluate SAC integrity in mouse oocytes. These techniques include using nocodazole to depolymerize MTs to evaluate the SAC response, tracking SAC silencing by following the kinetics of Securin destruction, and evaluating the recruitment of MAD2 to KTs by immunofluorescence. Together these techniques probe mechanisms needed to produce healthy eggs by providing a complete evaluation of SAC integrity.

Error in chromosome segregation is a common feature in oocytes. Therefore, studying the spindle assembly checkpoint gives important clues about the mechanisms needed to produce healthy eggs. The present protocol describes three complementary assays to evaluate spindle assembly checkpoint integrity in mouse oocytes.

Avaliação da Integridade do Ponto de Verificação da Montagem do Fuso em Oócitos de Rato

Aneuploidy is the leading genetic abnormality causing early miscarriage and pregnancy failure in humans. Most errors in chromosome segregation that give ...

Mouse Oocyte Microinjection, Maturation and Ploidy Assessment

Mistakes in chromosome segregation lead to aneuploid cells. In somatic cells, aneuploidy is associated with cancer but in gametes, aneuploidy leads to infertility, miscarriages or developmental disorders like Down syndrome. Haploid gametes form through species-specific developmental programs that are coupled to meiosis. The first meiotic division (MI) is unique to meiosis because sister chromatids remain attached while homologous chromosomes are segregated. For reasons not fully understood, this reductional division is prone to errors and is more commonly the source of aneuploidy than errors in meiosis II (MII) or than errors in male meiosis 1,2. 
In mammals, oocytes arrest at prophase of MI with a large, intact germinal vesicle (GV; nucleus) and only resume meiosis when they receive ovulatory cues. Once meiosis resumes, oocytes complete MI and undergo an asymmetric cell division, arresting again at metaphase of MII. Eggs will not complete MII until they are fertilized by sperm. Oocytes also can undergo meiotic maturation using established in vitro culture conditions 3. Because generation of transgenic and gene-targeted mouse mutants is costly and can take long periods of time, manipulation of female gametes in vitro is a more economical and time-saving strategy. 
Here, we describe methods to isolate prophase-arrested oocytes from mice and for microinjection. Any material of choice may be introduced into the oocyte, but because meiotically-competent oocytes are transcriptionally silent 4,5 cRNA, and not DNA, must be injected for ectopic expression studies. To assess ploidy, we describe our conditions for in vitro maturation of oocytes to MII eggs. Historically, chromosome-spreading techniques are used for counting chromosome number 6. This method is technically challenging and is limited to only identifying hyperploidies. Here, we describe a method to determine hypo-and hyperploidies using intact eggs 7-8. This method uses monastrol, a kinesin-5 inhibitor, that collapses the bipolar spindle into a monopolar spindle 9 thus separating chromosomes such that individual kinetochores can readily be detected and counted by using an anti-CREST autoimmune serum. Because this method is performed in intact eggs, chromosomes are not lost due to operator error.

Oocytes are prone to aneuploidy due to errors in chromosome segregation during meiotic maturation. Aneuploid eggs can cause infertility, miscarriages or developmental disorders like Down syndrome. Here, we describe methods to introduce materials of choice into oocytes and methods to study meiotic maturation and assess ploidy.

Avaliação do mouse microinjeção de oócitos, maturação e ploidia

Mistakes in chromosome segregation lead to aneuploid cells.  In somatic cells, aneuploidy is associated with cancer but in gametes, aneuploidy leads to ...

Biologia

A Cell Free Assay to Study Chromatin Decondensation at the End of Mitosis

During the vertebrate cell cycle chromatin undergoes extensive structural and functional changes. Upon mitotic entry, it massively condenses into rod shaped chromosomes which are moved individually by the mitotic spindle apparatus. Mitotic chromatin condensation yields chromosomes compacted fifty-fold denser as in interphase. During exit from mitosis, chromosomes have to re-establish their functional interphase state, which is enclosed by a nuclear envelope and is competent for replication and transcription. The decondensation process is morphologically well described, but in molecular terms poorly understood: We lack knowledge about the underlying molecular events and to a large extent the factors involved as well as their regulation. We describe here a cell-free system that faithfully recapitulates chromatin decondensation in vitro, based on mitotic chromatin clusters purified from synchronized HeLa cells and X. laevis egg extract. Our cell-free system provides an important tool for further molecular characterization of chromatin decondensation and its co-ordination with processes simultaneously occurring during mitotic exit such as nuclear envelope and pore complex re-assembly.

The molecular mechanisms of the decondensation of highly compacted mitotic chromatin are ill-defined. We present a cell-free assay based on mitotic chromatin clusters isolated from HeLa cells and Xenopus laevis egg extract that faithfully reconstitutes the decondensation process in vitro.

A Free Cell Ensaio para estudar Chromatin descondensação no fim da mitose

During the vertebrate cell cycle chromatin undergoes extensive structural and functional changes. Upon mitotic entry, it massively condenses into rod ...

Meiotic Spindle Assessment in Mouse Oocytes by siRNA-mediated Silencing

Errors in chromosome segregation during meiotic division in gametes can lead to aneuploidy that is subsequently transmitted to the embryo upon fertilization. The resulting aneuploidy in developing embryos is recognized as a major cause of pregnancy loss and congenital birth defects such as Down&#8217;s syndrome. Accurate chromosome segregation is critically dependent on the formation of the microtubule spindle apparatus, yet this process remains poorly understood in mammalian oocytes. Intriguingly, meiotic spindle assembly differs from mitosis and is regulated, at least in part, by unique microtubule organizing centers (MTOCs). Assessment of MTOC-associated proteins can provide valuable insight into the regulatory mechanisms that govern meiotic spindle formation and organization. Here, we describe methods to isolate mouse oocytes and deplete MTOC-associated proteins using a siRNA-mediated approach to test function. In addition, we describe oocyte fixation and immunofluorescence analysis conditions to evaluate meiotic spindle formation and organization.

Here, we present a protocol for specific siRNA-mediated mRNA depletion followed by immunofluorescence analysis to evaluate meiotic spindle assembly and organization in mouse oocytes. This protocol is suitable for in vitro depletion of transcripts and functional assessment of different spindle and/or MTOC-associated factors in oocytes.

Meiotic Avaliação de fuso em oócitos mouse por silenciamento mediado por siRNA

Errors in chromosome segregation during meiotic division in gametes can lead to aneuploidy that is subsequently transmitted to the embryo upon ...

Techniques for Imaging Prometaphase and Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes

Chromosome segregation in human oocytes is error prone, resulting in aneuploidy, which is the leading genetic cause of miscarriage and birth defects. The study of chromosome behavior in oocytes from model organisms holds much promise to uncover the molecular basis of the susceptibility of human oocytes to aneuploidy. Drosophila melanogaster is amenable to genetic manipulation, with over 100 years of research, community, and technique development. Visualizing chromosome behavior and spindle assembly in Drosophila oocytes has particular challenges, however, due primarily to the presence of membranes surrounding the oocyte that are impenetrable to antibodies. We describe here protocols for the collection, preparation, and imaging of meiosis I spindle assembly and chromosome behavior in Drosophila oocytes, which allow the molecular dissection of chromosome segregation in this important model organism.

Techniques for Imaging Prometaphase and Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes

We present protocols for the collection, preparation, and imaging of mature Drosophila oocytes. These methods allow the visualization of chromosome behavior and spindle assembly and function during meiosis.

Técnicas de imagem Prometáfase e Metaphase da meiose I em Fixed<em&gt; Drosophila</em&gt; oócitos

Chromosome segregation in human oocytes is error prone, resulting in aneuploidy, which is the leading genetic cause of miscarriage and birth defects. The ...

Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Mouse Spermatocytes

Mammalian meiosis is a dynamic developmental process that occurs in germ cells and can be studied and characterized. Using a method to spread nuclei on the surface of slides (rather than dropping them from a height), we demonstrate an optimized technique on mouse spermatocytes that was first described in 1997. This method is widely used in laboratories to study mammalian meiosis because it yields a plethora of high quality nuclei undergoing substages of prophase I. Seminiferous tubules are first placed in a hypotonic solution to swell spermatocytes. Then spermatocytes are released into a sucrose solution to create a cell suspension, and nuclei are spread onto fixative-soaked glass slides. Following immunostaining, a diversity of proteins germane to meiotic processes can be examined. For example, proteins of the synaptonemal complex, a tripartite structure that connects the chromosome axes/cores of homologs together can be easily visualized. Meiotic recombination proteins, which are involved in repair of DNA double-strand breaks by homologous recombination, can also be immunostained to evaluate progression of prophase I. Here we describe and demonstrate in detail a technique widely used to study mammalian meiosis in spermatocytes from juvenile or adult male mice.

Meiosis is the developmental process by which gametes are formed through a single round of DNA replication and two successive rounds of chromosome segregation. Mammalian meiosis can be examined by utilizing a technique to prepare meiotic chromosome spreads. Here, we demonstrate a method of preparing surface-spread nuclei from mouse spermatocytes.

Preparação de cromossomos se espalha a partir do Mouse espermatócitos

Mammalian meiosis is a dynamic developmental process that occurs in germ cells and can be studied and characterized. Using a method to spread nuclei on ...