Name: using mouse oocytes to assess human gene function during meiosis i
Uploaded: 2018-04-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Mouse Oocytes to Assess Human Gene Function During Meiosis I at JoVE.com

この作品は、アメリカ生殖医学会およびチャールズとラトガーズ大学でヨハンナ ブッシュ記念基金研究助成金によって支えられた、k. s. A.L.N. に NJ の州立大学は、N.I.H. (F31 HD0989597) からの助成金によって支えられました。

1. 分子クローニング
<ol><li>興味の遺伝子のフルレングスのコード配列を取得およびプラスミッドの in vitro転写 (pIVT) ベクトル11。 注: 完全長 cDNA クローンは、さまざまなベンダーから市販されているまたは逆転写ポリメラーゼ連鎖反応 (RT-PCR) を生成することができます。国立生物工学情報 (NCBI) オンライン リソース センターがヌクレオチドから遺伝子のトラン スクリプトのシーケンスを提供し、タグ付きの発現順序 (EST) データベース。蛋白質の容易にするため、可視化と表現のレベル、緑色蛍光タンパク質 (Gfp) の融合または別の適切な蛍光タグの解析クローニング法で必要があります。</li>
	<li>検証済みのクローニング法を使用して、pIVT の複数のクローン作成領域に興味の遺伝子のコーディングのシーケンスを挿入します。分子クローニングの詳細な説明と必要な手順は以前説明した12をされています。 注: 遺伝子融合製品を生成する場合は、クローニングが適切なリーディング ・ フレームであることを確認します。</li>
	<li>グロビンのプライマーを使用して正しい遺伝子挿入、適切なフレームの融合およびポリメラーゼ誘導点突然変異が作成されなかったことを確保するため、構成をシーケンスします。 注: サンガー DNA シークエンス装置が利用できない場合、多くの企業は、低コストの DNA シーケンス オプションを提供します。</li>
	<li>単一のヌクレオチドの多形 (SNPs) または挿入/削除 (オクターリピート) を生成する場合は、DNA を mutagenize します。DNA の変異は、以下手順 1.5 1.7 で説明されます。野生型のコンス トラクターに 1.7 の線形化手順に進みます。</li>
	<li>突然変異誘発のプライマーを設計し、製造元のプロトコルごとの変異の構造を生成する突然変異誘発 PCR の反作用を完了します。Pcr のサイト指示された突然変異誘発は前述の13をされています。さらに、多くの企業は、プロトコルを含むサイト指示された突然変異誘発キットを提供しています。</li>
	<li>人為の DNA を細菌のホストに変換します。分離し、プラスミドを浄化します。 注: 多くの企業は、簡単に分離し、プラスミド DNA を浄化するために使用できるキットを作る。に応じてメーカー プロトコルに従ってください。大腸菌などのグラム陰性細菌株を使用している場合は、エンドトキシンを除去するキットを使用することをお勧めします。</li>
	<li>目的の SNP または塩基の導入を確認する標準のサンガー DNA シーケンスを用いた細菌の形質転換体からの DNA の分離をシーケンスします。</li>
	<li>精製の DNA の単一の制限の酵素の消化力を使用して最終製品をリニア化します。 注: pIVT ベクトルには複数単一酵素プラスミド Addgene 14地図に記載されているサイトをカットが含まれています。</li>
	<li>製品は agarose のゲルの電気泳動による線形であることを確認します。Agarose のゲルの電気泳動の方法論は、定義された14を以前されて。 メモ: すべての残りの手順使用してバリア (フィルター) ピペット ヒントと RNase フリー材料安定かつ高品質な RNA の生産を確保するため。</li>
	<li>検証済みの DNA クリーンアップ プロトコルまたはキットを使用して消化製品を浄化し、30 μ L RNase/DNase 自由な水に溶出します。 注: シリカ マトリックス スピン列ベースのキットは高品質でお勧めは、DNA を精製しました。に応じてメーカー プロトコルに従ってください。</li>
	<li>
体外製造元のプロトコルに続く T7 ポリメラーゼを用いた DNA を転写します。</li>
	<li>浄化し、RNase/DNase 自由水製造元のプロトコルに続くシリカ マトリックス スピン列に基づく核酸精製キットを使用しての 30 μ L の RNA を溶出します。</li>
	<li>変性アガロース電気泳動ホルムアルデヒドを使用して最終的な RNA 製品サイズを確認するを実行します。1.13 1.22 手順14を参照してください。(図 1)。</li>
	<li>水、溶解するまで 72 mL に 1 g アガロースを加熱してゲルを準備し、60 ° C に冷却</li>
	<li>10 X モップ 0.4 M モップ (pH 7.0)、0.1 M 酢酸ナトリウム、0.01 M EDTA を追加して連続したバッファーを準備します。</li>
	<li>10 X モップ冷却アガロース溶液をバッファー、および 37% ホルムアルデヒド (12.3 M) の 18 mL を実行しての 10 mL を追加します。</li>
	<li>カースト ゲル ゲル化コンテナーにアガロース溶液を注ぐことによって。10 μ L を収容できる大きさのくしを使用します。後ゲルを設定している、触れること会社、櫛を慎重に取り外します。</li>
	<li>ゲル電気泳動槽をアセンブルし、十分な 1 X モップ連続したバッファー、ゲルが完全に覆われていることを確認を追加します。</li>
	<li>RNA のサンプルを準備するには、ホルムアルデヒドを含むローディングの染料の 0.5 X ボリュームに RNA の 1 μ g を追加します。</li>
	<li>エチジウム ブロマイドを 10 μ G/ml の濃度で RNA ソリューションに追加します。</li>
	<li>70 ° C、5 分の RNA 試料溶液を変化させなさい。</li>
	<li>滅菌を使用して、10 の μ L フィルターのヒントについては、ロードの分子量マーカー 5 μ L、5 μ L の RNA のゲルの別の井戸に試料や、色素がゲルの長さの少なくとも 3 分の 2 を移行まで 5 V/cm で electrophorese。</li>
	<li>UV トランス照明のゲルで RNA を視覚化します。RNA は、分子量マーカーを比較することによって適切なサイズを確認します。</li>
	<li>濃度と RNA の純度を測定するには、紫外線分光光度計の上で滅菌 10 μ L フィルター チップを使用して浄化された RNA の 1.2 μ L を転送します。 高品質の RNA には A260/280 (1.8 2.2) ・ 260/230 の吸光度比は (> 1.7) それぞれ。</li>
	<li>滅菌 0.5 μ L 遠沈管 (3-5 μ L/チューブ) に 10 μ L フィルター ヒント、因数の残りの浄化された RNA を使用してください。マイクロインジェクションの準備ができるまで-80 ° c チューブを格納します。 注: 500 ng/μ L の最終注入濃度は最適な出発点です。1:2 で RNase フリー H20 マイクロインジェクション マイクロインジェクション ピペットで RNA の粘着性を減らすために前に RNA を希釈することをお勧めします。</li>
</ol>2 動原体微小管添付ファイルの分析
<ol><li>卵母細胞をマイクロインジェクションの等しいグループに分割します。 注: 採卵、転送、マイクロインジェクション、成熟の詳細に説明されてゼウスで以前15。</li>
	<li>実験的 mRNA に 1 つのグループと WT コントロールと PBS またはGfpとその他のグループを microinject mRNA。 注: 500 ng/μ L は10で始まるに推奨される注入濃度です。注入量を制御するために picoinjector を使用できます。5-10 pL の注入量は15をお勧め。</li>
	<li>胚品質鉱物油で卵 (100-150 μ m)、シャーレでの培養液のミルリノン無料 100 μ L ドロップに転送卵子の直径より大きいカバーの手またはガラス ピペットのオープニング式分注装置は少し口を使用して卵母細胞の減数分裂中期に十分な成熟を許可する 5% C02の 37 ° C で 7 時間孵化させなさいと私 (私に会った) 15。</li>
	<li>上記のように、同じピペット装置を用いた培養後転送中古冷蔵最低限不可欠なメディア (MEM) コレクション中よくセンターの 700 μ L と 500 μ L H20 外リングを含むセンターよく器官培養皿に卵と場所は 7 分間氷の上の皿。 注: 事前 MEM メディアをリラックスして卵子の治療前に少なくとも 20 分-20 ° C で臓器の培養皿でセンターもそれをお勧めします。</li>
	<li>室温で 20 分間 1x PBS で 2% パラホルムアルデヒドの 400 μ L を含む透明なガラス スポット プレートのウェルにピペットの装置を使用してそれらを移すことによって卵子を修正します。</li>
	<li>同じを使用して装置のピペット、400 μ L ブロッキング液 (PBS + 0.3 %bsa + 0.01% Tween 20 + 0.02% ナン3) とストアを含むスポット プレートに別のウェルに卵子を転送免疫染色を処理する準備ができるまで 4 ° c。 注: の 4 ° C、カバーガラス スポット板パラフィルム蒸発を防ぐために、卵を保存します。</li>
	<li>同じピペットなどの器具を使用して、スポットの新しい井戸に転送を卵母細胞含んでいる 400 μ L 透過ソリューション (PBS + 0.3 %bsa + 0.1% TritonX 100 + 0.02% ナン3) をプレートし、3 つを素早く転送卵子で 20 分間室温でインキュベート滴 400 μ L の任意の残留洗剤を削除する解決を妨げます。 注: 9 も透明なガラス スポット プレートは単一の皿 (ステップ 2.4 2.5) 複数の治療を通じてグループを移動に適しています。</li>
	<li>室温で光から保護加湿チャンバーで残りの各種手順を実行します。中型のプラスチック容器の使用は、湿気があるペーパー タオルとアルミ箔でカバーが並んでいます。</li>
	<li>卵母細胞を 30 μ L ピペット装置を使用して、転送 96 ウェル プレートと 10 分加湿チャンバ内の場所の蓋の解決を妨げます。 注: 滴板に円形のインデントに配置されます。</li>
	<li>セントロメアとスピンドル、ピペットなどの器具を使用してラベルを付け、卵を 30 μ に転送する (ACA、クレスト) 抗セントロメア抗原を含む溶液をブロック (1:30) と抗アセチル化チューブリン (1: 1000) し、少なくとも 1 時間インキュベートします。</li>
	<li>10 分解決を妨げる 3 つの 30 μ L 滴を介して転送することによって卵子をすすいでください。</li>
	<li>ピペット装置、転送卵子を用いて 30 μ L にブロッキング溶液で二次抗体抗体 (抗ひと IgG 1: 200、1: 200 抗マウス IgG) 上で使用する無料のドロップし、1 時間孵化させなさい。</li>
	<li>3、30 μ L の 10 分洗浄手順を繰り返します手順 2.11 で説明したソリューションをブロックします。</li>
	<li>3-5 μ L 中含む DAPI をマウントにピペットの装置を使用して、卵を転送 (5.9 μ g/μ L) ガラス顕微鏡スライドの上。</li>
	<li>卵母細胞の破砕を防ぐためカバー スリップのコーナーにワセリンの 4 小滴 (ピンの頭のサイズ) を配置します。</li>
	<li>ダウン スライドにカバー スリップ石油ゼリー側をそっと置きます。</li>
	<li>シールの coverslip のエッジ マニキュアをオフにし 5 分間乾かします。</li>
	<li>共焦点顕微鏡による処理まで、光から保護されて、4 ° C でスライドを保存します。 注: は、取り付け中、coverslip、マッチの屈折を利用されている顕微鏡の対物レンズを確認します。材料は以前されている推奨の取り付けは、 15をについて説明します。</li>
	<li>画像の小さなステップをキャプチャ、共焦点顕微鏡による 40 63 × 対物卵母細胞 (≤ 1 μ m) 作業目的とイメージ中期スピンドルの地域全体の最適化された z 平面で。 注: 2.11 のステップで使用される特定の二次抗体に基づくすべての 3 チャンネルのイメージを確認します。≥ 4 と 3 のズーム画像は十分な解像度に最適です。1 μ m のステップ サイズは、微小管と体マウス卵母細胞で明確に可視化を提供します。イメージをキャプチャするための手順は、顕微鏡から異なります。顕微鏡設定の構成方法の手順については特定メーカー共焦点のユーザーズ ガイドを参照してください。</li>
	<li>次の以下の手順による 2.21 2.23 イメージング ソフトウェアを使用して動原体微小管の添付の状態を識別します。 注: 次の手順説明画像 J (NIH) 無料ダウンロード可能なソフトウェアを使用してこの手順は、ただし、代替のイメージング ソフトウェアを使用できます。されていた種類の添付の状態は、 16を定義されています。</li>
	<li>画像 J ツール バーにファイルをドラッグすると、画像を開く。</li>
	<li>開設の z シリーズを全チャンネル表示 (DNA、動原体、及びスピンドル) [サブ] タブで「色」「チャンネル統合を」、「イメージ」のドロップ ダウン メニューで利用可能なをクリックして。</li>
	<li>切り替えを使用すると、画像の下部に、各 z スライスを移動し、動原体微小管添付ファイルを決定します。以前の説明はされている詳細な添付ファイル説明16
</li>
</ol>3. 染色体配置の課題分析
<ol><li>2.3 の手順で説明されているようにピペットの装置を使用して、ミルリノン無料文化中油滴 100 μ L に卵子を転送し、卵母細胞の減数分裂中期に十分な成熟を許可するように 7 時間孵化させなさい私 (私に会った) 2.3 17 の手順で前述のよう. 注: 卵母細胞成熟、マイクロインジェクション、コレクションの手順を概説した15。手順 2.1 2.2 コントロール、および RNA マイクロインジェクション濃度で添付ファイルの試金のプロトコルを参照してください。</li>
	<li>同じピペットなどの器具を使用して、転送センターよく器官培養卵母細胞でセンターも、400 μ L H20 周囲のリングである [100 μ M] を含む含む 700 μ L 培養液中の料理し、37 ° C 2 時間インキュベートします。</li>
	<li>モナス トロール 100 μ CZB 培地の 3 つの滴を上記としてピペット装置を用いて卵を移すことによって洗い落として、700 μ L 培養培地 + MG132 を含む新しいセンターも器官培養皿に卵を転送 [5 μ M] 中心の 3 時間リング。外リングに 400 μ L H20 を追加します。</li>
	<li>室温で 20 分間 PBS で 400 μ L 2% パラホルムアルデヒドを含む透明なガラス スポット プレートのウェルにピペットの装置を使用して、それらを転送することによって卵子を修正します。</li>
	<li>転送の卵母細胞を固定後、400 μ L を含む、透明なガラスのスポット プレートの新しい井戸にピペットの装置を使用してブロッキング液およびストアまで 4 ° C での免疫染色の処理します。 注: の 4 ° C、カバーガラス スポット板パラフィルム蒸発を防ぐために、卵を保存します。</li>
	<li>Permeabilize し、免疫細胞化学を介して卵母細胞 2.6 2.16 の手順で説明するようにラベルを付けます。</li>
	<li>卵母細胞を共焦点顕微鏡 40 63 x 目的を使用して、キャプチャを画像 < 中期紡錘体の全体の地域をイメージを確かめて z 平面の 1 μ m のステップします。</li>
	<li>染色体の整列を識別するためには、状態は、イメージング ソフトウェアを使用してイメージ ファイルを開きます。 注: 次の手順説明画像 J (NIH) 無料ダウンロード可能なソフトウェアを使用してこの手順は、ただし、代替のイメージング ソフトウェアを使用できます。</li>
	<li>イメージをイメージ J コントロール パネルにドラッグします。</li>
	<li>開設の z シリーズ (コントロール バーで画像 J ポイント ツール アイコンをクリックして利用可能な) ポイント ツールを使用してイメージをクリックすると画像でスピンドル極上にツールを置く彼らのそれぞれの z スライスで各スピンドル極端ポイントをマークします。キーボードのコマンド + t を押すことによって利益 (率 ROI) マネージャーの地域にこれらのポイントを追加します。</li>
	<li>各 ROI マネージャーの特定のポイントを強調表示し、測定ボタンをクリックすると手順 3.10 で設定位置の特定の座標を決定します。これは、結果を提供するテーブルを含む x と各ポイントの y 座標。これらそれぞれ X1、Y1、および Y2、X1 のポイントになります。</li>
	<li>次に、true Z 座標を決定します。これはスピンドル極が識別された z スタックで特定の z スライスのスライス数を乗算することによって (すなわち6 スライス #2) 個々 の各ポイントは、スタックの厚さ (すなわち1 μ m) を (例: スライス 2 x 1 μ m = 2)。これらそれぞれ Z1 と Z2 のポイントになります。</li>
	<li>ピタゴラスの定理の式を使ってスピンドル長さを決定 (2 + b2 = c の2) 以前に定義したを使用して x、y、および z 座標を 3.11 3.13 の手順から。最終的な長さは、各スピンドルに等しい。 √((X1-X2)2+(Y1-Y2)2+(Z1-Z2)2)</li>
	<li>スピンドル midzone を決定します。これはスピンドルの長さの 1 つの半分として計算されます。画像 J ツール バーの線アイコンをクリックして画像 J で [線] ツールを使用して、主軸 midzone は、1 つのスピンドル極から線を引きます。長さは、イメージ J ツール バーに表示されます。</li>
	<li>ライン計測ツールを使用スピンドル midzone から染色体の距離を評価することによって染色体位置揃えの状態を決定します。画像 J ツール ・ バーの線アイコンをクリックして利用できる [線] ツールを使用して、染色体にスピンドル midzone から線を引きます。長さは、イメージ J ツール バーに表示されます。スピンドル midzone から 4 μ m より大きい染色体は、不整列18と見なされます。</li>
</ol>

<ol>
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J Cell Biol. 150 (5), 975-988 (2000).</li><li>Jones, K. T., Lane, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+causes+of+aneuploidy+in+mammalian+eggs.">Molecular causes of aneuploidy in mammalian eggs.</a> Development. 140 (18), 3719-3730 (2013).</li><li>Fellmeth, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+characterization+of+three+Aurora+kinase+C+splice+variants+found+in+human+oocytes.">Expression and characterization of three Aurora kinase C splice variants found in human oocytes.</a> Mol Hum Reprod. 21 (8), 633-644 (2015).</li><li>Rieder, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+cold-stable+kinetochore+fiber+in+metaphase+PtK1+cells.">The structure of the cold-stable kinetochore fiber in metaphase PtK1 cells.</a> Chromosoma. 84 (1), 145-158 (1981).</li><li>Brunet, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetochore+fibers+are+not+involved+in+the+formation+of+the+first+meiotic+spindle+in+mouse+oocytes,+but+control+the+exit+from+the+first+meiotic+M+phase.">Kinetochore fibers are not involved in the formation of the first meiotic spindle in mouse oocytes, but control the exit from the first meiotic M phase.</a> J Cell Biol. 146 (1), 1-12 (1999).</li><li>Joung, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+CRISPR-Cas9+knockout+and+transcriptional+activation+screening.">Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout and transcriptional activation screening.</a> Nat Protoc. 12 (4), 828-863 (2017).</li><li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR/Cas+systems.">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li></ol>

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病気に関連付けられている人間の遺伝的変異の迅速かつ増加の識別のための生物学的意義を評価するシステムが確立されているが不可欠です。人間の卵子は貴重なまれな、人間の精子で遺伝子操作を受けやすいので人間減数分裂ポーズ特定課題におけるタンパク質の機能を理解します。マウス卵母細胞は減数分裂遺伝子機能10,23を評価する貴重な哺...

不妊症は、生殖年齢の1、そこからほぼ半分を求める医療2人の人口の 10-15% に影響を与える条件です。不妊症の病因は多様であるが、多因子の多くの場合、人間の最も一般的な遺伝的異常は異数性胚3です。異数性は、細胞内の染色体の正しい数の偏差 (ゲインまたはロス) として定義されます。ヒト胎芽における異数性の現象は、一般的な高齢出産4、5と増加します。この戦略の結果、増加注入率、流産率の低下と時間の短縮のため子宮の転送の唯一の染色体正常 (欠) 胚の選択の利点を強調している 4 つのランダム化比較試験妊娠6,7,8,9を達成します。したがって、人間の異数性の病因を理解すること、生殖補助医療に重要な意味を持つことができます。
染色体異常で着床前遺伝子検査は不妊治療に有益であるが、染色体異常の発生の理解はまだ欠けています。減数分裂期の染色体異常 (配偶子生産の間に由来) と母親の年齢、しかし、いくつか女性存在異数性胚率の恵まれた時代4の平均レートを逸脱した正の相関関係があることを広く受け入れられています。これらのケースは、年齢だけが常に異数性胚を生成するリスクの予測ではないことをお勧めします。他の要因は遺伝子変異など胎児の異数性のリスクを増加させる役割を果たす可能性があります。
卵母細胞の減数分裂の間に異数性の遺伝子の変形の潜在的な貢献の調査の重要な側面は、減数分裂遺伝子機能を迅速に評価するシステムを設計することです。倫理的な制約と制限付きアクセスのため、卵子を使用してこれらのテストを実行する実用的ではありません。マウス卵母細胞を使用して、これらの問題を回避ことができます、ここで減数分裂の間に人間の遺伝子の機能を評価するために試金のシリーズ私は説明しました。マウス卵人間蛋白質の局在化の可視化し、野生型および変異人間蛋白質の異所性発現結果いずれかのかどうかを判断するために使用によって興味の遺伝子の変形のためメッセンジャー RNA (mRNA) のコーディングを microinjecting、異数性につながることができる表現型の変化。これらの表現型は、動原体と重要な減数分裂 i 中期の染色体の整列をサポートすることができない妹に不適切に接続する微小管の増加、利得と機能の損失を調査するこのプロトコルを使用することができます。よう卵母細胞の減数分裂のキー イベントに挑戦する実験的条件を確立することによって遺伝的変異は、建物と染色体の整列10 をスピンドルします。

<table><tbody><tr><td>0.2 mL Seal-Rite PCR tube</td><td>USA Scientific</td><td>1602-4300</td><td></td></tr><tr><td>1 kb DNA Ladder</td><td>Thermo Scientific</td><td>SM0313</td><td></td></tr><tr><td>100 bp DNA Ladder</td><td>Thermo Scientific</td><td>SM0243</td><td></td></tr><tr><td>6X DNA loading Dye</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0611</td><td></td></tr><tr><td>9-well glass spot plate</td><td>Thomas Scientific</td><td>7812G17</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>Albumin from bovine serum&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3294&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Alexa-fluor-568 conjugated anti-mouse IgG</td><td>Thermo Scientific</td><td>A21050</td><td>1:200 dilution</td></tr><tr><td>Alexa-fluor-633 conjugated anti-human IgG</td><td>Thermo Scientific</td><td>A21091</td><td>1:200 dilution</td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>VWR</td><td>AA0356</td><td></td></tr><tr><td>Anti-vibration table</td><td>Technical Manufacturing Corp</td><td></td><td>any standard model</td></tr><tr><td>Anti-Acetylated Tubulin antibody</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T7451</td><td>1:100 diution</td></tr><tr><td>Anti-centromeric (CREST) antibody</td><td>Antibodies Incorportated</td><td>15-234</td><td>1:30 dilution&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Barrier (Filter) Pipette tips</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM12635</td><td>Make sure compatable with your brand of pipettors. These are compatible with Eppendorf brand pipettors.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Agar, Miller (Luria Bertani)</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0445-07-6</td><td></td></tr><tr><td>BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Broth, Miller (Luria Bertani)</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0446-07-5</td><td></td></tr><tr><td>Capillary tubing</td><td>Sutter</td><td>B100-75-10</td><td></td></tr><tr><td>Center Well organ culture dish</td><td>VWR</td><td>25381-141</td><td></td></tr><tr><td>CO2 tank</td><td></td><td></td><td>For incubator</td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td>any standard model</td></tr><tr><td>Centrifuge (With cooling ability)</td><td>Thomas Scientific</td><td></td><td>any standard model&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Cover Glass 11 x 22 mm</td><td>Thomas Scientific</td><td>6663F10</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>Thomas Scientific</td><td>6663-F10</td><td>thickness will vary for particular microscopes</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>DEPC H20</td><td>Life Technologies</td><td>AM9922</td><td></td></tr><tr><td>Digital Dry Bath</td><td>Thermo Scientific</td><td>888700001</td><td></td></tr><tr><td>Easy A high fidelity cloning enzyme</td><td>Agilent</td><td>600400</td><td>For DNA cloning&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Enzymes for linearizing pIVT</td><td>New England Biolabs</td><td></td><td>NdeI or KasI can be used</td></tr><tr><td>Ethidium Bromide</td><td>Thermo Scientific</td><td>155585011</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescent Microscope&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>Any Fluorescent microscope may be used</td></tr><tr><td>Formaldehyde (37%)</td><td>Thermo Fisher Scientifc</td><td>9311</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde RNA loading dye</td><td>Ambion</td><td>8552</td><td></td></tr><tr><td>Frosted Microscope Slides (Uncharged) 25X75 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-3</td><td></td></tr><tr><td>Full Length cDNA Clones</td><td></td><td></td><td>Can be obtained from any vendor that supplies open reading frame clones</td></tr><tr><td>Gel electrophoresis apparatus</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>any standard model</td></tr><tr><td>Glass Pasteur Pipets</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-200</td><td></td></tr><tr><td>Globin Forward Primer for pIVT Construct</td><td></td><td></td><td>5&#039;- GAA GCT CAG AAT AAA CGC -3&#039;.&amp;nbsp; Can be purchased from any company that generates custom oligonucelotides</td></tr><tr><td>Globin Reverse Primer for pIVT Construct</td><td></td><td></td><td>5&#039;- ATT CGG GTG TTC TTG AGG CTG G -3&#039; Can be purchased from any company that generates custom oligonucelotides</td></tr><tr><td>Holding pipettes</td><td>Eppendorf</td><td>930001015</td><td>Vacutip</td></tr><tr><td>Humidified Chamber</td><td></td><td></td><td>Tupperware can be used</td></tr><tr><td>Illustra Ready-To-Go RT-PCR beads</td><td>GE Life Sciences</td><td>27925901</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td></td><td></td><td>any standard model with CO2 and water jacketed technology</td></tr><tr><td>Inverted Microscope</td><td>Nikon instruments</td><td></td><td>Any Standard model</td></tr><tr><td>Image J (NIH) Software</td><td>NIH</td><td></td><td>Image Analysis software</td></tr><tr><td>Lid of 96 well plate</td><td>Nalgene Nunc International</td><td>263339</td><td></td></tr><tr><td>Low Adhesion 0.5 mL microcentrifgue tube</td><td>USA Scientific</td><td>1405-2600</td><td></td></tr><tr><td>MacVector&amp;nbsp;</td><td>MacVector</td><td></td><td>Sequence analysis software</td></tr><tr><td>MG132</td><td>Selleckchem</td><td>S2619</td><td></td></tr><tr><td>Microscope slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-3&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Millenium RNA Markers-Formaldehyde&amp;nbsp;</td><td>Ambion</td><td>AM7151</td><td></td></tr><tr><td>Milrinone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4659</td><td>Resuspend in DMSO at 2.5mM</td></tr><tr><td>Mineral Oil</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5310</td><td>Only used embryo-tested, sterile-filtered</td></tr><tr><td>Monastrol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8515</td><td>Resuspend in DMSO at 100 mM</td></tr><tr><td>Mouthpiece</td><td>Biodiseno</td><td>MP-001-Y</td><td></td></tr><tr><td>N2 tank</td><td></td><td></td><td>for antivibration table</td></tr><tr><td>Nail Polish; Clear</td><td></td><td></td><td>Any clear nailpolish can be used</td></tr><tr><td>NanoDrop Microvolume UV-Vis Spectrophotometer</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>any standard model</td></tr><tr><td>NorthernMax 10X Denaturing Gel Buffer</td><td>Life Technologies</td><td>AM8676</td><td></td></tr><tr><td>NorthernMax 10X Running buffer</td><td>Life Technologies</td><td>AM8671</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE MOPS SDS Running buffer</td><td>Thermo Scnentific</td><td>NP0001</td><td></td></tr><tr><td>Organ Culture Dish 60x15mm</td><td>Life Technologies</td><td>08-772-12</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Polysciences, Inc.&amp;nbsp;</td><td>577773</td><td></td></tr><tr><td>PCR Thermal Cycler</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4484075</td><td></td></tr><tr><td>Petri Dish 139 mm</td><td>Thermo Fisher Scientifc</td><td>501V</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish 35 mm</td><td>Thermo Fisher Scientifc</td><td>121V</td><td></td></tr><tr><td>Petri Dish 60 mm</td><td>Falcon BD</td><td>351007</td><td></td></tr><tr><td>Picoinjector</td><td>XenoWorks Digital Microinjector</td><td></td><td>any standard model</td></tr><tr><td>Pipette puller</td><td>Flaming-Brown Micropipette puller</td><td>Model P-1000</td><td></td></tr><tr><td>pIVT plasmid</td><td>AddGene</td><td>32374</td><td>Empty vector suitable for oocyte expression.</td></tr><tr><td>Pregnant Mare Serum Gonadotropin</td><td>Lee BioSolutions</td><td>493-10</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td>purification of up to 20 uL of plasmid DNA</td></tr><tr><td>QIAquick PCR purification kit</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Quikchange II site directed mutagenesis kit</td><td>Agilent&amp;nbsp;</td><td>200523</td><td>mutagenesis kit for insertions and deletions</td></tr><tr><td>Quikchange lightning multi-site directed mutagenesis kit</td><td>Agilent&amp;nbsp;</td><td>210512</td><td>mutagenesis kit for single site changes</td></tr><tr><td>Scissors (Fine point)</td><td>Fine science tools</td><td>14393</td><td></td></tr><tr><td>Scissors (Medium point)</td><td>Fine science tools</td><td>WP114225</td><td></td></tr><tr><td>Seal-Rite 1.5 mL microcentrifuge tube</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>Slide Warmer</td><td></td><td></td><td>any standard model</td></tr><tr><td>Spectrophotometer (Nanodrop)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-ONE-W</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td></td><td></td><td>any standard model</td></tr><tr><td>Subcloning Efficiency DH5a Competent Cells</td><td>Thermo Fisher Scientifc</td><td>18265017</td><td></td></tr><tr><td>Syringe</td><td>BD Bioscienes</td><td>309623</td><td>1 ml, 27G(1/2)</td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202L</td><td></td></tr><tr><td>T7 mMessage Machine high-yield capped RNA transcription kit</td><td>Life Technologies</td><td>AM1340</td><td></td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>x-100</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>274348</td><td></td></tr><tr><td>Tweezer (Fine point- Size 5)</td><td>Fine science tools</td><td>SN.743.12.1</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Dnase/Rnase-Free Distilled Water</td><td>Thermo Fisher Scientifc</td><td>10977015</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Ethidium Bromide 10mg/mL</td><td>Thermo Fisher Scientifc</td><td>15585011</td><td></td></tr><tr><td>UVP UV/White lite transilluminator</td><td>Fisher Scientific</td><td>UV95041501</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield Mounting Medium</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr></tbody></table>

using mouse oocytes to assess human gene function during meiosis i

異数性胚は人間の不妊の主要な遺伝的原因です。これらのイベントのほとんどが女性の減数分裂の間としています、時代だけでが常に異数性胚の生成の危険性の予測ではないとはいえ、母親の年齢との相関します。したがって、遺伝子変異は卵形成中に不適切な染色体分配を考慮可能性があります。人間の卵子へのアクセスが研究目的に限られていることを考える私マウス卵母細胞減数分裂の間人間遺伝子の働きを研究するアッセイのシリーズが開発されました。まず、興味の遺伝子の変異と遺伝子のメッセンジャー RNA (mRNA)、前期私逮捕マウス卵母細胞に microinjected します。式のための時間を許可すると後、卵子は同期的に成熟減数分裂を完了するために放出される私。緑色蛍光タンパク質 (Gfp) などの蛍光レポーターのシーケンスを持つ mRNA をタグによって表現型の変化に加えて人間蛋白質のローカリゼーションを評価できます。たとえば、ゲインまたは機能の損失は、減数分裂エラーを修正する遺伝子プロダクトを挑戦実験の条件を確立することによって調べることができます。蛋白質の表現は内因性のレベルでないことを考えると、(すなわちノック制御しない限り、結果の適切な解釈を行わなければならないこのシステムはとりこませた人間蛋白質機能の調査に有利であるが、うち上下)、マウスのホモログがシステムに存在も。

培養後、A260/A280 率 (1.8 2.2) と分光光度計を使用して測定したとき A260/A230 比 ≥1.7 高品質 RNA があります。図1 図の試験管内での移行-変化の agarose のゲルの電気泳動後 RNA を生産します。パターンやサイズの複数のバンドを持つサンプルで塗られるバンドが汚染またはサンプルの劣化のことを示します。また、複数のバンドは、mRNA を...

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Using Mouse Oocytes to Assess Human Gene Function During Meiosis I

人間の病気に関連する遺伝子の変異は明らかになるを開始するにつれて急速に識別された亜種の生物学的意義を評価するシステムの開発がますます重要になっております。このプロトコルでは、私はマウス卵母細胞を使用して女性の減数分裂の間人間遺伝子の働きを評価する方法について説明します。

マウス卵母細胞を減数分裂の間に人間の遺伝子の機能を評価するために使用私

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively ...

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8.8K ビュー.  IVI-RMA New Jersey. 人間の病気に関連する遺伝子の変異は明らかになるを開始するにつれて急速に識別された亜種の生物学的意義を評価するシステムの開発がますます重要になっております。このプロトコルでは、私はマウス卵母細胞を使用して女性の減数分裂の間人間遺伝子の働きを評価する方法について説明します。

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RNA Interference-based Investigation of the Function of Heat Shock Protein 27 during Corneal Epithelial Wound Healing

Small interfering RNA (siRNA) is among the most widely used RNA interference methods for the short-term silencing of protein-coding genes. siRNA is a synthetic RNA duplex created to specifically target a mRNA transcript to induce its degradation and it has been used to identify novel pathways in various cellular processes. Few reports exist regarding the role of phosphorylated heat shock protein 27 (HSP27) in corneal epithelial wound healing. Herein, cultured human corneal epithelial cells were divided into a scrambled control-siRNA transfected group and a HSP27-specific siRNA-transfected group. Scratch-induced directional wounding assays, and western blotting, and flow cytometry were then performed. We conclude that HSP27 has roles in corneal epithelial wound healing that may involve epithelial cell apoptosis and migration. Here, step-by-step descriptions of sample preparation and the study protocol are provided.

Herein, we present a protocol to use heat shock protein 27 (HSP27)-specific small interfering RNA to assess the function of HSP27 during corneal epithelial wound healing. RNA interference is the best method for effectively knocking-down gene expression to investigate protein function in various cell types.

角膜上皮創傷治癒中の熱ショックタンパク質27の機能のRNA干渉ベースの調査

Small interfering RNA (siRNA) is among the most widely used RNA interference methods for the short-term silencing of protein-coding genes. siRNA is a ...

遺伝学

Chromatin Spread Preparations for the Analysis of Mouse Oocyte Progression from Prophase to Metaphase II

Chromatin spread techniques have been widely used to assess the dynamic localization of various proteins during gametogenesis, particularly for spermatogenesis. These techniques allow for visualization of protein and DNA localization patterns during meiotic events such as homologous chromosome pairing, synapsis and DNA repair. While a few protocols have been described in the literature, general chromatin spread techniques using mammalian prophase oocytes are limited and difficult due to the timing of meiosis initiation in fetal ovaries. In comparison, prophase spermatocytes can be collected from juvenile male mice with higher yields without the need for microdissection. However, it is difficult to obtain a pure synchronized population of cells at specific stages due to the heterogeneity of meiotic and post-meiotic germ cell populations in the juvenile and adult testis. For later stages of meiosis, it is advantageous to assess oocytes undergoing meiosis I (MI) or meiosis II (MII), because groups of mature oocytes can be collected from adult female mice and stimulated to resume meiosis in culture. Here, methods for meiotic chromatin spread preparations using oocytes dissected from fetal, neonatal and adult ovaries are described with accompanying video demonstrations. Chromosome missegregation events in mammalian oocytes are frequent, particularly during MI. These techniques can be used to assess and characterize the effects of different mutations or environmental exposures during various stages of oogenesis. As there are distinct differences between oogenesis and spermatogenesis, the techniques described within are invaluable to increase our understanding of mammalian oogenesis and the sexually dimorphic features of chromosome and protein dynamics during meiosis.

Oogenesis in mammals is known to be error-prone, particularly due to chromosome missegregation. This manuscript describes chromatin spread preparation methods for mouse prophase, metaphase I and II-staged oocytes. These fundamental techniques allow for the study of chromatin-bound proteins and chromosome morphology throughout mammalian oogenesis.

クロマチン広がるマウス卵母細胞の進行を前期から中期 II の分析のための準備

Chromatin spread techniques have been widely used to assess the dynamic localization of various proteins during gametogenesis, particularly for ...

Isolation and Characterization of Mouse Antral Oocytes Based on Nucleolar Chromatin Organization

This protocol describes a simple and quick method to isolate and characterize mouse antral GV (Germinal Vesicle) oocytes as able (SN, Surrounded Nucleolus) or unable (NSN, Not Surrounded Nucleolus) to develop to the blastocyst stage after in vitro maturation (IVM) and in vitro fertilization (IVF). It makes use of Hoeschst33342 (or any other DNA intercalating dye) able to bind to the heterochromatin of the nucleolus showing a ring in the SN oocytes or not, like in the NSN oocytes. This represents the easiest and quickest way to sort both antral oocytes that can be eventually used for IVM or IVF procedures. 
Briefly, the protocol consists of the following steps: hormone injection to stimulate follicular growth; isolation of the oocytes at the GV stage from the antral compartment by puncturing the ovary with a sterile needle; preparation of thin glass pipettes for mouth pipetting of the oocytes; sorting of the oocytes with Hoechst33342 prepared at a supravital concentration; IVM, IVF or any other molecular/cellular analysis.
Unfortunately there are still few evidences to sort SN and NSN oocytes using less invasive techniques. If and once they will be identified, they could be potentially applied to human assisted reproductive technologies, although with several aspects that should be modified. To date, this technique has potential implications to dramatically increase IVM and IVF successful procedures in both endangered and species with economic interest.

Here we present a protocol for the characterization of mouse antral oocytes based on nucleolar organization.

核小体クロマチン組織に基づいてマウス洞卵母細胞の単離とキャラクタリゼーション

This protocol describes a simple and quick method to isolate and characterize mouse antral GV (Germinal Vesicle) oocytes as able (SN, Surrounded ...

発生生物学

Evaluation of the Spindle Assembly Checkpoint Integrity in Mouse Oocytes

Aneuploidy is the leading genetic abnormality causing early miscarriage and pregnancy failure in humans. Most errors in chromosome segregation that give rise to aneuploidy occur during meiosis in oocytes, but why oocyte meiosis is error-prone is still not fully understood. During cell division, cells prevent errors in chromosome segregation by activating the spindle assembly checkpoint (SAC). This control mechanism relies on detecting kinetochore (KT)-microtubule (MT) attachments and sensing tension generated by spindle fibers. When KTs are unattached, the SAC is activated and prevents cell-cycle progression. The SAC is activated first by MPS1 kinase, which triggers the recruitment and formation of the mitotic checkpoint complex (MCC), composed of MAD1, MAD2, BUB3, and BUBR1. Then, the MCC diffuses into the cytoplasm and sequesters CDC20, an anaphase-promoting complex/cyclosome (APC/C) activator. Once KTs become attached to microtubules and chromosomes are aligned at the metaphase plate, the SAC is silenced, CDC20 is released, and the APC/C is activated, triggering the degradation of Cyclin B and Securin, thereby allowing anaphase onset. Compared to somatic cells, the SAC in oocytes is not as effective because cells can undergo anaphase despite having unattached KTs. Understanding why the SAC is more permissive and if this permissiveness is one of the causes of chromosome segregation errors in oocytes still needs further investigation. The present protocol describes the three techniques to comprehensively evaluate SAC integrity in mouse oocytes. These techniques include using nocodazole to depolymerize MTs to evaluate the SAC response, tracking SAC silencing by following the kinetics of Securin destruction, and evaluating the recruitment of MAD2 to KTs by immunofluorescence. Together these techniques probe mechanisms needed to produce healthy eggs by providing a complete evaluation of SAC integrity.

Error in chromosome segregation is a common feature in oocytes. Therefore, studying the spindle assembly checkpoint gives important clues about the mechanisms needed to produce healthy eggs. The present protocol describes three complementary assays to evaluate spindle assembly checkpoint integrity in mouse oocytes.

マウス卵母細胞における紡錘体アセンブリチェックポイント完全性の評価

Aneuploidy is the leading genetic abnormality causing early miscarriage and pregnancy failure in humans. Most errors in chromosome segregation that give ...

マウスの前期停止卵子におけるDNA損傷の同定

Detection of DNA Double-Stranded Breaks in Mouse Oocytes

Oocytes are amongst the biggest and most long-lived cells in the female body. They are formed in the ovaries during embryonic development and remain arrested at the prophase of meiosis I. The quiescent state may last for years until the oocytes receive a stimulus to grow and obtain the competency to resume meiosis. This protracted state of arrest makes them extremely susceptible to accumulating DNA-damaging insults, which affect the genetic integrity of the female gametes and, therefore, the genetic integrity of the future embryo. 
Consequently, the development of an accurate method to detect DNA damage, which is the first step for the establishment of DNA damage response mechanisms, is of vital importance. This paper describes a common protocol to test the presence and progress of DNA damage in prophase-arrested oocytes during a period of 20 h. Specifically, we dissect mouse ovaries, retrieve the cumulus-oocyte complexes (COCs), remove the cumulus cells from the COCs, and culture the oocytes in &#924;2 medium containing 3-isobutyl-1-methylxanthine to maintain the state of arrest. Thereafter, the oocytes are treated with the cytotoxic, antineoplasmic drug, etoposide, to engender double-strand breaks (DSBs). 
By using immunofluorescence and confocal microscopy, we detect and quantify the levels of the core protein &#947;H2AX, which is the phosphorylated form of the histone H2AX. H2AX becomes phosphorylated at the sites of DSBs after DNA damage. The inability to restore DNA integrity following DNA damage in oocytes can lead to infertility, birth defects, and increased rates of spontaneous abortions. Therefore, the understanding of DNA damage response mechanisms and, at the same time, the establishment of an intact method for studying these mechanisms are essential for reproductive biology research.

著者スポットライト:哺乳類の卵母細胞および着床前胚におけるDNA損傷応答の理解 

Maintaining oocyte genome integrity is necessary to ensure the genetic fidelity in the resulting embryo. Here, we present an accurate protocol for detecting DNA double-strand breaks in mammalian female germ cells.

マウス卵母細胞におけるDNA二本鎖切断の検出

Oocytes are amongst the biggest and most long-lived cells in the female body. They are formed in the ovaries during embryonic development and remain ...

Mouse Oocyte Microinjection, Maturation and Ploidy Assessment

Mistakes in chromosome segregation lead to aneuploid cells. In somatic cells, aneuploidy is associated with cancer but in gametes, aneuploidy leads to infertility, miscarriages or developmental disorders like Down syndrome. Haploid gametes form through species-specific developmental programs that are coupled to meiosis. The first meiotic division (MI) is unique to meiosis because sister chromatids remain attached while homologous chromosomes are segregated. For reasons not fully understood, this reductional division is prone to errors and is more commonly the source of aneuploidy than errors in meiosis II (MII) or than errors in male meiosis 1,2. 
In mammals, oocytes arrest at prophase of MI with a large, intact germinal vesicle (GV; nucleus) and only resume meiosis when they receive ovulatory cues. Once meiosis resumes, oocytes complete MI and undergo an asymmetric cell division, arresting again at metaphase of MII. Eggs will not complete MII until they are fertilized by sperm. Oocytes also can undergo meiotic maturation using established in vitro culture conditions 3. Because generation of transgenic and gene-targeted mouse mutants is costly and can take long periods of time, manipulation of female gametes in vitro is a more economical and time-saving strategy. 
Here, we describe methods to isolate prophase-arrested oocytes from mice and for microinjection. Any material of choice may be introduced into the oocyte, but because meiotically-competent oocytes are transcriptionally silent 4,5 cRNA, and not DNA, must be injected for ectopic expression studies. To assess ploidy, we describe our conditions for in vitro maturation of oocytes to MII eggs. Historically, chromosome-spreading techniques are used for counting chromosome number 6. This method is technically challenging and is limited to only identifying hyperploidies. Here, we describe a method to determine hypo-and hyperploidies using intact eggs 7-8. This method uses monastrol, a kinesin-5 inhibitor, that collapses the bipolar spindle into a monopolar spindle 9 thus separating chromosomes such that individual kinetochores can readily be detected and counted by using an anti-CREST autoimmune serum. Because this method is performed in intact eggs, chromosomes are not lost due to operator error.

Oocytes are prone to aneuploidy due to errors in chromosome segregation during meiotic maturation. Aneuploid eggs can cause infertility, miscarriages or developmental disorders like Down syndrome. Here, we describe methods to introduce materials of choice into oocytes and methods to study meiotic maturation and assess ploidy.

マウス卵母細胞のマイクロインジェクション、成熟および倍数性評価

Mistakes in chromosome segregation lead to aneuploid cells.  In somatic cells, aneuploidy is associated with cancer but in gametes, aneuploidy leads to ...

生物学

Meiotic Spindle Assessment in Mouse Oocytes by siRNA-mediated Silencing

Errors in chromosome segregation during meiotic division in gametes can lead to aneuploidy that is subsequently transmitted to the embryo upon fertilization. The resulting aneuploidy in developing embryos is recognized as a major cause of pregnancy loss and congenital birth defects such as Down&#8217;s syndrome. Accurate chromosome segregation is critically dependent on the formation of the microtubule spindle apparatus, yet this process remains poorly understood in mammalian oocytes. Intriguingly, meiotic spindle assembly differs from mitosis and is regulated, at least in part, by unique microtubule organizing centers (MTOCs). Assessment of MTOC-associated proteins can provide valuable insight into the regulatory mechanisms that govern meiotic spindle formation and organization. Here, we describe methods to isolate mouse oocytes and deplete MTOC-associated proteins using a siRNA-mediated approach to test function. In addition, we describe oocyte fixation and immunofluorescence analysis conditions to evaluate meiotic spindle formation and organization.

Here, we present a protocol for specific siRNA-mediated mRNA depletion followed by immunofluorescence analysis to evaluate meiotic spindle assembly and organization in mouse oocytes. This protocol is suitable for in vitro depletion of transcripts and functional assessment of different spindle and/or MTOC-associated factors in oocytes.

siRNA媒介サイレンシングによるマウス卵母細胞における減数分裂紡錘体の評価

Errors in chromosome segregation during meiotic division in gametes can lead to aneuploidy that is subsequently transmitted to the embryo upon ...

Techniques for Imaging Prometaphase and Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes

Chromosome segregation in human oocytes is error prone, resulting in aneuploidy, which is the leading genetic cause of miscarriage and birth defects. The study of chromosome behavior in oocytes from model organisms holds much promise to uncover the molecular basis of the susceptibility of human oocytes to aneuploidy. Drosophila melanogaster is amenable to genetic manipulation, with over 100 years of research, community, and technique development. Visualizing chromosome behavior and spindle assembly in Drosophila oocytes has particular challenges, however, due primarily to the presence of membranes surrounding the oocyte that are impenetrable to antibodies. We describe here protocols for the collection, preparation, and imaging of meiosis I spindle assembly and chromosome behavior in Drosophila oocytes, which allow the molecular dissection of chromosome segregation in this important model organism.

Techniques for Imaging Prometaphase and Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes

We present protocols for the collection, preparation, and imaging of mature Drosophila oocytes. These methods allow the visualization of chromosome behavior and spindle assembly and function during meiosis.

固定における減数分裂Iのイメージング前中期および中期のための技術<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;卵母細胞

Chromosome segregation in human oocytes is error prone, resulting in aneuploidy, which is the leading genetic cause of miscarriage and birth defects. The ...

マウス卵母細胞を減数分裂の間に人間の遺伝子の機能を評価するために使用私

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