著者は、アビゲイル ・ ハリス ・の技術的な支援を認めます。彼らはまたマウス精母細胞から表面拡散核の準備のプロトコルを最適化するを助けるためポーラ ・ コーエン、キム ・ ホロウェイを認めます。著者は、カレン シンドラーによって原稿の批判的読解を感謝しています。
この作品は NIH R01 GM106262 K.M.B. に支えられ

マウスを含むすべてのメソッドは高い倫理や福祉の基準を利用し、機関動物ケアとドレクセル大学医学部利用委員会によって承認されました。
1. ソリューションおよび必要な機器の準備
<ol><li>50 mL の超純水研究室グレード水、pH 8.2 8.4 (表 1) に低張性抽出バッファー (HEB) を準備します。新鮮な氷の上各時間を維持し、スプレッド; を準備する 2 時間以内使用ソリューションします。これを減らすとそれぞれ, PMSF と DTT の活動を阻害するプロテアーゼを最適化するために必要です。マウス精巣のペアごとに HEB の 10 mL を使用します。</li>
	<li>グレード水スクロースの 0.342 g を 10 mL の超純水の検査に追加することにより 100 mM ショ糖液 (たび新鮮な) を準備します。8.2 に pH を合わせなさい</li>
	<li>固定液を準備 (1% パラホルムアルデヒド (PFA)、0.15% トリトン X-100、pH 9.2 1 N の HCl と 1 N NaOH を) 新鮮な毎月とストア部屋の温度で、それは光から保護します。16% 市販 PFA 開始在庫作業在庫として使用するため 1x PBS で 4% に希釈し、-20 ° C で 4% 因数を保存<ol>
<li>固定液を準備する 4 %pfa 溶液 10 mL と 10% の 600 μ L を追加 30 mL の 1x PBS にトリトン X-100 ミックスも、1 N の HCl と 1 N NaOH 9.2 に pH を調整します。(4 週間以上) の部屋の温度でアルミ箔に包まれた 50 mL の円錐管に固定液を格納します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>写真 Flo 200 洗浄溶液 (スライドは、最後の 30 分を乾燥、) 間の準備: 0.4% 写真 Flo 200/PBS (80 mL の 1x PBS の中に写真 Flo 200 320 μ L) と 0.4% 写真 Flo 200/dH2O (超高純度研究所グレード水 40 ml に写真 Flo 200 160 μ L)。40 ml ソリューションの 50 mL Coplin jar を使用して、一度に 10 個以下のスライドを洗浄します。</li>
	<li>次の楽器の準備: (皮膚を切開) に手術用はさみの 1 ペア ファインチップ外科はさみ (腹膜を切開) に、1 組 2 組 (それぞれの精巣を解剖) をまっすぐファインチップ鉗子の (それぞれの精巣を切開) に 1 ストレート エッジかみそりの刃、(それぞれの精巣を固定し、, 精細管内を絞り出す) にヒント鉗子の 2 組、50 mL Coplin jar、テフロン印刷 3 リング スライド、サイズ 11 刃、加湿チャンバー、100 × 15 mm ペトリ皿、ファインチップ永久的なマーカーや鉛筆で 1 メスとプラットフォーム回転シェーカー。<ol>
<li>場所プレミアム中性 precleaned 使用するまで固定液でいっぱい 50 mL Coplin jar に直立曇らされた最後ガラス スライドです。 注: スライドはその後エタノール、蛍光の in situハイブリダイゼーションなどを必要とする手続きに使用する場合は、鉛筆は最寄り。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 精母細胞核拡散
<ol><li>制度のガイドライン (例えば頚部転位 CO2窒息の有無) によると男性マウスを安楽死させます。</li>
	<li>使用 P10 - P20 男性精子; の最初の波で減数分裂の細胞を評価するには我々 は日常的に P15 を使用 - P17 男性成人の精巣は、前期 i すべてのサブステージからセルを取得するセル前期から私が、彼らはまたより postmeiotic の細胞などの細胞が得られます。</li>
	<li>収穫し、重量 (ペアの重量を記録) 精巣;湿潤を保つために冷たい HEB の数滴を含むシャーレに置き、それら。</li>
	<li>鉗子先端が曲線状で皿の底に対して精巣を保持して精巣のカプセルを小さな垂直正中線切開にストレート エッジかみそりの刃を使用します。1 つの鉗子で、皿の底に対して精巣を押したまま、精巣の精細管を軽く圧迫するのに湾曲した先端の鉗子やストレート エッジかみそりの刃の 2 番目のセットを使用します。<ol>
<li>冷たいなして、チューブにカプセルのピースを置くことを避けるために世話の 10 ml、15 mL の円錐管に細管を配置します。2 番目の精巣でこれらの手順を繰り返します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>なして精巣のサイズによっては、30-60 分間氷の上を含む円錐管でカプセル化解除される精細管を孵化させなさい。ペア 30 mg の重量を量る精巣の精細管をインキュベート以下、30 分、60 分の 30-45 分と大きい精巣の 31 に 50 mg の重量を量る精巣のペアから尿細管。単一の精巣の時間を変更しないでください。 注: 最適な培養時間は実験者、使用する試薬、分析されてマウスの経験によって異なります。</li>
	<li>なして精細に培養が、一方ラベル番号、スライド番号、および日付のマウスと precleaned スライドの曇らされた端にマーカーや鉛筆を使用します。その後固定液を含む Coplin jar に事前にクリーンアップされたスライドを配置します。</li>
	<li>次の孵化、きれいなペトリ皿に約 3 mm の直径の塊に別の尿細管尿細管となしてを注ぐ。各束をもたらす 2 つのスライドとスライドが得られた数は精巣のサイズによって異なります。 注: 我々 は野生型、subfertile Chtf18から 6 スライド 8 スライドを取得-(これは減数分裂と有糸分裂生殖細胞8の減らされた数のためにより小さい) P16 精巣は null。100 mg 以上の重量を量る 1 成人の精巣は 16 スライドを生成するために期待されます。</li>
	<li>場所 23 μ テフロンの一つの指輪に 100 mM ショ糖プリント、3 スライド ・ リング、リングに精細管の 1 つの塊を追加します。 使用して鉗子先端に塊を保持するソリューションが曇りになるまで優しくサイズ 11 かみそりの刃と尿細管をミンチします。 これが断片化された染色体に起因するので、注: を行う overmince ないです。断片化された染色体が突然変異体の表現型を示すものもかもしれないことに注意してください。</li>
	<li>残骸を取除く、ショ糖液の別 23 μ l 添加し、マイクロ ピペットを使用して優しくピペットの混合物を上下に数回に懸濁液で細胞を分離に役立ちます。</li>
	<li>Coplin jar を含む固定液に浸漬スライドを削除し、その 1 つの寛大な液滴にスライドの下で収集 jar をかけてスライドを傾けます。<ol>
<li>ピペット 20 μ L プレミアム定着性の液滴にテフロン印刷 3 リング スライドのリングからショ糖細胞懸濁液のつや消し、スライド ガラスとピペット 2 - 上下停止 3 回。 これにスクロース細胞懸濁液の 20 μ L 添加 (2.11 下記参照) 混合物を広めるときに、スライド全体にカバレッジをできるように、特定注:、定着性の液滴はボリュームで十分に大きいはずです。</li>
	</ol>
</li>
	<li>スライドの長さに沿って細胞懸濁液を普及する液滴の反対側にスライドをゆっくりと傾けます。スライドをゆっくりと傾けるそれを完全にカバーするスライドの幅に沿って細胞懸濁液を広めるに戻る。セルが互いに重複スライドよりも一度それ以外の同じ領域上の懸濁液を拡散しないでください。</li>
	<li>すぐに加湿チャンバー スライドをフラットにし、精細管のすべての塊まで 2.8 を 2.11 手順はスライドを作るに使用されているを繰り返します。乾燥過程で引き裂くとセルの重複を避けるために加湿チャンバーを移動することが重要です。</li>
	<li>彼らはゆっくりと完全に乾燥、2.5 時間室温で覆われた加湿チャンバー内インキュベートするスライドを許可します。湿度が高いとここでゆっくり乾燥 chromatin の十分な広がりを確保するため重要です。さらに 30 分完全に風乾するスライドを許可し、チャンバーのカバーを取り外します。</li>
	<li>0.4% 写真 Flo 200/1 × PBS 溶液 Coplin jar にスライド (に戻るまたはジグザグ パターンで) とスライドの 2 回、各 5 分を洗って、シェーカーを回転プラットフォーム上 jar、Coplin を優しく攪拌により。各洗浄のため新鮮なソリューションを使用して、各洗浄のため別の jar ファイルに別のマウスからスライドを維持します。</li>
	<li>洗浄は攪拌しながら一度 5 分 0.4% 写真 Flo 200/dH2O ソリューションを含む Coplin jar に滑る。</li>
	<li>Coplin から削除スライドは、jar (最後の洗浄)、慎重にエッジと余分な液体を削除するスライドの底を一掃し、乾燥する角度、ほぼ直立位置にスライドを配置します。このテクニックの上手な人実験者は処理し、1 日で 4 または 5 のマウスから表面拡散核を準備できます。</li>
	<li>一度乾燥 (15-20 分)、免疫組織染色法や 3 週間の最大の光から保護する密閉スライド ボックスには-80 ° C でストアにすぐにスライドを処理 (評価される; ターゲット蛋白質によって最適な結果がある場合取得します。ステンド グラス、同じ日または 2 週間以内)。<ol>
<li>-80 ° C で保存されている場合は、室温に来るし、汚れる前に 5 分間 X PBS またはブロック 1 を含む Coplin jar で洗うスライドを許可します。 注: 多くの異なる蛍光染色プロトコルは良い結果を提供します。免疫染色プロトコル8バーコウィッツらするを参照してください。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Handel, M. A., Schimenti, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+mammalian+meiosis:+regulation,+dynamics+and+impact+on+fertility.">Genetics of mammalian meiosis: regulation, dynamics and impact on fertility.</a> Nat Rev Genet. 11, 124-136 (2010).</li><li>Peters, A. H., Plug, A. W., van Vugt, M. J., de Boer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+drying-down+technique+for+the+spreading+of+mammalian+meiocytes+from+the+male+and+female+germline.">A drying-down technique for the spreading of mammalian meiocytes from the male and female germline.</a> Chromosome Res. 5, 66-68 (1997).</li><li>Counce, S. J., Meyer, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+the+synaptonemal+complex+and+the+kinetochore+in+Locusta+spermatocytes+studied+by+whole+mount+electron+microscopy.">Differentiation of the synaptonemal complex and the kinetochore in Locusta spermatocytes studied by whole mount electron microscopy.</a> Chromosoma. 44, 231-253 (1973).</li><li>Speed, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiosis+in+the+foetal+mouse+ovary.+I.+An+analysis+at+the+light+microscope+level+using+surface-spreading.">Meiosis in the foetal mouse ovary. I. An analysis at the light microscope level using surface-spreading.</a> Chromosoma. 85, 427-437 (1982).</li><li>Ashley, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+changes+in+Rad51+distribution+on+chromatin+during+meiosis+in+male+and+female+vertebrates.">Dynamic changes in Rad51 distribution on chromatin during meiosis in male and female vertebrates.</a> Chromosoma. 104, 19-28 (1995).</li><li>Baker, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+mouse+mLh1+in+DNA+mismatch+repair+and+meiotic+crossing+over.">Involvement of mouse mLh1 in DNA mismatch repair and meiotic crossing over.</a> Nat Genet. 13, 336-342 (1996).</li><li>Plug, A. W., Xu, J., Reddy, G., Golub, E. I., Ashley, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+association+of+Rad51+protein+with+selected+sites+in+meiotic+chromatin.">Presynaptic association of Rad51 protein with selected sites in meiotic chromatin.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 5920-5924 (1996).</li><li>Berkowitz, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+CHTF18+causes+defective+meiotic+recombination+in+male+mice.">Disruption of CHTF18 causes defective meiotic recombination in male mice.</a> PLoS Genet. 8, e1002996 (2012).</li><li>Gomez, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sororin+loads+to+the+synaptonemal+complex+central+region+independently+of+meiotic+cohesin+complexes.">Sororin loads to the synaptonemal complex central region independently of meiotic cohesin complexes.</a> EMBO Rep. 17, 695-707 (2016).</li><li>Brooker, A. S., Berkowitz, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+roles+of+cohesins+in+mitosis,+meiosis,+and+human+health+and+disease.">The roles of cohesins in mitosis, meiosis, and human health and disease.</a> Methods Mol Biol. 1170, 229-266 (2014).</li><li>McNicoll, F., Stevense, M., Jessberger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cohesin+in+gametogenesis.">Cohesin in gametogenesis.</a> Curr Top Dev Biol. 102, 1-34 (2013).</li><li>Rankin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+elaboration:+making+sense+of+meiotic+cohesin+dynamics.">Complex elaboration: making sense of meiotic cohesin dynamics.</a> FEBS J. 282, 2426-2443 (2015).</li><li>Holloway, J. K., Sun, X., Yokoo, R., Villeneuve, A. M., Cohen, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+CNTD1+is+critical+for+meiotic+crossover+maturation+and+deselection+of+excess+precrossover+sites.">Mammalian CNTD1 is critical for meiotic crossover maturation and deselection of excess precrossover sites.</a> J Cell Biol. 205, 633-641 (2014).</li><li>La Salle, S., Sun, F., Handel, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+short-term+culture+of+mouse+spermatocytes+for+analysis+of+meiosis.">Isolation and short-term culture of mouse spermatocytes for analysis of meiosis.</a> Methods Mol Biol. 558, 279-297 (2009).</li><li>Wiltshire, T., Park, C., Caldwell, K. A., Handel, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+premature+G2/M-phase+transition+in+pachytene+spermatocytes+includes+events+unique+to+meiosis.">Induced premature G2/M-phase transition in pachytene spermatocytes includes events unique to meiosis.</a> Dev Biol. 169, 557-567 (1995).</li></ol>

著者が明らかに何もありません。

広がり、良い品質精母細胞核の高い数字を得るためには、このプロトコルの最も重要な手順なして、適切な精細管のミンチで精細管の適当な培養時間は含まし、技術を採用ショ糖細胞懸濁液を固結被覆スライドに します。我々 は生後 15 大人なしてに 45 分の比較的高齢者Chtf18から精巣中に至る野生型男性の精巣の精細管を孵化させなさい-null マウスはわずか 30 分インキュベート、精?...

マウスは、哺乳類における減数分裂を勉強するモデル生物として広く使用されます。通常の発達プロセスと減数分裂の間に発生する欠陥の両方を評価できます。タイムラインと減数分裂の制御に重要なプロセスに関与する特定の蛋白質の多数と同様に、私は、サブステージ、前期中に発生する顕著な特徴の進行は、野生型と変異マウスの両方で特徴付けられます。減数分裂 (ヘンデルと Schimenti1レビュー) 詳細に勉強中に発生するいくつかの専門にされたプロセス。DNA 二重鎖切断 (DSB) の形成と修復、再結合、減数分裂形成と染色体分配が含まれます。
減数分裂のプロセスを学習の重要な側面は、視覚的および光学的により良い解決される含んでいる相同染色体を区別し、私は 5 のサブステージから成る I. 前期前期のサブステージを識別する核を調べる能力減数分裂 (SC) の形成を含む特定の機能が特徴です。SC は、ペアリングできるようにする三者タンパク質足場と同族体の DNA 二重鎖切断修復です。Leptonema、中に同族体揃える SC の軸要素が定められています。Zygonema 中に、減数分裂にアタッチする中心的な要素とは、同族体のペア間のペアリングおよび物理的な接続 (シナプス) を促進します。Pachynema、中に同族体のシナプスが完全になるし、DNA のクロス オーバーが相同組換えを介して DNA 二重鎖切断の修復から形成されています。SC は、desynapse が彼らのセントロメアおよび DNA のクロス オーバーのサイトで接続されたまま同族体を許可する diplonema、中に逆アセンブルします。最後に、移動中に同族体 recondense、中期への移行は、1を発生します。
歴史的には、前期の初期段階からの特にそれらいくつかの核をもたらした減数分裂期の染色質の表面拡散私2。その結果、これらのメソッドは、(睾丸、卵巣) の組織からの細胞の分離、拡散の減数分裂クロマチンの手法と評価2,3,の高品質減数分裂核の収量を改善するために変更されました。4します。 さらに、このメソッドが核保持に有用であることが証明、公開タバコプロトプ テクニック5,6,7で示されるように、クロマチンが減数分裂核タンパク質をバインドします。したがって、メソッドは当初ピーターズ2で記述し、前期の leptotene、zygotene、pachytene、diplotene、および移動のサブステージを受けている同族体を含む多くの独立したバースト精母細胞核の利回りを示す私。
表面拡散核 (クロマチンのスペクトラム解析とも呼ばれます) の準備の技術、広く減数分裂生殖、細胞生物学の分野での研究に使用されます。表面拡散核を含むスライドは興味の蛋白質に抗体と immunostained をその後することができますまたは銀染色に服従し、顕微鏡で解析。メソッドは、雌マウス2の変更が記載されているが、男性と女性の両方のマウスと似ています。精細管を overmince ことが重要です。免疫染色の同族体を後にその核必要がありますも広がりも、関連付けられているタンパク質が顕微鏡で見えます。表面拡散核をわずか数時間でいずれかの immunostained すぐに準備または融解と免疫染色の前に 3 週間の最大-80 ° C で保存できます。ただし、最適な結果がすぐにまたは表面拡散核の準備の 2 週間以内に免疫染色を実行する場合いくつかの蛋白質の得最高。スライドは、興味の蛋白質に抗体を用いた標準的なプロトコルと immunostained をすることができます二次抗体を蛍光共役タンパク質や色素、培養で後蛍光顕微鏡8のイメージを作成します。生後 15-21 では、野生型 6-10 スライドを生成する精巣のペアあたり十分な組織と古いマウス (大人も含む) を行えば、さらにスライド。しかし、野生型マウス 6 週間以上も得られませんより後減数分裂細胞 (すなわち細胞) の免疫染色を次のスライド。さらに、前期のすべてサブステージ私観察できる少年と大人のマウス。生後 10 15 からで男性の精巣より多くの leptotene と zygotene の細胞を得られます。マウス生後 14 に 15 より古いより多くの pachytene と diplotene の核になります。
ここで我々 の説明し、サンプル マウス精母細胞から表面拡散核の準備の広く使われている方法です。

<table><tbody><tr><td>Photo-Flo 200</td><td>Kodak</td><td>1464510</td><td></td></tr><tr><td>16% Paraformaldehyde (formaldehyde aqueous solution)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>RT 15710</td><td>Dilute 16% solution into 4% working stocks with 1X PBS and freeze aliquots at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Teflon printed 3 ring slides</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>63418-11</td><td></td></tr><tr><td>Premium uncharged frosted end glass slides</td><td>Several commercial brands</td><td></td><td>Clean slides in ethyl or isopropyl alcohol and allow to drip dry prior to use; label slides on frosted end with a permanent marker or pencil depending on subsequent use of slides</td></tr><tr><td>Surgical scissors (sharp and blunt tips)</td><td>Fine Science Tools</td><td>14001-12</td><td>Different brand of a similar type will work</td></tr><tr><td>Fine tip surgical scissors (sharp tips)</td><td>Fine Science Tools</td><td>14058-11</td><td>Different brand of a similar type will work</td></tr><tr><td>Straight fine tip forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11050-10</td><td>Different brand of a similar type will work</td></tr><tr><td>Curved medium tip forceps</td><td>Fisher</td><td>16100110</td><td>Different brand of a similar type will work</td></tr><tr><td>Scalpel handle</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td>Different brand of a similar type will work</td></tr><tr><td>Mouse anti-SYCP3</td><td>Abcam</td><td>ab97672</td><td>Use at 1:300</td></tr><tr><td>Anti-centromere protein (derived from human CREST patient serum)</td><td>Antibodies Incorporated</td><td>15-234-0001</td><td>Use at 1:50</td></tr><tr><td>Humidified chamber</td><td></td><td></td><td>We use Nunc square culture dishes 500 cm2/well with moistened paper towels</td></tr><tr><td>Widefield microscope with epifluorescence</td><td>Leica microsystems</td><td></td><td>Any standard model</td></tr><tr><td>Coplin jars</td><td>Several commercial brands</td><td></td><td>50 ml capacity; 40 mm (1.6 in.) diameter, holds 10 slides (back to back)</td></tr><tr><td>Petri dishes</td><td>Several commercial brands</td><td></td><td>100 x 15 mm diameter, polystyrene sterile untreated</td></tr></tbody></table>

preparation of meiotic chromosome spreads from mouse spermatocytes

哺乳類の減数分裂は、生殖細胞の発生し勉強でき、特徴と動的過程です。メソッドを使用してスライドの表面に核を拡散 (ドロップの高さから) ではなく 1997 年に最初に記述されたマウス精母細胞に最適化手法を示します。広く用いられる前期 I. 精のサブステージを受けている高品質の核の茄多が増すので、哺乳類の減数分裂を研究する研究室で尿細管はまずにうねり精母細胞を低張液に配置されます。精母細胞は、細胞懸濁液を作成するショ糖液中に放出され、核に固定液に浸したガラス スライド上に広がっています。免疫染色、続いて減数分裂のプロセスに密接に関連蛋白質の多様性を調べることができます。たとえば、減数分裂、同族体の染色体軸/コアを一緒に接続する三者構造のタンパク質を簡単に視覚化できます。減数分裂組み換え蛋白質の相同組み換えによる DNA 二重鎖切断の修復に関与しているには前期の進行を評価する immunostained することができます私。ここで我々 の説明し、サンプルの詳細少年や成人男性マウスから精母細胞の減数分裂を哺乳類の研究に広く用いられる手法です。

多数面の広がりそのまま同族体を含む核を提供するためにこのメソッドの機能は 3 つの主な要因に依存: 1) 十分に得るために低張性バッファー (すなわち HEB) で精細管の適切な培養時間膨らんだ状態バーストがから崩壊しない核は延長なし、2 で潜伏) micropipetting なく固まっている、核と 3 の分けられた懸濁液を取得するセルのショ糖粒) 各固定液を傾斜被覆では一度に...

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Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Mouse Spermatocytes

減数分裂は、DNA 複製の単一の円形および染色体の 2 つの連続したラウンドを経て、配偶子が形成される過程です。哺乳類の減数分裂は、減数分裂期染色体のスプレッドを準備する技術を活用して調べることができます。ここでは、表面拡散マウス精母細胞から核を準備する方法を示します。

マウス精母細胞から減数分裂期染色体の準備をスプレッドします。

Mammalian meiosis is a dynamic developmental process that occurs in germ cells and can be studied and characterized. Using a method to spread nuclei on ...

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11.7K ビュー.  Drexel University College of Medicine. 減数分裂は、DNA 複製の単一の円形および染色体の 2 つの連続したラウンドを経て、配偶子が形成される過程です。哺乳類の減数分裂は、減数分裂期染色体のスプレッドを準備する技術を活用して調べることができます。ここでは、表面拡散マウス精母細胞から核を準備する方法を示します。

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Step-specific Sorting of Mouse Spermatids by Flow Cytometry

The differentiation of mouse spermatids is one critical process for the production of a functional male gamete with an intact genome to be transmitted to the next generation. So far, molecular studies of this morphological transition have been hampered by the lack of a method allowing adequate separation of these important steps of spermatid differentiation for subsequent analyses. Earlier attempts at proper gating of these cells using flow cytometry may have been difficult because of a peculiar increase in DNA fluorescence in spermatids undergoing chromatin remodeling. Based on this observation, we provide details of a simple flow cytometry scheme, allowing reproducible purification of four populations of mouse spermatids fixed with ethanol, each representing a different state in the nuclear remodeling process. Population enrichment is confirmed using step-specific markers and morphological criterions. The purified spermatids can be used for genomic and proteomic analyses.

We describe a sorting strategy for mouse spermatids using flow cytometry. Spermatids are sorted into four highly pure populations, including round (spermiogenesis steps 1-9), early elongating (spermiogenesis steps 10-12), late elongating (spermiogenesis steps 13-14) and elongated spermatids (spermiogenesis steps 15-16). DNA staining, size and granulosity are used as selection parameters.

フローサイトメトリーによるマウス精子細胞のステップ固有のソート

The differentiation of mouse spermatids is one critical process for the production of a functional male gamete with an intact genome to be transmitted to ...

発生生物学

Chromatin Spread Preparations for the Analysis of Mouse Oocyte Progression from Prophase to Metaphase II

Chromatin spread techniques have been widely used to assess the dynamic localization of various proteins during gametogenesis, particularly for spermatogenesis. These techniques allow for visualization of protein and DNA localization patterns during meiotic events such as homologous chromosome pairing, synapsis and DNA repair. While a few protocols have been described in the literature, general chromatin spread techniques using mammalian prophase oocytes are limited and difficult due to the timing of meiosis initiation in fetal ovaries. In comparison, prophase spermatocytes can be collected from juvenile male mice with higher yields without the need for microdissection. However, it is difficult to obtain a pure synchronized population of cells at specific stages due to the heterogeneity of meiotic and post-meiotic germ cell populations in the juvenile and adult testis. For later stages of meiosis, it is advantageous to assess oocytes undergoing meiosis I (MI) or meiosis II (MII), because groups of mature oocytes can be collected from adult female mice and stimulated to resume meiosis in culture. Here, methods for meiotic chromatin spread preparations using oocytes dissected from fetal, neonatal and adult ovaries are described with accompanying video demonstrations. Chromosome missegregation events in mammalian oocytes are frequent, particularly during MI. These techniques can be used to assess and characterize the effects of different mutations or environmental exposures during various stages of oogenesis. As there are distinct differences between oogenesis and spermatogenesis, the techniques described within are invaluable to increase our understanding of mammalian oogenesis and the sexually dimorphic features of chromosome and protein dynamics during meiosis.

Oogenesis in mammals is known to be error-prone, particularly due to chromosome missegregation. This manuscript describes chromatin spread preparation methods for mouse prophase, metaphase I and II-staged oocytes. These fundamental techniques allow for the study of chromatin-bound proteins and chromosome morphology throughout mammalian oogenesis.

クロマチン広がるマウス卵母細胞の進行を前期から中期 II の分析のための準備

Chromatin spread techniques have been widely used to assess the dynamic localization of various proteins during gametogenesis, particularly for ...

遺伝学

Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Zebrafish Spermatocytes

Meiosis is the key cellular process required to create haploid gametes for sexual reproduction. Model organisms have been instrumental in understanding the chromosome events that take place during meiotic prophase, including the pairing, synapsis, and recombination events that ensure proper chromosome segregation. While the mouse has been an important model for understanding the molecular mechanisms underlying these processes, not all meiotic events in this system are analogous to human meiosis. We recently demonstrated the exciting potential of the zebrafish as a model of human spermatogenesis. Here we describe, in detail, our methods to visualize meiotic chromosomes and associated proteins in chromosome spread preparations. These preparations have the advantage of allowing high resolution analysis of chromosome structures. First, we describe the procedure for dissecting testes from adult zebrafish, followed by cell dissociation, lysis, and spreading of the chromosomes. Next, we describe the procedure for detecting the localization of meiotic chromosome proteins, by immunofluorescence detection, and nucleic acid sequences, by fluorescence in situ hybridization (FISH). These techniques comprise a useful set of tools for the cytological analysis of meiotic chromatin architecture in the zebrafish system. Researchers in the zebrafish community should be able to quickly master these techniques and incorporate them into their standard analyses of reproductive function.

Nuclear surface spreads are an indispensable tool for studying chromosome events during meiosis. Here we demonstrate a method to prepare and visualize meiotic chromosomes during prophase I from zebrafish spermatocytes.

ゼブラフィッシュの精子細胞からのマイオサイト染色体の広がりの調製

Meiosis is the key cellular process required to create haploid gametes for sexual reproduction. Model organisms have been instrumental in understanding ...

A Seminiferous Tubule Squash Technique for the Cytological Analysis of Spermatogenesis Using the Mouse Model

Meiotic progression in males is a process that requires the concerted action of a number of highly regulated cellular events. Errors occurring during meiosis can lead to infertility, pregnancy loss or genetic defects. Commencing at the onset of puberty and continuing throughout adulthood, continuous semi-synchronous waves of spermatocytes undergo spermatogenesis and ultimately form haploid sperm. The first wave of mouse spermatocytes undergoing meiotic initiation appear at day 10 post-partum (10 dpp) and are released into the lumen of seminiferous tubules as mature sperm at 35 dpp. Therefore, it is advantageous to utilize mice within this developmental time-window in order to obtain highly enriched populations of interest. Analysis of rare cell stages is more difficult in older mice due to the contribution of successive spermatogenic waves, which increase the diversity of the cellular populations within the tubules. The method described here is an easily implemented technique for the cytological evaluation of the cells found within the seminiferous tubules of mice, including spermatogonia, spermatocytes, and spermatids. The tubule squash technique maintains the integrity of isolated male germ cells and allows examination of cellular structures that are not easily visualized with other techniques. To demonstrate the possible applications of this tubule squash technique, spindle assembly was monitored in spermatocytes progressing through the prophase to metaphase I transition (G2/MI transition). In addition, centrosome duplication, meiotic sex chromosome inactivation (MSCI), and chromosome bouquet formation were assessed as examples of the cytological structures that can be observed using this tubule squash method. This technique can be used to pinpoint specific defects during spermatogenesis that are caused by mutation or exogenous perturbation, and thus, contributes to our molecular understanding of spermatogenesis.

The goal of this tubule squash technique is to rapidly assess cytological features of developing mouse spermatocytes while preserving cellular integrity. This method allows for the study of all stages of spermatogenesis, and can be easily implemented alongside other biochemical and molecular biological approaches for the study of mouse meiosis.

精細管スカッシュ マウス モデルを用いた精子の細胞学的解析法

Meiotic progression in males is a process that requires the concerted action of a number of highly regulated cellular events. Errors occurring during ...

Chromosomal Spread Preparation of Human Embryonic Stem Cells for Karyotyping

Although human embryonic stem cells (hESC) have been shown to present a stable diploid karyotype 1, many studies have reported that depending on culture conditions they become prone to acquire chromosomal anomalies such as addition of whole or parts of chromosomes. Indeed, during long-term culture, karyotypic alterations are observed when enzymatic or chemical dissociation are used 2,3,4, while manual dissection of colonies for passaging retains a stable karyotype 5. Besides, changes in the environment such as the removal of feeder cells also seem to compromise the genetic integrity of hESC 3,6. Once chromosomal alterations could affect cellular physiology, the characterization of the genetic integrity of hESC in vitro is crucial considering hESC as an essential tool in embryogenesis studies and drug testing. Furthermore, for future therapeutic purposes chromosomal changes are a real concern as it is frequently associated to carcinogenesis.
Here we show a simple and useful method to obtain high quality chromosome spreads for subsequent analysis of chromosome set by G-banding, FISH, SKY or CGH techniques 7,8. We recommend checking the chromosomal status routinely with intervals of 5 passages in order to monitor the appearance of translocations and aneuploidies
Priscila Britto and Rafaela Sartore contributed equally to the paper.

Karyotyping is a simple and useful technique widely used for detecting genetic alterations. Here we describe a step by step protocol for chromosome spread preparation of human embryonic stem cells for monitoring the chromosomal status of these cells maintained in culture.

染色体分析のためのヒト胚性幹細胞の染色体スプレッドの準備

Although human embryonic stem cells (hESC) have been shown to present a stable diploid karyotype 1, many studies have reported that depending on culture ...

生物学

Enrichment of Pachytene Spermatocytes and Spermatids from Mouse Testes Using Standard Laboratory Equipment

To characterize each step of spermatogenesis, researchers must separate different subpopulations of germ cells from testes. However, isolating discrete populations is challenging, because the adult testis contains a complex mix of germ cells from all steps of spermatogenesis along with certain populations of somatic cells. Over the past few decades, different techniques such as centrifugal elutriation, fluorescence-activated cell sorting (FACS), and STA-PUT have been successfully applied to the isolation of germ cells. A drawback is that they all require dedicated devices and specialized training. Following principles underlying the STA-PUT method, a simple protocol has been developed for the isolation of pachytene spermatocytes, round spermatids, and elongating spermatids from mouse testes. After preparing a single cell suspension of testicular cells, specific cell populations are enriched by gravity sedimentation through a discontinuous bovine serum albumin (BSA) density gradient. The cell fractions are then manually collected and microscopically analysed. This modified density gradient for round spermatids (MDR) sedimentation protocol can be widely applied, because it requires only standard laboratory equipment. Furthermore, the protocol requires minimal starting materials, reducing its cost and use of laboratory animals.

Presented here is a protocol for enriching pachytene spermatocytes, round spermatids, and elongating spermatids from adult mouse testes using a discontinuous bovine serum albumin density gradient with standard laboratory equipment.

標準的な実験装置を用いてマウス精巣からパチテン精子細胞と精子を濃縮

To characterize each step of spermatogenesis, researchers must separate different subpopulations of germ cells from testes. However, isolating discrete ...

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with development, tissue homeostasis, and disease processes. Drosophila spermatocytes undergoing meiosis are ideal for this analysis because (1) whole Drosophila testes containing spermatocytes are relatively easy to prepare for microscopy, (2) the spermatocytes&#8217; large size makes them well suited for high resolution imaging, and (3) powerful Drosophila genetic tools can be integrated with in vivo analysis. Here, we present a readily accessible protocol for the preparation of whole testes from Drosophila third instar larvae and early pupae. We describe how to identify meiotic spermatocytes in prepared whole testes and how to image them live by time-lapse microscopy. Protocols for fixation and immunostaining whole testes are also provided. The use of larval testes has several advantages over available protocols that use adult testes for spermatocyte analysis. Most importantly, larval testes are smaller and less crowded with cells than adult testes, and this greatly facilitates high resolution imaging of spermatocytes. To demonstrate these advantages and the applications of the protocols, we present results showing the redistribution of the endoplasmic reticulum with respect to spindle microtubules during cell division in a single spermatocyte imaged by time-lapse confocal microscopy. The protocols can be combined with expression of any number of fluorescently tagged proteins or organelle markers, as well as gene mutations and other genetic tools, making this approach especially powerful for analysis of cell division mechanisms in the physiological context of whole tissues and organs.

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

The goal of this protocol is to analyze cell division in intact tissue by live and fixed cell microscopy using Drosophila meiotic spermatocytes. The protocol demonstrates how to isolate whole, intact testes from Drosophila larvae and early pupae, and how to process and mount them for microscopy.

生きた無傷組織における細胞分裂解析のためのショウジョウバエ・ラーバルとプパル精巣の調製

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with ...

Isolation of Murine Spermatogenic Cells using a Violet-Excited Cell-Permeable DNA Binding Dye

Isolation of meiotic spermatocytes is essential to investigate molecular mechanisms underlying meiosis and spermatogenesis. Although there are established cell isolation protocols using Hoechst 33342 staining in combination with fluorescence-activated cell sorting, it requires cell sorters equipped with an ultraviolet laser. Here we describe a cell isolation protocol using the DyeCycle Violet (DCV) stain, a low cytotoxicity DNA binding dye structurally similar to Hoechst 33342. DCV can be excited by both ultraviolet and violet lasers, which improves the flexibility of equipment choice, including a cell sorter not equipped with an ultraviolet laser. Using this protocol, one can isolate three live-cell subpopulations in meiotic prophase I, including leptotene/zygotene, pachytene, and diplotene spermatocytes, as well as post-meiotic round spermatids. We also describe a protocol to prepare single-cell suspension from mouse testes. Overall, the procedure requires a short time to complete (4-5 hours depending on the number of needed cells), which facilitates many downstream applications.

Here we present a simple and efficient method to isolate live meiotic and post-meiotic germ cells from adult mouse testes. Using a low-cytotoxicity, violet-excited DNA binding dye and fluorescence-activated cell sorting, one can isolate highly enriched spermatogenic cell populations for many downstream applications.

バイオレット励起細胞透過性DNA結合色素を用いたマウス精子細胞の分離

Isolation of meiotic spermatocytes is essential to investigate molecular mechanisms underlying meiosis and spermatogenesis. Although there are established ...

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the unique differentiation programs that are manifest during meiosis. Two principal methods have been developed to purify, to varying degrees, various meiotic fractions from both adult and immature animals: elutriation or Staput (sedimentation) using BSA and/or percoll gradients. Both of these methods rely on cell size and density to separate meiotic cells1-5. Overall, except for few cell populations6, these protocols fail to yield sufficient purity of the numerous meiotic cell populations that are necessary for detailed molecular analyses. Moreover, with such methods usually one type of meiotic cells can be purified at a given time, which adds an extra level of complexity regarding the reproducibility and homogeneity when comparing meiotic cell samples.
Here, we describe a refined method that allows one to easily visualize, identify, and purify meiotic cells, from germ cells to round spermatids, using FACS combined with Hoechst 33342 staining7,8. This method provides an overall snapshot of the entire meiotic process and allows one to highly purify viable cells from most stage of meiosis. These purified cells can then be analyzed in detail for molecular changes that accompany progression through meiosis, for example changes in gene expression9,10and the dynamics of nucleosome occupancy at hotspots of meiotic recombination11.

An efficient method to obtain highly purified viable meiotic fractions from mouse testis is described, which combines a refined cell dissociation protocol with fluorescent activated cell sorting (FACS). This method takes advantage of differences in the DNA content and nuclear density of discrete meiotic fractions.

マウス減数分裂細胞のフローサイトメトリーの精製

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

<meta charset="utf8"></head><body>胚発生を研究するためのマウスラウンド精子細胞注入手順

Mouse Round Spermatid Injection

Round spermatids, characterized by their haploid genetic content, represent the precursor cells to mature spermatozoa. Through the innovative technique of round spermatid injection (ROSI), oocytes can be successfully fertilized and developed into viable fetuses. In a groundbreaking milestone achieved in 1995, the first mouse fetus was born through ROSI technology. ROSI has since emerged as a pivotal tool for unraveling the intricate mechanisms governing embryonic development and holds significant potential in various applications, including the acceleration of mouse generation and the production of genetically modified mice. In 1996, a milestone was reached when the first human fetus was born through ROSI technology. However, the clinical applications of this method have shown a fluctuating pattern of success and failure. To date, ROSI technology has not found widespread application in clinical practice, primarily due to its low birth efficiency and insufficient validation of fetal safety. This article provides a comprehensive account of the precise methods of performing ROSI in mice, aiming to shed new light on basic research and its potential clinical applications.

<meta charset="utf8"></head><body>マウスラウンド精子細胞注射

Here, we introduce a method for performing round spermatid injection (ROSI) in mice, a technique with promising clinical applications and utility for investigating the mechanisms underlying embryonic development.

マウスラウンド精子細胞注射

Round spermatids, characterized by their haploid genetic content, represent the precursor cells to mature spermatozoa. Through the innovative technique of ...

マウス精母細胞から減数分裂期染色体の準備をスプレッドします。

要約

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フローサイトメトリーによるマウス精子細胞のステップ固有のソート

クロマチン広がるマウス卵母細胞の進行を前期から中期 II の分析のための準備

ゼブラフィッシュの精子細胞からのマイオサイト染色体の広がりの調製

精細管スカッシュマウスモデルを用いた精子の細胞学的解析法

染色体分析のためのヒト胚性幹細胞の染色体スプレッドの準備

標準的な実験装置を用いてマウス精巣からパチテン精子細胞と精子を濃縮

生きた無傷組織における細胞分裂解析のためのショウジョウバエ・ラーバルとプパル精巣の調製

バイオレット励起細胞透過性DNA結合色素を用いたマウス精子細胞の分離

マウス減数分裂細胞のフローサイトメトリーの精製

マウスラウンド精子細胞注射

マウス精母細胞から減数分裂期染色体の準備をスプレッドします。

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フローサイトメトリーによるマウス精子細胞のステップ固有のソート

クロマチン広がるマウス卵母細胞の進行を前期から中期 II の分析のための準備

ゼブラフィッシュの精子細胞からのマイオサイト染色体の広がりの調製

精細管スカッシュ マウス モデルを用いた精子の細胞学的解析法

染色体分析のためのヒト胚性幹細胞の染色体スプレッドの準備

標準的な実験装置を用いてマウス精巣からパチテン精子細胞と精子を濃縮

生きた無傷組織における細胞分裂解析のためのショウジョウバエ・ラーバルとプパル精巣の調製

バイオレット励起細胞透過性DNA結合色素を用いたマウス精子細胞の分離

マウス減数分裂細胞のフローサイトメトリーの精製

マウスラウンド精子細胞注射

精細管スカッシュマウスモデルを用いた精子の細胞学的解析法