Diese Arbeit wurde unterstützt durch NIGMS (R01GM11755), P.W.J und ein Training Stipendium Stipendium vom National Cancer Institute (NIH) (CA009110), g.h. und j.h.

Alle hier beschriebene Methoden wurden von den institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) der Johns Hopkins University genehmigt. Experimente wurden an Wildtyp C57BL/6J Mäusen durchgeführt.
1. Ernte fetale oder neonatale Eierstöcke und Vorbereitung der Prophase Chromatin breitet sich
<ol><li>Embryonen im 14,5 – 19,5 Tage Post-Coitum (Dpc) extrahieren Opfern Sie die trächtige Weibchen durch zervikale Dislokation oder CO2 Erstickung nach IACUC Richtlinien. Hinweis: Überspringen Sie Schritt 1.3 für postnatale Tag 1 – 5 Eierstöcke. Abbildung 1 enthält eine Zusammenfassung der meiotischen Prophase Bühnen in verschiedenen Altersstufen der embryonalen und postnatale bereichert.</li>
	<li>Öffnen Sie die Abdominopelvic Hohlraum mit sterile Schere, so dass eine v-förmige Öffnung. Aus der mütterlichen Gebärmutter Horn zu sezieren Sie, trennen Sie die Embryonen aus der Plazenta und transferieren Sie die Embryonen in 35 mm Petrischalen mit 3 mL vorgewärmten 1 x Phosphat-Puffer Kochsalzlösung (PBS) bei 37 ° C. Hinweis: Ein Fliptop-Inkubator bei 37 ° C einstellen kann verwendet werden, um Temperatur zu halten. Darüber hinaus kann eine Temperatur geregelt-Glas-Bühne auch, Temperatur während der Eierstock Manipulation verwendet werden.</li>
	<li>Mit 3,5-Zoll-Chirurgische Scheren Embryonen oder Welpen über Enthauptung nach IACUC Richtlinien zu opfern. Legen Sie enthauptet Embryonen oder Welpen in vorgewärmten PBS vor weiteren Dissektion.</li>
	<li>Sezieren eines Embryos oder Welpen gleichzeitig in einer separaten 35 mm Petrischale mit 3 mL vorgewärmten PBS bei 37 ° C. Fahren Sie durch Schnitt entlang der ventralen Mittellinie von der hinteren Hälfte des Embryos, entlang der vorderen Hälfte unter die Vorderbeine und direkt oberhalb der hinteren Gliedmaßen und Rute wie in Abbildung 2A-Bbeschrieben.</li>
	<li>Öffnen Sie den Bauch mit 3,5-Zoll-chirurgische Schere. Mit feinen Spitzen Pinzette zu verdrängen oder entfernen Sie die Leber und Schleifen des Darms, die Eierstöcke in einer neuen 35 mm Petrischale mit 3 mL vorgewärmten PBS bei 37 ° C aussetzen (siehe Guide in Abbildung 2 b). Die Eierstöcke befinden sich direkt unterhalb und hinter der Niere in Richtung der hinteren Wand der Bauchhöhle (Abb. 2 b–C). Ein Leitfaden für die Unterscheidung zwischen männlichen und weiblichen Keimdrüsen wird in Abb. 2Dbereitgestellt. Hinweis: Für optimale Bedingungen schnell zu sezieren, die Eierstöcke nach trächtige Weibchen geopfert wird.</li>
	<li>Entfernen Sie beide Eierstöcke von jedem weiblichen Fetus mit einer feinen Spitze Pinzetten unter einer Dissektion Umfang und in einer Uhrgläser oder separate Brunnen von Multi-Well Platte mit 0,5 bis 1,0 mL vorgewärmten PBS und pflegen bei 37 ° C.</li>
	<li>Legen Sie jedes Paar der Eierstöcke in 0,5 mL Hypo-Extraktionspuffer (17 mM Trinatrium Citrat Dihydrat, 50 mM Saccharose, 5 mM EDTA, 0,5 mM DVB-t, 30 mM Tris-HCl, Proteasehemmer, pH 8,2) in einem sauberen Uhrglas oder ein kleiner Brunnen von einem 9-Well-Platte, und achten Sie auf die Eierstöcke Comp Tauchen vollständig. Inkubieren Sie mindestens 15 min lang, aber nicht mehr als 30 min. Hinweis: Hypo-Extraktionspuffer frisch machen und innerhalb von 2 h von DVB-t-Zusatz verwenden.</li>
	<li>Während der Inkubation mit einem hydrophobe Barriere Pap-Stift zeichnen Sie zwei 22 x 22 mm2 Quadrate auf ein sauberes Glas 25 x 75 mm2, 1 mm dicken Mikroskop-Objektträger, wie in Abbildung 3Agezeigt. Hinweis: Folien können rechtzeitig vorbereitet werden.</li>
	<li>Pipette 45 – 50 µL 100 mM Saccharose in eine saubere Folie und ein paar Eierstöcke bis zum Tropfen zu übertragen.</li>
	<li>Mit den Spitzen enden von zwei 27 G Nadeln, necken Sie die Eierstöcke auseinander um Zellen in die Saccharoselösung zu lösen. Mit der Pinzette große Stücke von Eierstock entfernen und sorgfältig pipette Saccharoselösung um Zellen zu verteilen.</li>
	<li>Platz 40 µL Fixativ Lösung (1 % Paraformaldehyd (PFA), 0,2 % Waschmittel (siehe Tabelle der Materialien), pH 9.2) in jedes Quadrat der vorbereitete Folie. Mit einem 200 µl Pipettenspitze Fixativ Lösung gleichmäßig über die Oberfläche der Folie.</li>
	<li>Pipette 20 µL des Saccharose-Mix auf jedes Quadrat von der Folie, die das Fixiermittel enthalten. Hinweis: Dies entspricht mit ein paar Eierstöcke pro Folie.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Folien in einer geschlossenen feuchten Kammer über Nacht bei Raumtemperatur. Hinweis: Die Übernachtung Inkubation reichen um (12-15 Stunden) bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Öffnen Sie den Deckel und lassen Sie die Folien vollständig an der Luft trocknen.</li>
	<li>Objektträger in einem Coplin Glas mit 50 mL 0,4 % Netzmittel-PBS-Lösung waschen (siehe Tabelle der Materialien) für 2 min an der Luft trocknen, und fahren Sie mit Immunolabelling-Protokoll (Schritt 6). Hinweis: Es kann möglich sein, die Folien bei-80 ° C für die spätere Verwendung zu speichern, aber dies variiert je nach Protein des Interesses. Gehen Sie für ein optimales Ergebnis sofort auf das Immunolabelling-Protokoll (Schritt 6).</li>
</ol>2. Metaphase ich Eizellenentnahme
<ol><li>Um die Anzahl der antrale Follikel von jeder Maus isoliert zu maximieren, intraperitoneal injizieren Sie geschlechtsreif Jungfrau weibliche Mäuse mit 5 IU trächtige Stute Serum Gonadotropin (PMSG, auch bekannt als equine Chorion-Gonadotropin (EKG)). Hinweis: Für optimale Eizelle Ertrag sollte Mäuse 1 bis 3 Monate alt, sein wie die Anzahl der Eizellen geerntet mit zunehmendem Alter abnimmt. Zur Vorbereitung der PMSG lösen Sie Flasche 5.000 IU in 100 mL sterilen PBS (5 U/0.1 mL) Store in Einweg-Aliquote von 600 µL bei-20 ° C auf.</li>
	<li>Bereiten Sie nach 44 – 48 h Kollektion Medium, minimale wesentliche Mittel alpha (MEMα) Mittel ergänzt mit 5 % fetalen bovine Serum (FBS) und 3 mg/mL Rinderserumalbumin (BSA; MEMΑ/BSA/FBS). Sterilisieren Sie Medien durch einen 0,2 µm-Poren-Filter. Dekantieren Sie 2,5 mL MEMα/BSA/FBS in eine Glasschale per Mausklick Mittel- und warm auf 37 ° C in einem 5 % CO2 Inkubator. Hinweis: Andere Sammlung und Kulturmedien, die im Handel erhältlichen (M2 und M16) sind auch allgemein verwendet. Achtung: Wir empfehlen entfernen Kultur Gerichte aus dem 5 % CO2 Inkubator, eine zu einem Zeitpunkt für begrenzte Dauer Umgebungsluft Belichtung während der Manipulation Schritte zu minimieren.</li>
	<li>Die Mäuse durch zervikale Dislokation oder CO2 Erstickung nach IACUC Richtlinien zu opfern.</li>
	<li>Öffnen Sie die Abdominopelvic Hohlraum mit steriler Schere, wodurch eine große v-förmige Öffnung. Mit Pinzette, verdrängen Sie Darm in Richtung des Kopfes von der Maus. Suchen Sie jedes uterine Horn; die Eierstöcke sind proximal zu den Brustkorb präsentieren. Halten Sie die Eileiter mit feinen Zangen und schneiden Sie das Fett Superior der Eierstöcke mit Dissektion Schere (Abbildung 4). Weiterhin halten die Eileiter und den Eierstock aus der Bursa und in Sammlung Schale mit MEMα/BSA/FBS Medium mit einem anderen Satz von feinen Pinzetten freisetzen. Hinweis: Wie in Schritt 1 ist es unerlässlich, die Eierstöcke bei 37 ° C zu halten und zu pflegen um 5 % CO2. Ein Fliptop-Inkubator bis zu 5 % CO2 Mix angeschlossen kann verwendet werden, um optimale Wartung der Temperatur- und CO2 -Konzentration zu ermöglichen. Darüber hinaus sollte eine Temperatur geregelt-Glas-Bühne auch, Temperatur während der Eizelle Manipulation verwendet werden.</li>
	<li>Mit einer 1 mL Spritze mit einem 27-Gauge-Nadel (oder ähnlicher Größe), Cumulus Eizelle komplexe lösen, indem manuell Durchbohrung der großen antrale Follikel.</li>
	<li>Sammeln Sie während der Beobachtung durch ein Mikroskop Dissektion, GV inszeniert Eizellen mit einer Mund-betrieben Glaspipette oder Kapillare oder einer handbetriebenen Mikrometer-Spritze (Abbildung 5). Sammeln Sie nur Eizellen, die freigegeben werden von antrale Follikel. GV Eizellen haben einen Durchmesser von ca. 90 µm. GV Eizellen können 2-3 Schichten von Granulosa Zellen umgeben sein, und haben einen Durchmesser von rund 200 µm.</li>
	<li>Kultur der Eizellen in einem sauberen Uhrglas oder ein 9-Well-Platte mit MEMα/BSA/FBS Medium für 6 h, Metaphase zu erreichen ich bei 37 ° C in einem 5 % CO2 Inkubator.</li>
	<li>Fahren Sie mit Schritt 4 fort.</li>
</ol>3. Metaphase II (MII) Eizellenentnahme
<ol><li>Zur Maximierung der Oozyten isoliert von jeder Maus Spritzen Sie intraperitoneal geschlechtsreif Jungfrau weibliche Mäuse mit 5 IU der PMSG. Nach 44 – 48 h intraperitoneale Injektion mit 5 IU humanes Choriongonadotropin (hCG). Hinweis: Für optimale Eizelle Ertrag sollte Mäuse 1 bis 3 Monate alt, sein wie die Anzahl der Eizellen geerntet mit zunehmendem Alter abnimmt. Um hCG vorzubereiten, lösen eine Flasche 10.000 U in 200 mL PBS (5 U/0.1 mL). Speichern Sie in Einweg-Aliquote von 600 µL bei-20 ° C.</li>
	<li>Bereiten Sie nach 12 bis 14 Uhr MEMα/BSA/FBS Kollektion Medium, wie oben in Schritt 2.2 beschrieben.</li>
	<li>Die Mäuse durch zervikale Dislokation oder CO2 Erstickung nach IACUC Richtlinien zu opfern.</li>
	<li>Öffnen Sie die Abdominopelvic Hohlraum mit steriler Schere, wodurch eine große v-förmige Öffnung. Mit Pinzette, verdrängen Sie Darm in Richtung des Kopfes von der Maus. Suchen Sie jedes uterine Horn, die Eierstöcke sind proximal zu den Brustkorb präsentieren. Halten Sie die Eileiter mit feinen Zangen und schneiden Sie das Fett Superior der Eierstöcke mit Dissektion Schere (Abbildung 4). Dann entfernen Sie den Eierstock und Eileiter und legen in Sammlung Schale mit MEMα/BSA/FBS Medium. Hinweis: Wie in den Schritten 1 und 2 ist es unerlässlich, die Eierstöcke bei 37 ° C zu halten und zu pflegen um 5 % CO2. Ein Fliptop-Inkubator bis zu 5 % CO2 Mix angeschlossen kann verwendet werden, um optimale Wartung der Temperatur- und CO2 -Konzentration zu ermöglichen. Darüber hinaus sollte eine Temperatur geregelt-Glas-Bühne auch, Temperatur während der Eizelle Manipulation verwendet werden.</li>
	<li>Mit Hilfe einer 1 mL Spritze mit einem 27 G (oder ähnlicher Größe) oder scharfe Pinzette, reißen ein Loch in der Ampulle des Eileiters, die MII Eizellen freizugeben. Hinweis: Seien Sie vorsichtig, nicht zu beschädigen die Eizellen in der Ampulle. Der Ampulle erscheint geschwollen und durchscheinend, derart, dass die Eizellen sichtbar (Abbildung 4 sind).</li>
	<li>Ernten Sie MII Eizellen aus der Ampulle des Eileiters in eine neue Schale mit Sammlung Medium mit einer Mund-betrieben Glaspipette oder Kapillare oder einer handbetriebenen Mikrometer-Spritze (Abbildung 5).</li>
	<li>Fahren Sie mit Schritt 4 fort.</li>
</ol>(4) Eizelle Entblößung und Zona Pellucida entfernen
<ol><li>Bereiten Sie 300 IU/mL von Hyaluronidase in MEMα Medium ergänzt mit 3 mg/mL BSA zu Eizellen der umgebenden Kumuluszellen (2,5 mL/Maus) in ein Uhrglas und halten bei 37 ° C, 5 % CO2zu entblößen. Hinweis: Hyaluronidase Wirksamkeit sinkt stark nach 1 h der Vorbereitung. Für MII Eizellen ist Hyaluronidase Behandlung nicht erforderlich.</li>
	<li>Setzen Sie Eizelle-Cumulus Zelle komplexe bis 300 IU/mL von Hyaluronidase in MEMα/BSA 3 min um Eizellen der umgebenden Kumuluszellen entblößen aus. Achtung: Überschreiten Sie 3 min Exposition gegenüber Hyaluronidase, nicht, da es die Eizellen schädigen.</li>
	<li>Waschen Sie die Eizellen, transfer Eizellen zu einem frischen erwärmt MEMα/BSA mittlere Schüssel. Mit einem kleinen Mund betriebene Glaspipette oder Kapillare (etwas größer als der Durchmesser der Eizelle, die etwa 90 µm), pipette die komplexe oben und unten, um die Kumuluszellen vollständig zu lösen. Lassen Sie die Eizellen in den Inkubator zu erholen, während der Vorbereitung für den nächsten Schritt.</li>
	<li>Warmen sauren Tyrode-Lösung, MEMα/BSA und Waymouths Medien auf 37 ° C (500 µL/Maus). Platz 300 µL in jede Vertiefung der kleine 9-Brunnen Glasplatten.</li>
	<li>Entfernen Sie die Zona Pellucida (ZP) übertragen Sie 5 – 10 Eizellen in Tyrode Lösung. Setzen Sie die Eizellen für nur 30-45 s, um die Lösung. Hinweis: Zu wenig Kontakt mit der Lösung wird nicht die ZP vollständig entfernen, die die Eizellen platzen und Chromosomen Ausbreitung verhindert. Zu viel Belastung beschädigt und die Eizelle zu töten. ZP auflösen unter die Dissektion Mikroskop beobachten kann helfen bei der Optimierung der Belichtungszeit. Achtung: Mit frischen Tyrode-Lösung ist kritisch, da seine Funktion mit dem Alter abnimmt. Verwenden Sie einen frischen Brunnen Tyrode Lösung für jede Gruppe von Eizellen behandelt, um gleichmäßige Verdauung der ZP zu gewährleisten.</li>
	<li>Sofort nach dem ZP entfernen waschen Sie die Eizellen durch die Übertragung in erwärmten MEMα/BSA/FBS Medium. Wiederholen Sie dies waschen. Hinweis: Achten Sie bei der Übertragung von Eizellen leicht zusammenkleben und auf die Glaspipette oder Kapillare folgenden entfernen von der ZP. Vornässen der Glaspipette oder Kapillare in Waymouths Mediums werden Eizellen zusammenkleben minimieren.</li>
	<li>Und die Eizellen wieder für 30 Minuten in Waymouth Medium bei 37 ° C in einem 5 % CO2 Inkubator.</li>
	<li>Fahren Sie mit Schritt 5 fort.</li>
</ol>5. MI und MII Eizelle Chromatin Spreads
<ol><li>Zeichnen Sie mit einem PAP-Stift, ein 11 x 44 mm2 Rechteck auf der Glas-Folie, wie in Abbildung 6Agezeigt.</li>
	<li>Beschichten die Folie mit einer dünnen Schicht Fixativ (1 % Paraformaldehyd, 0,2 % Triton X 100 H2O, pH 9.2) durch Pipettieren 100 µL Fixativ auf der Folie und die Folie hin und her schaukeln. Tippen Sie auf die Folie um loszuwerden überschüssige Fixiermittel.</li>
	<li>Zwischen 5 bis 10 Eizellen mit einer kleinen Mund Pipette Nadel mit als wenig Medien wie möglich holen Sie ab und ziehen Sie die Nadel in einer Linie über die Fixiermittel-beschichtete Folie während der Hinterlegung der Eizellen von 1 cm oberhalb der Folie in die Fixativ Lösung. Führen Sie diesen Schritt mit einer Dissektion Mikroskop um sicherzustellen, dass die Eizellen hinterlegt worden sind und dass sie platzen, haben. Hinweis: Die Eizellen sollte sofort auf der Folie platzen. Die Höhe, bei der die Eizellen sind, hinterlegt Auswirkungen der Grad des Chromatins zu verbreiten. Repräsentative Ergebnisse in Abbildung 6 für weitere Details zu sehen.</li>
	<li>Inkubieren Sie Folien bei Raumtemperatur in einer geschlossenen Kammer befeuchtete über Nacht erlauben das Chromatin zu halten.</li>
	<li>Die Folien vollständig an der Luft trocknen lassen und abspülen Folien in einem Coplin Glas mit 50 mL 0,4 % Netzmittel-H2O, pH 8.0.</li>
	<li>Fahren Sie mit Schritt 6 fort.</li>
</ol>(6) Immunolabelling
<ol><li>Bereiten Sie die Antikörper-Verdünnungspuffer (ADB) in Tabelle 1beschrieben.</li>
	<li>Bereiten Sie zwei Coplin Gläser mit 50 mL Waschlösung Puffer (WB) (10 % ADB in PBS verdünnt) und einem Coplin JAR-Datei mit 50 mL WB und 0,05 % Reinigungslösung (z.B.50 mL WB 250 µL 10 % Waschmittel hinzufügen).</li>
	<li>Waschen Sie die Folien, die in Abschnitt 1 und 5 dieses Protokolls für 10 min in einem Coplin JAR-Datei mit 50 mL WB vorbereitet wurden. Achtung: Nicht lassen Sie die Folien, die zu jedem Zeitpunkt während der Immunolabelling trocknen.</li>
	<li>Waschen Sie die Objektträger für 10 min in der Coplin Glas mit 50 mL WB und 0,05 % Lauge. Waschen Sie die Folien in den verbleibenden Coplin JAR-Datei mit 50 mL WB-Lösung für 10 min.</li>
	<li>Tippen Sie auf überschüssige Flüssigkeit und Cover Folie mit 100 µL der ausgewählten Primärantikörper in ADB verdünnt. Bei 4 ° C über Nacht in einer geschlossenen feuchten Kammer inkubieren. Hinweis: Inkubation kann verkürzt werden, um 2 bis 3 Stunden bei 37 ° C. Verwenden Sie kleinere Mengen von Antikörpern (z.B. 50 µL) durch die Folie mit einem Deckglas oder Parafilm abdecken.</li>
	<li>Spülen Sie Folien in einem Coplin Glas mit 50 mL 0,2 % Netzmittel-PBS-Lösung, pH 8.0.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 6,2 bis 6,5.</li>
	<li>Tippen Sie auf überschüssige Flüssigkeit und Cover Folie mit 100 µL der ausgewählten Sekundärantikörper in ADB verdünnt. Inkubieren Sie Folien 1 bis 2 Stunden bei 37 ° C in einer geschlossenen feuchten Kammer.</li>
	<li>Waschen Sie Objektträger 2 Mal für 10 min in Coplin Gläser mit 50 mL 0,2 % Netzmittel-PBS-Lösung, pH 8.0.</li>
	<li>Waschen Sie Objektträger 2 Mal für 5 min in Coplin Gläser mit 50 mL 0,2 % Netzmittel-H2O Lösung, pH 8.0.</li>
</ol>7. Montage Folien
<ol><li>Für Prophase Chromatin Spreads vorbereitet in Schritt 2, hinzufügen 100 µL Eindeckmedium mit 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI, 1.5µg / mL). Für MI und MII Chromatin breitet sich bereit in Schritt 5, fügen 50 µL Eindeckmedium mit DAPI (1.5µg / mL). Tupfen Sie entfernt überschüssige Flüssigkeit.</li>
	<li>Ein 22 x 60 mm-Deckglas darauf legen und mit klaren Nagellack versiegeln. Speichern Sie in einer Folie Box bei 4 ° C oder-20 ° C bis zur Bewertung per Fluoreszenz-Mikroskopie. Hinweis: Tippen Sie leicht auf Deckglas, um überschüssige Eindeckmedium vor der Versiegelung mit Nagellack zu entfernen.</li>
</ol>

<ol>
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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Chromatin Ausbreitung Vorbereitungen erlauben Forschern, weiblichen Säugetieren Meiose und die dynamische Lokalisierung von Proteinen, chronologisch zu studieren. Die embryonalen und neonatale Chromatin-Spreads ermöglichen genaue Analyse von Veranstaltungen das ganze meiotischen Prophase. Metaphase I und Metaphase II Chromatin Spreads können verwendet werden, um einzelne Schwester unterscheiden Chromatiden von Schwestern und gepaarten Homologen Chromosomen gepaart sowie Diploidie zu beurteilen. Im Vergleich dazu, kann...

Während der Spermatogenese werden große halbsynchrone Wellen der meiotischen Keimzellen in den Hoden zu Beginn der Pubertät und im gesamten Erwachsenenalter1schnell und kontinuierlich aufgefüllt. Im Gegensatz zu den Männchen wird Meiose bei den Weibchen nur während der fetalen Entwicklung eingeleitet. Nach der Geburt, Eizellen bleiben verhaftet in einem längeren Dictyate Stadium der Prophase I mit einer intakten Germinal Vesicle (GV; Kernhülle) bis zur Pubertät. Zu Beginn der Pubertät eine Teilmenge der Eizellen werden zyklisch ausgewählt, um Wachstum und Reifung, Kennzeichnung der Einleitung der meiotischen Wiederaufnahme zu unterziehen. Meiotische Wiederaufnahme in ausgewachsene Eizellen manifestiert sich durch das Verschwinden der GV in einem Prozeß bekannt als Germinal Vesicle Aufschlüsselung (GVBD). Die Eizelle wird dann Chromosom Kondensation und Segregation, gefolgt von Polkörperchen Extrusion. Eizellen werden bei der Progression zu MII verhaftet und stimuliert die zweite und letzte meiotische Teilung nur nach der Befruchtung abgeschlossen.
Weibliche Fruchtbarkeit hängt stark von dem Erfolg der meiotischen Prophase ich fortschreiten. Der Schlüssel hierzu ist eine physische Verbindung zwischen Homologen Chromosomen bekannt als Chiasmata, die durch Reparatur der induzierten DNA-Doppelstrang Brüchen (DSB) über Crossover Rekombination2vermittelt wird. Dieser Vorgang erfolgt im Rahmen der dynamischen eiweißreichen leski bekannt als des synaptonemalen Komplexes (SC), die zwischen Homologen Chromosomen zur Erleichterung ihrer Synapsis3bildet. Der SC ist ein Reißverschluss dreigliedrige Struktur, die besteht aus zwei parallelen seitlichen Elementen verbunden durch Zentralregion Proteine, die homologe zusammen in der gesamten laufenden DNA-Reparatur hält. Vor der Synapsis bilden Vorstufen von den seitlichen Elementen, genannt axiale Elemente zwischen Schwester Chromatiden. Synaptonemalen Komplex Proteine wie SYCP2 und SYCP3 bilden axiale Elemente, die zu den Achsen der Schwester Chromatids Zusammenhalt während der frühen Prophase colocalize. Diese später dienen als Bindungsstellen für die transversale Filament-Protein, SYCP1, das zentrale Element Montage und Synapsis zwischen ausgerichteten homologe4erleichtert. Maus Eizellen ist komplette Synapsis durch die Anwesenheit von 20 komplett entnehmen Sie bitte, dass überlappende SYCP3 und SYCP1 Strecken, die visualisiert werden können, mithilfe von Chromatin Zubereitungen verbreiten. SYNAPSIS ist bei Eintritt in die Pachytene Unterphase abgeschlossen wobei Reife Frequenzweichen, die in Form Chiasmata zwischen homologen bestimmt sind mit MutL Homolog (MLH1/3) Dimere Förderung ihre präzise Verarbeitung5,6 verziert sind , 7. Bauunterhaltung der Chromosomen (SMC) komplexe, einschließlich Cohesin, condensin und die SMC5/6-Komplex, sind wichtig für die Regulierung des Chromosoms Dynamik und Struktur im gesamten Meiose8,9, 10,11,12. Gemeinsam sorgen diese Ereignisse korrekte Bi-Ausrichtung der Homologen Chromosomen an den gegnerischen Spindel Polen nach Demontage des SC.
Die meiotische Zellzyklus ist ein leistungsfähiges Modell, die Rollen der verschiedenen Proteine im Genom Wartung aufgrund der programmierten Induktion und anschließende Reparatur der DNA DSB zu untersuchen. Säugetier-Meiose ist darüber hinaus auch eine relevante Modell für die Untersuchung von epigenetischen Modifikationen und Prägung13. Jedoch ist es technisch schwierig, bewerten diese Ereignisse während weibliche Meiose stattfindet in fetalen und neonatalen Eierstöcke bei Säugetieren (Abbildung 1). In 5 Subverteiler teilbar Prophase: Leptonema, Zygonema, Pachynema, Diplonema und Dictyate. Hier beschreiben wir, wie zu isolieren und zu unterscheiden zwischen fetalen und neonatalen Eierstöcke und Hoden (Abbildung 2). Adaptiert von zuvor beschriebenen Methoden, diese Handschrift auch beschreibt ein Protokoll (Schritt 1) mit video-Demonstration für die Vorbereitung der weiblichen meiotischen Prophase ich Chromatin breitet sich14,15,16,17 . Verbindung mit Immunolabelling, wie beschrieben in Schritte 6 und 7, dieses Protokoll ermöglicht detaillierte mikroskopische Analyse der Prophase ich Ereignisse in Eizellen.
Oogenese ist fehleranfällig und Chromosom Missegregation Ereignisse während der ersten meiotischen Teilung stellen die häufigste Quelle der genetischen Krankheit Nachkommen18,19. In diesem Manuskript (Protokoll (Schritt 2) beschreiben wir ein Protokoll, in dem grundiert Eierstöcke von Erwachsenen weiblichen Mäusen Reife GV inszeniert Eizellen entnommen sind. Unterstützende Bedingungen werden ausgewachsene Eizellen luteinisierendes Hormon-unabhängigen Wiederaufnahme der Meiose nach Isolation und Kultur20unterzogen. Nach meiotische Wiederaufnahme Eizellen durch Meiose ich Fortschritt, dann in Metaphase II zu verhaften. Eizellen bleiben in Metaphase II, verhaftet, wenn befruchtet. In den Schritten 2 – 5 passen wir uns zuvor aufgezeichneten Protokolle mit video-Demonstration zu beschreiben, wie zu sammeln, Kultur und Chromatin verteilt Vorbereitungen21MI und MII Eizellen vorbereiten. Dieser Chromatin Verbreitung Technik ermöglicht eine klare Immunolabelling der Proteine Chromosomen zugeordnet. Darüber hinaus dieses Protokoll kann auch zur Unterscheidung zwischen bivalenten und einwertigen Chromosomen und lösen weitere einzelne Schwester Chromatiden Bewertung der Eizelle Diploidie zu erleichtern. Daher kann dieses Protokoll neben enthüllt Lokalisierung Muster der meiotischen Proteine, auch als ein unschätzbares Werkzeug für die Aufklärung der Ursachen von Chromosom Missegregation während MI und MII dienen.

<table><tbody><tr><td>10X Phosphate buffered saline (PBS) pH 7.4</td><td>Quality Biological</td><td>119-069-161</td><td></td></tr><tr><td>60 mm x 15 mm petri dishes</td><td>Denville</td><td>T1106</td><td></td></tr><tr><td>35mm x 12mm petri dishes</td><td>Denville</td><td>T1103</td><td></td></tr><tr><td>Fine forceps</td><td>VWR</td><td>300-050</td><td></td></tr><tr><td>Micro dissection scissors</td><td>Ted Pella</td><td>1340</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting&amp;nbsp;scissors, sharp tip, 41/2&quot;</td><td>VWR</td><td>82027-578</td><td></td></tr><tr><td>Watch glass square 1 5/8</td><td>Carolina Biological Supply Company</td><td>742300</td><td>Autoclave before each use</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma</td><td>S8501</td><td></td></tr><tr><td>Trisodium Citrate Dihydrate</td><td>Sigma</td><td>S1804</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>1,4-Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma</td><td>646563</td><td>Add to hypotonic buffer immediately before use</td></tr><tr><td>50x Protease Inhibitor</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td>Add to hypotonic buffer immediately before use</td></tr><tr><td>Turberculin syringe with needle (1cc, 27 G x 1/2 in)</td><td>Becton, Dickinson (BD)</td><td>309623</td><td></td></tr><tr><td>Gold seal ultra frost glass slides (25X75mm, 1mm thick)</td><td>Thermo</td><td>3063-002</td><td></td></tr><tr><td>Super PAP pen, large (liquid blocker)</td><td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td><td>71310</td><td></td></tr><tr><td>16% Paraformaldehyde aqueous</td><td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td>Detergent in manuscript</td></tr><tr><td>Immuno stain moisture chamber</td><td>Evergreen</td><td>240-9020-Z10</td><td></td></tr><tr><td>Coplin jars</td><td>Fisher</td><td>08-815</td><td></td></tr><tr><td>Photo-flo 200</td><td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td><td>74257</td><td>Wetting agent in manuscript</td></tr><tr><td>Pregnant mare serum gonadotropin (PMSG)</td><td>Sigma</td><td>G4877</td><td>Store aliquots at -20C</td></tr><tr><td>Human chorionic gonadotropin (HCG)</td><td>Sigma</td><td>C0434</td><td>Store aliquots at -20C</td></tr><tr><td>PYREX Spot Plates with nine concave cavities</td><td>Fisher</td><td>13-748B</td><td>Autoclave before each use</td></tr><tr><td>Glass capillary</td><td>Fisher</td><td>22260943</td><td>For making oocyte collection needles</td></tr><tr><td>Brand Parafilm M</td><td>Sigma</td><td>BR701501</td><td>For making oocyte collection needles</td></tr><tr><td>Latex rubber tubing (3.2 mm inner diameter x 6.4 mm outer diameter)</td><td>Fisher</td><td>14-178-5B</td><td>For making oocyte collection needles</td></tr><tr><td>Latex rubber tubing (6.4 mm inner diameter x 11.1 mm outer diameter)</td><td>Fisher</td><td>14-178-5D</td><td>For making oocyte collection needles</td></tr><tr><td>Flexible silicone rubber nosepiece, hard plastic mouthpiece and 15 inches of latex tubing</td><td>Sigma</td><td>A5177-5EA</td><td>For making oocyte collection needles</td></tr><tr><td>Mitutoyo micrometer head</td><td>Mituoyo</td><td>150-208</td><td>For making oocyte collection needles</td></tr><tr><td>Syringe 5 mL</td><td>BD Biosciences</td><td>309646</td><td>For making oocyte collection needles</td></tr><tr><td>Syringe filter 0.45 &amp;mu;m filter</td><td>Corning</td><td>431220</td><td>For making oocyte collection needles</td></tr><tr><td>Glass Pasteur Pipette 5 3/4&quot;</td><td>Fisher</td><td>13-678-6A</td><td>For making oocyte collection needles</td></tr><tr><td>83 x 0.5 mm pipette tip</td><td>Denville</td><td>P3080</td><td>For making oocyte collection needles</td></tr><tr><td>&amp;alpha;-MEM</td><td>Invitrogen</td><td>11415049</td><td></td></tr><tr><td>Waymouth&#039;s media</td><td>Life Technologies</td><td>11220035</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Fisher</td><td>A3160602</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A3311</td><td>For oocyte culture media</td></tr><tr><td>500ml filter units 0.22um</td><td>Denville</td><td>F5227</td><td></td></tr><tr><td>Hyaluronidase</td><td>Sigma</td><td>H3506</td><td></td></tr><tr><td>Tyrode&amp;rsquo;s solution</td><td>Sigma</td><td>T1788</td><td>Store aliquots at -20C</td></tr><tr><td>Horse serum</td><td>Sigma</td><td>H-1270</td><td>For ADB/wash buffer</td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A1470</td><td>For ADB/wash buffer</td></tr><tr><td>VECTASHIELD antifade mounting medium with DAPI</td><td>Vector Labs</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Microscope cover slides (22mmx60mm)</td><td>Fisher</td><td>12-544-G</td><td></td></tr><tr><td>Clear nail polish</td><td>Amazon</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Microscopes&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SteREO Discovery.V8</td><td>Zeiss</td><td>495015-0001-000</td><td></td></tr><tr><td>Observer Z1</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Primary Antibodies&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-MLH1</td><td>Life Technologies</td><td>MA5-15431</td><td>Dilution factor- 1:100</td></tr><tr><td>Rabbit anti-SYCP1</td><td>Life Technologies</td><td>PA1-16763</td><td>Dilution factor- 1:1000</td></tr><tr><td>Goat anti-SCP3</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-20845</td><td>Dilution factor- 1:50</td></tr><tr><td>Human anti-centromere protein</td><td>Antibodies Incorporated</td><td>15-235</td><td>Dilution factor- 1:100</td></tr><tr><td>Rabbit anti- TOPOII</td><td>Abcam</td><td>ab109524</td><td>Dilution factor- 1:100</td></tr><tr><td>Mouse anti-Histone H4 (di methyl K20, tri methyl K20)</td><td>Abcam</td><td>ab78517</td><td>Dilution factor- 1:500</td></tr><tr><td>Rabbit anti-Rec8</td><td>Courtesy of Dr. Karen Schindler</td><td>N/A</td><td>Dilution factor- 1:10,000</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Secondary Antibodies&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Donkey anti-goat IgG (H+L) Alexa Fluor 568 conjugate</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>A-11057</td><td>Dilution factor- 1:500</td></tr><tr><td>Donkey anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 488 conjugate</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>A-21202</td><td>Dilution factor- 1:500</td></tr><tr><td>Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 647 conjugate</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>A-31573</td><td>Dilution factor- 1:500</td></tr><tr><td>Goat anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 568 conjugate</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>A-11004</td><td>Dilution factor- 1:500</td></tr><tr><td>Goat anti-Human IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>A-11013</td><td>Dilution factor- 1:500</td></tr><tr><td>Goat anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 568 conjugate</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>A-11011</td><td>Dilution factor- 1:500</td></tr></tbody></table>

chromatin spread preparations for the analysis of mouse oocyte progression from prophase to metaphase ii

Chromatin verbreitete Techniken haben am meisten benutzt, die dynamische Lokalisierung verschiedener Proteine während der Gametogenese, insbesondere für die Spermatogenese zu beurteilen. Diese Techniken ermöglichen für die Visualisierung von Protein- und DNA-Lokalisierung Muster bei meiotische Veranstaltungen wie homologe Chromosom Paarung, Synapsis und DNA zu reparieren. Während einige Protokolle in der Literatur beschrieben wurden, sind allgemeine Chromatin verbreitete Techniken mit Säugetieren Prophase Eizellen begrenzt und schwierig aufgrund des Zeitpunkts der Meiose Initiation in fetalen Ovarien. Im Vergleich dazu können Jugendliche männliche Mäuse mit höheren Erträgen ohne Mikrodissektion Prophase Spermatozyten abgeholt werden. Es ist jedoch schwierig, eine reine synchronisierte Population von Zellen in bestimmten Phasen aufgrund der Heterogenität der meiotischen und Post-meiotische Keim-Zell-Populationen in den Jugendlichen und Erwachsenen Hoden zu erhalten. Für die späteren Phasen der Meiose ist es vorteilhaft, die Eizellen durchläuft Meiose I (MI) oder Meiose II (MII), weil Gruppen von reifen Eizellen können von Erwachsenen weiblichen Mäusen gesammelt und wieder Meiose in Kultur angeregt zu beurteilen. Hier Methoden für meiotische Chromatin verteilt Vorbereitungen mit Eizellen seziert von fötale, neonatale und Erwachsenen Eierstöcke sind beschrieben mit dem dazugehörigen video-Demonstrationen. Chromosom Missegregation Veranstaltungen in Säugetieren Eizellen sind häufig, besonders während MI. Diese Techniken können verwendet werden, zu bewerten und zu charakterisieren, die Auswirkungen der verschiedenen Mutationen oder Umwelteinflüsse während der verschiedenen Stadien der Oogenese. Da gibt es deutliche Unterschiede zwischen Oogenese und Spermatogenese, sind die Techniken beschrieben wurden, innerhalb von unschätzbarem Wert für unser Verständnis von Säugetieren Oogenese und sexuell dimorphen Eigenschaften des Chromosoms und Protein Dynamik während der Meiose zu erhöhen .

Wir haben zwei Techniken zur Visualisierung und Bewertung meiotische Chromosomen in Eizellen beschrieben. Die erste Technik ist gesorgt, in Richtung Prophase Fortschreiten in embryonalen und neonatale Eierstöcke beurteilen. Prophase Chromatin Ausbreitung Vorbereitungen sind unglaublich wertvoll für zahlreiche dynamische Prozesse während der Meiose, einschließlich Chromosom Paarung, Synapsis visualisieren und desynapsis, homologe Rekombination und epigenetische Chromosom Umbau. Hier ze...

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Chromatin-Spread-Präparate für die Analyse der Entwicklung von Maus-Oozyten von der Prophase zur Metaphase II | Genetik | Video

Chromatin Spread Preparations for the Analysis of Mouse Oocyte Progression from Prophase to Metaphase II

Chromatin verteilt die Vorbereitungen für die Analyse der Maus Eizelle Progression von Prophase, Metaphase II

Oogenese bei Säugetieren ist bekanntermaßen anfällig für Fehler, vor allem auf Chromosom Missegregation. Dieses Manuskript beschreibt Chromatin verteilt Präparationsmethoden für Maus Prophase, Metaphase I und II inszeniert Eizellen. Diese grundlegenden Techniken ermöglichen die Untersuchung der Chromatin-gebundene Proteine und Chromosom Morphologie in Säugetieren Oogenese.

Chromatin spread techniques have been widely used to assess the dynamic localization of various proteins during gametogenesis, particularly for ...

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Universidad de Cartagena UDEC

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Meiosis

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15.3K Aufrufe.  Johns Hopkins University Bloomberg School of Public Health. Oogenese bei Säugetieren ist bekanntermaßen anfällig für Fehler, vor allem auf Chromosom Missegregation. Dieses Manuskript beschreibt Chromatin verteilt Präparationsmethoden für Maus Prophase, Metaphase I und II inszeniert Eizellen. Diese grundlegenden Techniken ermöglichen die Untersuchung der Chromatin-gebundene Proteine und Chromosom Morphologie in Säugetieren Oogenese.

Serie: Chromatin Spread Preparations for the Analysis of Mouse Oocyte Progression from Prophase to Metaphase II

Isolation and Characterization of Mouse Antral Oocytes Based on Nucleolar Chromatin Organization

This protocol describes a simple and quick method to isolate and characterize mouse antral GV (Germinal Vesicle) oocytes as able (SN, Surrounded Nucleolus) or unable (NSN, Not Surrounded Nucleolus) to develop to the blastocyst stage after in vitro maturation (IVM) and in vitro fertilization (IVF). It makes use of Hoeschst33342 (or any other DNA intercalating dye) able to bind to the heterochromatin of the nucleolus showing a ring in the SN oocytes or not, like in the NSN oocytes. This represents the easiest and quickest way to sort both antral oocytes that can be eventually used for IVM or IVF procedures. 
Briefly, the protocol consists of the following steps: hormone injection to stimulate follicular growth; isolation of the oocytes at the GV stage from the antral compartment by puncturing the ovary with a sterile needle; preparation of thin glass pipettes for mouth pipetting of the oocytes; sorting of the oocytes with Hoechst33342 prepared at a supravital concentration; IVM, IVF or any other molecular/cellular analysis.
Unfortunately there are still few evidences to sort SN and NSN oocytes using less invasive techniques. If and once they will be identified, they could be potentially applied to human assisted reproductive technologies, although with several aspects that should be modified. To date, this technique has potential implications to dramatically increase IVM and IVF successful procedures in both endangered and species with economic interest.

Here we present a protocol for the characterization of mouse antral oocytes based on nucleolar organization.

Isolierung und Charakterisierung von Maus Antral Oozyten Basierend auf Nucleolar Chromatinorganisation

This protocol describes a simple and quick method to isolate and characterize mouse antral GV (Germinal Vesicle) oocytes as able (SN, Surrounded ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Using Mouse Oocytes to Assess Human Gene Function During Meiosis I

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively correlated with maternal age, age alone is not always predictive of the risk of generating an aneuploid embryo. Therefore, gene variants might account for incorrect chromosome segregation during oogenesis. Given that access to human oocytes is limited for research purposes, a series of assays were developed to study human gene function during meiosis I using mouse oocytes. First, messenger RNA (mRNA) of the gene and gene variant of interest are microinjected into prophase I-arrested mouse oocytes. After allowing time for expression, oocytes are synchronously released into meiotic maturation to complete meiosis I. By tagging the mRNA with a sequence of a fluorescent reporter, such as green fluorescent protein (Gfp), the localization of the human protein can be assessed in addition to the phenotypic alterations. For example, gain or loss of function can be investigated by establishing experimental conditions that challenge the gene product to fix meiotic errors. Although this system is advantageous in investigating human protein function during oogenesis, adequate interpretation of results should be undertaken given that protein expression is not at endogenous levels and, unless controlled for (i.e. knocked out or down), murine homologs are also present in the system.

As the genetic variants associated with human disease begin to become uncovered, it is becoming increasingly important to develop systems with which to rapidly evaluate the biological significance of those identified variants. This protocol describes methods for evaluating human gene function during female meiosis I using mouse oocytes.

Mit Maus Eizellen menschliche Gen-Funktion während der Meiose zu beurteilen ich

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively ...

Genetik

Analysis of Chromosome Segregation, Histone Acetylation, and Spindle Morphology in Horse Oocytes

The field of assisted reproduction has been developed to treat infertility in women, companion animals, and endangered species. In the horse, assisted reproduction also allows for the production of embryos from high performers without interrupting their sports career and contributes to an increase in the number of foals from mares of high genetic value. The present manuscript describes the procedures used for collecting immature and mature oocytes from horse ovaries using ovum pick-up (OPU). These oocytes were then used to investigate the incidence of aneuploidy by adapting a protocol previously developed in mice. Specifically, the chromosomes and the centromeres of metaphase II (MII) oocytes were fluorescently labeled and counted on sequential focal plans after confocal laser microscope scanning. This analysis revealed a higher incidence in the aneuploidy rate when immature oocytes were collected from the follicles and matured in vitro compared to in vivo. Immunostaining for tubulin and the acetylated form of histone four at specific lysine residues also revealed differences in the morphology of the meiotic spindle and in the global pattern of histone acetylation. Finally, the expression of mRNAs coding for histone deacetylases (HDACs) and acetyl-transferases (HATs) was investigated by reverse transcription and quantitative-PCR (q-PCR). No differences in the relative expression of transcripts were observed between in vitro and in vivo matured oocytes. In agreement with a general silencing of the transcriptional activity during oocyte maturation, the analysis of the total transcript amount can only reveal mRNA stability or degradation. Therefore, these findings indicate that other translational and post-translational regulations might be affected.
Overall, the present study describes an experimental approach to morphologically and biochemically characterize the horse oocyte, a cell type that is extremely challenging to study due to low sample availability. However, it can expand our knowledge on the reproductive biology and infertility in monovulatory species.

This manuscript describes an experimental approach to morphologically and biochemically characterize horse oocytes. Specifically, the present work illustrates how to collect immature and mature horse oocytes by ultrasound-guided ovum pick-up (OPU) and how to investigate chromosome segregation, spindle morphology, global histone acetylation, and mRNA expression.

Analyse der Chromosomensegregation, Histonacetylierung und Spindelmorphologie in Pferdeozyten

The field of assisted reproduction has been developed to treat infertility in women, companion animals, and endangered species. In the horse, assisted ...

Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Zebrafish Spermatocytes

Meiosis is the key cellular process required to create haploid gametes for sexual reproduction. Model organisms have been instrumental in understanding the chromosome events that take place during meiotic prophase, including the pairing, synapsis, and recombination events that ensure proper chromosome segregation. While the mouse has been an important model for understanding the molecular mechanisms underlying these processes, not all meiotic events in this system are analogous to human meiosis. We recently demonstrated the exciting potential of the zebrafish as a model of human spermatogenesis. Here we describe, in detail, our methods to visualize meiotic chromosomes and associated proteins in chromosome spread preparations. These preparations have the advantage of allowing high resolution analysis of chromosome structures. First, we describe the procedure for dissecting testes from adult zebrafish, followed by cell dissociation, lysis, and spreading of the chromosomes. Next, we describe the procedure for detecting the localization of meiotic chromosome proteins, by immunofluorescence detection, and nucleic acid sequences, by fluorescence in situ hybridization (FISH). These techniques comprise a useful set of tools for the cytological analysis of meiotic chromatin architecture in the zebrafish system. Researchers in the zebrafish community should be able to quickly master these techniques and incorporate them into their standard analyses of reproductive function.

Nuclear surface spreads are an indispensable tool for studying chromosome events during meiosis. Here we demonstrate a method to prepare and visualize meiotic chromosomes during prophase I from zebrafish spermatocytes.

Zubereitung von meiotischen Chromosomenaufstrichen aus Zebrafisch Spermatozyten

Meiosis is the key cellular process required to create haploid gametes for sexual reproduction. Model organisms have been instrumental in understanding ...

Evaluation of the Spindle Assembly Checkpoint Integrity in Mouse Oocytes

Aneuploidy is the leading genetic abnormality causing early miscarriage and pregnancy failure in humans. Most errors in chromosome segregation that give rise to aneuploidy occur during meiosis in oocytes, but why oocyte meiosis is error-prone is still not fully understood. During cell division, cells prevent errors in chromosome segregation by activating the spindle assembly checkpoint (SAC). This control mechanism relies on detecting kinetochore (KT)-microtubule (MT) attachments and sensing tension generated by spindle fibers. When KTs are unattached, the SAC is activated and prevents cell-cycle progression. The SAC is activated first by MPS1 kinase, which triggers the recruitment and formation of the mitotic checkpoint complex (MCC), composed of MAD1, MAD2, BUB3, and BUBR1. Then, the MCC diffuses into the cytoplasm and sequesters CDC20, an anaphase-promoting complex/cyclosome (APC/C) activator. Once KTs become attached to microtubules and chromosomes are aligned at the metaphase plate, the SAC is silenced, CDC20 is released, and the APC/C is activated, triggering the degradation of Cyclin B and Securin, thereby allowing anaphase onset. Compared to somatic cells, the SAC in oocytes is not as effective because cells can undergo anaphase despite having unattached KTs. Understanding why the SAC is more permissive and if this permissiveness is one of the causes of chromosome segregation errors in oocytes still needs further investigation. The present protocol describes the three techniques to comprehensively evaluate SAC integrity in mouse oocytes. These techniques include using nocodazole to depolymerize MTs to evaluate the SAC response, tracking SAC silencing by following the kinetics of Securin destruction, and evaluating the recruitment of MAD2 to KTs by immunofluorescence. Together these techniques probe mechanisms needed to produce healthy eggs by providing a complete evaluation of SAC integrity.

Error in chromosome segregation is a common feature in oocytes. Therefore, studying the spindle assembly checkpoint gives important clues about the mechanisms needed to produce healthy eggs. The present protocol describes three complementary assays to evaluate spindle assembly checkpoint integrity in mouse oocytes.

Evaluation der Integrität des Spindel-Assemblierungs-Checkpoints in Maus-Eizellen

Aneuploidy is the leading genetic abnormality causing early miscarriage and pregnancy failure in humans. Most errors in chromosome segregation that give ...

Mouse Oocyte Microinjection, Maturation and Ploidy Assessment

Mistakes in chromosome segregation lead to aneuploid cells. In somatic cells, aneuploidy is associated with cancer but in gametes, aneuploidy leads to infertility, miscarriages or developmental disorders like Down syndrome. Haploid gametes form through species-specific developmental programs that are coupled to meiosis. The first meiotic division (MI) is unique to meiosis because sister chromatids remain attached while homologous chromosomes are segregated. For reasons not fully understood, this reductional division is prone to errors and is more commonly the source of aneuploidy than errors in meiosis II (MII) or than errors in male meiosis 1,2. 
In mammals, oocytes arrest at prophase of MI with a large, intact germinal vesicle (GV; nucleus) and only resume meiosis when they receive ovulatory cues. Once meiosis resumes, oocytes complete MI and undergo an asymmetric cell division, arresting again at metaphase of MII. Eggs will not complete MII until they are fertilized by sperm. Oocytes also can undergo meiotic maturation using established in vitro culture conditions 3. Because generation of transgenic and gene-targeted mouse mutants is costly and can take long periods of time, manipulation of female gametes in vitro is a more economical and time-saving strategy. 
Here, we describe methods to isolate prophase-arrested oocytes from mice and for microinjection. Any material of choice may be introduced into the oocyte, but because meiotically-competent oocytes are transcriptionally silent 4,5 cRNA, and not DNA, must be injected for ectopic expression studies. To assess ploidy, we describe our conditions for in vitro maturation of oocytes to MII eggs. Historically, chromosome-spreading techniques are used for counting chromosome number 6. This method is technically challenging and is limited to only identifying hyperploidies. Here, we describe a method to determine hypo-and hyperploidies using intact eggs 7-8. This method uses monastrol, a kinesin-5 inhibitor, that collapses the bipolar spindle into a monopolar spindle 9 thus separating chromosomes such that individual kinetochores can readily be detected and counted by using an anti-CREST autoimmune serum. Because this method is performed in intact eggs, chromosomes are not lost due to operator error.

Oocytes are prone to aneuploidy due to errors in chromosome segregation during meiotic maturation. Aneuploid eggs can cause infertility, miscarriages or developmental disorders like Down syndrome. Here, we describe methods to introduce materials of choice into oocytes and methods to study meiotic maturation and assess ploidy.

Maus Oocyte Mikroinjektion, Reifung und Ploidie Beurteilung

Mistakes in chromosome segregation lead to aneuploid cells.  In somatic cells, aneuploidy is associated with cancer but in gametes, aneuploidy leads to ...

Biologie

A Cell Free Assay to Study Chromatin Decondensation at the End of Mitosis

During the vertebrate cell cycle chromatin undergoes extensive structural and functional changes. Upon mitotic entry, it massively condenses into rod shaped chromosomes which are moved individually by the mitotic spindle apparatus. Mitotic chromatin condensation yields chromosomes compacted fifty-fold denser as in interphase. During exit from mitosis, chromosomes have to re-establish their functional interphase state, which is enclosed by a nuclear envelope and is competent for replication and transcription. The decondensation process is morphologically well described, but in molecular terms poorly understood: We lack knowledge about the underlying molecular events and to a large extent the factors involved as well as their regulation. We describe here a cell-free system that faithfully recapitulates chromatin decondensation in vitro, based on mitotic chromatin clusters purified from synchronized HeLa cells and X. laevis egg extract. Our cell-free system provides an important tool for further molecular characterization of chromatin decondensation and its co-ordination with processes simultaneously occurring during mitotic exit such as nuclear envelope and pore complex re-assembly.

The molecular mechanisms of the decondensation of highly compacted mitotic chromatin are ill-defined. We present a cell-free assay based on mitotic chromatin clusters isolated from HeLa cells and Xenopus laevis egg extract that faithfully reconstitutes the decondensation process in vitro.

Ein zellfreien Assay zu Chromatindekondensation Studieren am Ende der Mitose

During the vertebrate cell cycle chromatin undergoes extensive structural and functional changes. Upon mitotic entry, it massively condenses into rod ...

Meiotic Spindle Assessment in Mouse Oocytes by siRNA-mediated Silencing

Errors in chromosome segregation during meiotic division in gametes can lead to aneuploidy that is subsequently transmitted to the embryo upon fertilization. The resulting aneuploidy in developing embryos is recognized as a major cause of pregnancy loss and congenital birth defects such as Down&#8217;s syndrome. Accurate chromosome segregation is critically dependent on the formation of the microtubule spindle apparatus, yet this process remains poorly understood in mammalian oocytes. Intriguingly, meiotic spindle assembly differs from mitosis and is regulated, at least in part, by unique microtubule organizing centers (MTOCs). Assessment of MTOC-associated proteins can provide valuable insight into the regulatory mechanisms that govern meiotic spindle formation and organization. Here, we describe methods to isolate mouse oocytes and deplete MTOC-associated proteins using a siRNA-mediated approach to test function. In addition, we describe oocyte fixation and immunofluorescence analysis conditions to evaluate meiotic spindle formation and organization.

Here, we present a protocol for specific siRNA-mediated mRNA depletion followed by immunofluorescence analysis to evaluate meiotic spindle assembly and organization in mouse oocytes. This protocol is suitable for in vitro depletion of transcripts and functional assessment of different spindle and/or MTOC-associated factors in oocytes.

Meiotischen Spindel Assessment in Maus-Oozyten von siRNA-vermittelte Silencing

Errors in chromosome segregation during meiotic division in gametes can lead to aneuploidy that is subsequently transmitted to the embryo upon ...

Techniques for Imaging Prometaphase and Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes

Chromosome segregation in human oocytes is error prone, resulting in aneuploidy, which is the leading genetic cause of miscarriage and birth defects. The study of chromosome behavior in oocytes from model organisms holds much promise to uncover the molecular basis of the susceptibility of human oocytes to aneuploidy. Drosophila melanogaster is amenable to genetic manipulation, with over 100 years of research, community, and technique development. Visualizing chromosome behavior and spindle assembly in Drosophila oocytes has particular challenges, however, due primarily to the presence of membranes surrounding the oocyte that are impenetrable to antibodies. We describe here protocols for the collection, preparation, and imaging of meiosis I spindle assembly and chromosome behavior in Drosophila oocytes, which allow the molecular dissection of chromosome segregation in this important model organism.

Techniques for Imaging Prometaphase and Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes

We present protocols for the collection, preparation, and imaging of mature Drosophila oocytes. These methods allow the visualization of chromosome behavior and spindle assembly and function during meiosis.

Techniques for Imaging Prometaphase und Metaphase der Meiose I in fester<em&gt; Drosophila</em&gt; Oozyten

Chromosome segregation in human oocytes is error prone, resulting in aneuploidy, which is the leading genetic cause of miscarriage and birth defects. The ...

Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Mouse Spermatocytes

Mammalian meiosis is a dynamic developmental process that occurs in germ cells and can be studied and characterized. Using a method to spread nuclei on the surface of slides (rather than dropping them from a height), we demonstrate an optimized technique on mouse spermatocytes that was first described in 1997. This method is widely used in laboratories to study mammalian meiosis because it yields a plethora of high quality nuclei undergoing substages of prophase I. Seminiferous tubules are first placed in a hypotonic solution to swell spermatocytes. Then spermatocytes are released into a sucrose solution to create a cell suspension, and nuclei are spread onto fixative-soaked glass slides. Following immunostaining, a diversity of proteins germane to meiotic processes can be examined. For example, proteins of the synaptonemal complex, a tripartite structure that connects the chromosome axes/cores of homologs together can be easily visualized. Meiotic recombination proteins, which are involved in repair of DNA double-strand breaks by homologous recombination, can also be immunostained to evaluate progression of prophase I. Here we describe and demonstrate in detail a technique widely used to study mammalian meiosis in spermatocytes from juvenile or adult male mice.

Meiosis is the developmental process by which gametes are formed through a single round of DNA replication and two successive rounds of chromosome segregation. Mammalian meiosis can be examined by utilizing a technique to prepare meiotic chromosome spreads. Here, we demonstrate a method of preparing surface-spread nuclei from mouse spermatocytes.

Vorbereitung der meiotischen Chromosom erstreckt sich von Maus Spermatozyten

Mammalian meiosis is a dynamic developmental process that occurs in germ cells and can be studied and characterized. Using a method to spread nuclei on ...