優れた技術支援をしてくださったP.Käse氏とT. Schmidt-Wöll氏に感謝します。この研究は、DFG（ドイツ研究財団）、フライブルクのマックスプランク学会とEXC 294の共同研究助成金TRR81とハイゼンベルグプログラム（BO 1639 / 5-1）と、心肺システムのエクセレンスクラスターGiessenからTBまで

注：このプロトコルで使用されるすべてのバッファーと培地は、 表1にリストされています。 1日目と2日目 1.細胞の架橋<ol><li>マウスT細胞を6ウェルプレートから50 mLチューブに移し、4℃および271 x gで5分間遠心分離します。細胞ペレットを30mLのIMDM細胞培養培地に再懸濁し、Neubauerチャンバーを用いて細胞を計数する。 </li><li>新しい50mLチューブに20×10 6細胞のアリコートを集める。 </li><li>ホルムアルデヒド（FMA）を最終濃度1％に細胞培養培地に直接添加し、室温で10分間インキュベートする。 注意：FMAは吸入すると有毒ですので、フュームフードの下で作業し、適切な保護具を着用してください。また、ホスト機関の規則に従ってFMA廃棄物を処理してください。 </li><li> 1/8容量の1Mグリシン（pH7.0）を加え、室温で5分間インキュベートする。 </li><li> 5分間遠心分離して細胞をペレット化する。4℃および〜271×gで10分間インキュベートし、10mLのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で洗浄する。 </li><li> 1mLのPBSで細胞ペレットを洗浄し、1.5mLチューブに移す。 </li></ol> 2.細胞溶解およびクロマチンのせん断<ol><li>細胞ペレットを1mLのSDS溶解バッファーに再懸濁し、氷上で10分間インキュベートする。 </li><li>各サンプルを超音波処理チューブに移し、集束超音波装置を用いて表2に示す設定に従ってせん断を行う。 </li><li>せん断後、サンプルを1.5 mLのチューブに移し、4℃および約18,000 x gで10分間遠心分離します。 </li><li>上清を新しいチューブに移す。 </li><li>ステップ3に従って剪断効率を決定するために50μLを集め、剪断された溶解物を液体窒素中でスナップ凍結する。ライセートを一度に使用するアリコートに-80℃で保存する。 </li></ol> 3.せん断効率の決定<ol><li>溶出バッファー50μLを50＆各剪断された溶解物の181μLを加え、振盪しながら65℃で一晩インキュベートする。 </li><li> 100μLのTE緩衝液と4μLの10mg / mL RNase A（最終濃度0.2μg/μL）を添加する。混合し、37℃で2時間、振とうしながらインキュベートする。 </li><li> 2μLの20mg / mLプロテイナーゼK（0.2μg/μL最終濃度）を各サンプルに添加し、振盪しながら55℃で2時間インキュベートする。 </li><li>各サンプルをフェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール抽出に適したゲルチューブに移す。製造者の指示に従って取り扱ってください。 </li><li> フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール（25：24：1）200μLを加え、チューブを振とうする。 24℃、〜16,000×gで5分間遠心分離し、上相を新しいチューブに移す。 注意：フェノール、クロロホルム、イソアミルアルコールは吸入すると有毒で腐食性があります。ヒュームフードの下で作業し、適切な個人用保護具を着用する。また、フェノール、クロロホルム、イソアミルアルコール廃棄物処理ホスト機関の規則に従う。 <ol><li>一度繰り返します。 </li></ol></li><li> 以下の変更を加えて、製造者の指示に従って精製カラムを使用してDNAを精製する： <ol><li>メンブレンを2回洗浄する。最後の洗浄の後、チューブを室温で2分間開いたままにして、残留エタノールを蒸発させる。 </li><li>溶出のために、50μLのH 2 Oを添加し、室温で1分間インキュベートし、膜を適切に濡らすためにチューブを1分間回転させ、室温で1分間インキュベートした後、1分間遠心分離によってDNAを溶出する。 24℃〜17,900×g。 </li></ol></li><li>高感度キットを使用して、製造業者の指示に従って、精製したDNAを蛍光光度計で定量する。 </li><li> 1.8％アガロースゲル上で約500ngの精製DNAを分析し、高感度キットを用いて電気泳動システムで約1ngを分析する。 注：予想されるsizeは200〜500bpである。 </li></ol> 3日目と4日目免疫沈降<ol><li>剪断された溶解物の1容量を5倍量の希釈バッファーで希釈する。 </li><li> 30μL/ mLのプロテインAアガロースビーズ（ 付録Aに従って調製）を30分間冷蔵室で回転させながら予め洗浄する。 </li><li> 〜750 x gで5分間4℃で遠心分離する。 </li><li>入力の10％を収集し、4℃で保存する。 </li><li>新しいチューブに所望量のライセートを分注する（詳細は表3を参照）。各チューブに目的の抗体を加え（詳細は表3を参照）、4℃で一晩回転させます。 </li><li> 40μLのプロテインAビーズを添加し、回転させながら4℃で1時間インキュベートする。 </li><li>ビーズを低塩緩衝液、高塩緩衝液、LiCl緩衝液、およびTE緩衝液（各洗浄のために、4℃で5分間、回転および遠心分離しながらインキュベートする）で洗浄する。4℃で3分間、〜950×g）。詳細は表3を参照してください。 </li><li> 110μLの溶出緩衝液を添加し、室温で15分間インキュベートし、2分ごとにボルテックスする。 </li><li> 4℃、〜950×gで3分間遠心分離し、100μLの上清を新しい1.5mLチューブに移す。 </li><li>溶出バッファー100μLでステップ4.7-4.8を繰り返し、溶出液を合わせます。サンプルを入力するために200μLまでの溶出バッファーを添加する。 </li><li>すべてのサンプルを振盪しながら65℃で一晩インキュベートする。 </li></ol> 5日目 DNA精製<ol><li>各溶出液にTEバッファー200μLと10 mg / mL RNase A（最終濃度0.2μg/μL）8μLを加えます。混合し、37℃で2時間、振とうしながらインキュベートする。 </li><li>各溶出液に20 mg / mLプロテイナーゼK（0.2μg/μL最終濃度）4μLを添加し、振とうしながら55°Cで2時間インキュベートする。 </li><li>各サンプルをゲルに移すフェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール抽出に適したチューブ;製造者の指示に従って取り扱ってください。 </li><li> 400μLのフェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール（25：24：1）を加え、チューブを振とうする。 24℃および〜16,000×gで5分間遠心分離する。上層を新しいチューブに移す。 注意：フェノール、クロロホルム、イソアミルアルコールは吸入すると有毒で腐食性があります。ヒュームフードの下で作業し、適切な個人用保護具を着用する。また、ホスト機関の規則に従って、フェノール、クロロホルム、イソアミルアルコールの廃棄物を処理してください。 <ol><li>一度繰り返します。 </li></ol></li><li>以下の変更を加えて、製造者の指示に従って精製カラムを用いてDNAを精製する： </li><li>メンブレンを2回洗浄する。最後の洗浄後、室温で2分間チューブを開いたままにして、残留エタノールを蒸発させる。 </li><li>溶出のために、50μLのH 2 Oを加え、室温でインキュベートする1分間インキュベートし、膜を適切に濡らすためにチューブを1分間回転させ、室温で1分間インキュベートした後、24℃で1分間遠心分離してDNAを溶出させ、約17,900×gで溶出する。 </li></ol>

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	<li>Rothenberg, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chromatin+landscape+and+transcription+factors+in+T+cell+programming.">The chromatin landscape and transcription factors in T cell programming.</a> Trends Immunol. 35 (5), 195-204 (2014).</li><li>Zhang, J. A., Mortazavi, A., Williams, B. A., Wold, B. J., Rothenberg, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+transformations+of+genome-wide+epigenetic+marking+and+transcriptional+control+establish+T+cell+identity.">Dynamic transformations of genome-wide epigenetic marking and transcriptional control establish T cell identity.</a> Cell. 149 (2), 467-482 (2012).</li><li>Cauchy, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+recruitment+of+Ets1+to+both+nucleosome-occupied+and+-depleted+enhancer+regions+mediates+a+transcriptional+program+switch+during+early+T-cell+differentiation.">Dynamic recruitment of Ets1 to both nucleosome-occupied and -depleted enhancer regions mediates a transcriptional program switch during early T-cell differentiation.</a> Nucl Acids Res. 44 (8), 3567-3585 (2016).</li><li>Koch, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+initiation+platforms+and+GTF+recruitment+at+tissue-specific+enhancers+and+promoters.">Transcription initiation platforms and GTF recruitment at tissue-specific enhancers and promoters.</a> Nat Struct Mol Biol. 18 (8), 956-963 (2011).</li><li>Pekowska, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H3K4+tri-methylation+provides+an+epigenetic+signature+of+active+enhancers.">H3K4 tri-methylation provides an epigenetic signature of active enhancers.</a> EMBO J. 30 (20), 4198-4210 (2011).</li><li>Vanhille, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+and+quantitative+assessment+of+enhancer+activity+in+mammals+by+CapStarr-seq.">High-throughput and quantitative assessment of enhancer activity in mammals by CapStarr-seq.</a> Nat Commun. 6, 6905 (2015).</li><li>Barski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+profiling+of+histone+methylations+in+the+human+genome.">High-resolution profiling of histone methylations in the human genome.</a> Cell. 129 (4), 823-837 (2007).</li><li>Heintzman, N. 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著者には競合する金銭的利益はない。

ChIPは、タンパク質またはそのPTMが特定のゲノム領域で富化されているかどうかを調べる有効な技術である。 ChIPアッセイの結果は、生物学的または技術的理由により解釈するのが困難なことが多い。生物学的理由は多種多様であり、タンパク質のDNAへの弱いまたは間接的な結合を含む。限られた抗体特異性および非効率的な細胞溶解またはクロマチン剪断などの技術的限界もある。トラブルシューティングガイド（ 表5 ）は、ChIPアッセイで遭遇する可能性のある問題を解決するのに役立ちます。 このプロトコルは、冷却された集束超音波装置を利用して、成熟マウスT細胞株のクロマチンを効率的に剪断することを可能にする。プロトコルの主な重要なステップは、各細胞タイプに対して常に最適化されなければならないクロマチンのせん断によって表される。細胞の数および超音波処理サイクルの数を変えることが示唆されている。さらに、彼女は<html>効率は、SDS溶解バッファーを用いて氷上で細胞を溶解する間に形成される試料中のSDS沈殿物の存在によって悪影響を受ける。この場合、SDS沈殿物の存在を減少させるために、室温で数分間、溶解後に試料をインキュベートすることが最善である。 200〜500 bpのせん断断片を得るためにプロトコールを最適化し、免疫沈降を続ける前に試料のせん断品質を常に評価することが推奨される。さらに、固定時間、抗体および/または細胞の量、および洗浄条件は、各抗体について最適化されなければならない。 低特異性抗体が免疫沈降の効率を著しく低下させるので、ChIP手順を成功させるためのもう1つの重要なステップは、抗体の選択である。以前は、統一された品質試験手順により、市販されているいくつかの抗体の特異性を評価することができました<html> ss = &quot;xref&quot;&gt; 19。スクリーニングパイプラインは、ドットブロット、ウエスタンブロット、およびChIPに基づいており、ChIP 19に適した高品質の試薬のリストを提供しています。より最近、いくつかの市販の抗体の特異性を、高密度ヒストンペプチドマイクロアレイプラットフォームを用いて評価し、抗体特異性に関するデータベースの確立を可能にした20 。読者は、この有用なツールを用いて、ChIP実験に使用できる最も特異的な抗体を同定することができる。 このプロトコールは一次T細胞については試験されておらず、この場合、読者は一次T細胞上でChIPを首尾よく行う他の公表されたプロトコール3,4,21を参照すべきである。特に、このプロトコルは、マウス前駆細胞T細胞系およびマウス内皮細胞系でChIPを行うのに首尾よく使用されている。 このプロトコールは、いくつかの最適化を伴って、TFまたは補因子についてChIPを実施するのにも適しているので、細胞の数を増やすことが最も好ましい各実験に必要な細胞数に達するために、剪断された溶解物のより多くのアリコートを、希釈緩衝液中でクロマチンを希釈する前に一緒にプールすることができる。 このプロトコールは、DNAに直接結合しない内在性タンパク質に対してChIPを行うように改変することもできる。この場合、タンパク質 - タンパク質架橋剤（ 例えば、ジメチルアジピミデート、DMA）による前固定が必要となり得る（詳細については付録Bを参照）。補因子に対するChIPの成功した性能は、以前にビオチンタグに融合したタンパク質を過剰発現させることによって行われていた。この場合、タンパク質をストレプトアビジンコンジュゲート磁気ビーズを塗布し、DMAによる前固定を行った22 。

発達、分化およびホメオスタシスは、クロマチン構造を調節し、したがって特定の遺伝子が細胞および時間特異的に活性化されるか、または抑制されるかを決定するシグナル伝達事象によって確立される特定の遺伝子発現プログラムに依存する。 T細胞発達中に、いくつかの中間段階1を経て、二重陰性（DN）から単一陽性（SP）状態へのT細胞前駆体の成熟を適切に決定するために、特定の遺伝子発現プログラムを確立しなければならない。遺伝子発現プログラムがT細胞発達中にどのように動的に調節されるかは、過去数年にいくつかの研究室によって幅広く研究されてきた2、3、4、5、6。 ヒストンの翻訳後修飾（PTM）により、ヒストン変異体を有する標準的なヒストン、ヌクレオソーム退縮、およびDNAメチル化は、遺伝子のON / OFFスイッチを調節する。いくつかのグループが、PTMおよびヒストン変異体のゲノムワイド分布を調査して、近位および遠位の調節領域7,8,9,10の異なるクロマチン状態に関連する痕跡を決定した。シグナリングカスケードは、特定のエンハンサー要素での陽性および陰性のクロマチン修飾酵素（クロマチン修飾因子としても知られている）の交換を介して、動的クロマチン制御を調整する。これらのクロマチン修飾因子は、例えばダイナミックヒストンのメチル化およびアセチル化によるクロマチン構造および従って転写産物を調節する。これは、Notchシグナル伝達経路11,12,13 、14。 動的ヒストンPTM;ヒストン変異体との交換;ヒストン、転写因子、および補因子の動的占有率は、クロマチン免疫沈降（ChIP）アッセイによって調べることができる。高度に特異的な抗体を用いて特定のDNA-タンパク質複合体を精製し、精製されたDNAを定量PCR（qPCR）によって分析する。ディープシーケンシング（ChIP-Seq）;今日では、マイクロアレイへのハイブリダイゼーション（ChIP-ChIP）の頻度は低い。 ChIPアッセイは、細胞の溶解、クロマチンの剪断および/または抗体の低特異性による合併症のために時々困難である。 NEXSON 15の場合のように、プロトコルを改善するためのいくつかの戦略が採用されています。冷却水浴ソニケーターの使用は、調査中のタンパク質上に存在するエピトープに損傷を与える試料加熱を回避するが、試料のせん断に必要なエネルギーは水中に分散する。エネルギーの分散を防止する集束超音波装置の開発により、別の改良がなされた。したがって、集束超音波装置は、細胞溶解およびクロマチン剪断の改善を可能にし、オペレーター誘発変異を排除し、再現性を有意に増加させる。 この研究は、E2-10HA 16,17と呼ばれる成熟マウスT細胞系においてヒストンタンパク質のChIPを効率的に行うためのプロトコール（ 図1の概略図 ）を説明している。 T細胞は通常溶解するのが困難であり、そのクロマチンのせん断は非効率的であることが明らかにされている。冷却された集束超音波装置を使用するこのプロトコールでは、細胞数、溶解緩衝液、およびせん断設定が、E2-10HAマウスT細胞株について最適化された。このプロトコルは、高い再現性と妥当な時間でChIPを実行することを可能にする。実際には、それはrequirクロマチンを剪断して剪断の質を評価するおよそ2日間、免疫沈降を行い、架橋を逆転させ、DNAを精製するために3日間。

<table><tbody><tr><td>Agilent High Sensitivity D5000 Reagents</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5593</td><td></td></tr><tr><td>Agilent High Sensitivity D5000 ScreenTape</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5592</td><td></td></tr><tr><td>Agilent Tapestation 4200</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2991AA</td><td></td></tr><tr><td>Covaris S220 AFA System</td><td>Covaris</td><td>500217</td><td></td></tr><tr><td>dimethyl adipimidate (DMA)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>20660</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>Pan-Biotech</td><td>1502-P121301</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde (FMA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>Insulin solution human&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9278-5ML</td><td></td></tr><tr><td>Iscove&#039;s modified Dulbecco&#039;s medium (IMDM)</td><td>Gibco</td><td>21980-032</td><td></td></tr><tr><td>Minimum essential medium non-essential amino acids (MEM NEAA)</td><td>Gibco</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>nProtein A Sepharose 4 Fast Flow</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5280-02</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin&lt;br /&gt;(10,000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Peptone primatone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4963-100G</td><td></td></tr><tr><td>Phase Lock Gel Heavy 2&amp;nbsp;mL</td><td>5 Prime</td><td>2302830</td><td></td></tr><tr><td>Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1)</td><td>Roth</td><td>A156.2</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td><td>GIBCO</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K Solution (20 mg/mL), RNA grade</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25530049</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR Purification Kit (250)</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 3.0 Fluorometer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>Qubit assay tubes</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32854</td><td></td></tr><tr><td>RNase A, DNase and protease-free (10&amp;nbsp;mg/mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>Tube AFA Fiber &amp;amp; Cap</td><td>Covaris</td><td>520081</td><td></td></tr></tbody></table>

chromatin immunoprecipitation (chip) in mouse t-cell lines

シグナル伝達経路は、ヒストン尾部の翻訳後修飾（PTM）、ヒストン変異体との標準的ヒストンの交換、およびヌクレオソーム退化など、異なるレベルでのクロマチン構造の調節を介して遺伝子発現プログラムを調節する。そのような調節は、エンハンサーとして規定された調節エレメントでクロマチン修飾酵素を補充するシグナル感受性転写因子（TF）の結合を必要とする。シグナリングカスケードがエンハンサー活性を調節する方法を理解するには、TF、クロマチン修飾酵素の結合、および特定のヒストンマークとヒストン変異体の占有の包括的な分析が必要です。クロマチン免疫沈降（ChIP）アッセイは、特異的タンパク質/ DNA複合体を免疫沈降させるために高度に特異的な抗体を利用する。精製DNAのその後の分析は、抗体によって認識されるタンパク質が占める領域を同定することを可能にする。この作業では、効率的にperform成熟マウスT細胞株におけるヒストンタンパク質のChIP。提示されたプロトコールは、妥当な時間枠内で高い再現性でChIPアッセイの実施を可能にする。

成熟マウスT細胞をChIP分析に供し、ヒストン3（H3K4me1）上のリジン4モノメチル化、ヒストン3上のリジン4のトリメチル化（H3K4me3）、およびリジン27のアセチル化ヒストン3（H3K27ac）、ならびにpanH3 ChIPによって明らかにされるように、ヌクレオソーム占有率。せん断品質は、1.8％アガロースゲル（ 図2A ）および電気泳動システム（ 図2B ）の分析によって評価した。 H3K4me1およびH3K4me3は、それぞれ、エンハンサー部位およびプロモーターを同定するために一般的に使用される（ 図3A ）。実際に、H3K4me3は、プロモーター5,8,14において顕著であるが、排他的ではない。活性エンハンサーの特徴は、H3K4me1およびH3K27acに対して高度に富化され、H3K4me3（&lt;一方、不活性エンハンサーは、H3K4me3およびH3K27acの低レベルであるが、高レベルのH3K4me1を示す（ 図3A 、下のパネル）。 図3Bに示すように、 グリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ （ Gapdh ）遺伝子は、活性遺伝子プロモーター （ Gapdhプロモーター ）の分析の代表である。実際、それはH3K4me3およびH3K27acの高レベルおよびH3K4me1の低レベルを示す。 図3Bにおいて、 Deltex1 （ Dtx1 ）は、H3K4me1が高度に富化され、H3K4me3およびH3K27acがほとんど濃縮されていないので、不活性エンハンサー（ Dtx1エンハンサー ）の代表である。 遺伝子砂漠は、コード遺伝子を欠いている領域の代表であり、通常、活性クロマチンマークの陰性対照として提出されている。 H3K4me1、よく受け入れられているエンハンサーマーカーである4,5 、 </sup&gt; 7,14,18は、 遺伝子の砂漠では豊かではないが、この地域にはエンハンサーがないことが示唆されている。 <img alt="図1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55907/55907fig1.jpg" /> 図1：提示されたChIPプロトコルの概略図。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55907/55907fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <img alt="図2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55907/55907fig2.jpg" /> 図2：成熟マウスT細胞株のシャーリング品質管理。 （ A ）成熟マウスT細胞株E2-10HAの2つの異なるアリコートをせん断し、約500ngの精製DNAを1.8％アガロースゲルで分析して、それらのせん断を評価した品質。 （ B ）試料2の精製DNA1ngを電気泳動で分析し、その剪断品質を評価した。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55907/55907fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <img alt="図3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55907/55907fig3.jpg" /> 図3：エンハンサーおよびプロモーターを特徴付けるクロマチンマーク。 （ A ）活性型エンハンサー（上パネル）は、高H3K4me1、低H3K4me3、および高H3K27acを特徴とするが、不活性エンハンサー（下パネル）は高H3K4me1、低H3K4me3および低H3K27acを示す。 （ B ） 図2Aに提示されたサンプルを一緒にプールし、panH3 ChIPによって明らかにされるように、ChIP分析対ヒストンマークH3K4me1、H3K4me3、およびH3K27acおよびヒストン占有に使用した。この分析は、（ Gapdhプロモーター ）は、H3K4me3およびH3K27acに対して高度に富化され、H3K4me1に対しては低濃度に濃縮される。一方、不活性遺伝子Deltex1 （ Dtx1エンハンサー ）のエンハンサーは、 H3K4me1に対して高度に濃縮されているが、H3K4me3およびH3K27acにはほとんど濃縮されていない。 panH3抗体を用いたChIPを用いてヌクレオソーム占有率を調べた。 遺伝子砂漠を陰性対照として用いた。 1つの代表的な実験が示されている。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55907/55907fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> バッファの名前 </td><td> 試薬 </td><td> 最終濃度 </td></tr><tr><td rowspan="5">希釈緩衝液</td><td>ナトリウムドデック（SDS） </td><td> 0.01％（w / v） </td></tr><tr><td>トリトンX-100 </td><td> 1.1％（v / v） </td></tr><tr><td>エチレンジアミン四酢酸（EDTA）pH8.0 </td><td> 1.2mM </td></tr><tr><td>トリス-HCl pH 8.1 </td><td> 16.7mM </td></tr><tr><td>塩化ナトリウム（NaCl） </td><td> 167mM </td></tr><tr><td rowspan="2"> DMA溶液</td><td>ジメチルアジピミデート（DMA） </td><td> 10mM </td></tr><tr><td>リン酸緩衝食塩水（PBS） </td><td> 1倍</td></tr><tr><td rowspan="3">溶出バッファー</td><td>ドデシル硫酸ナトリウム（SDS） </td><td> 1％（w / v） </td></tr><tr><td>エチレンジアミン四酢酸（EDTA）pH8.0 </td><td> 10mM </td></tr><tr><td>トリス-HCl pH 8.0 </td><td> 50mM </td></tr><tr><td rowspan="5">高塩濃度緩衝液</td><td>ドデシル硫酸ナトリウム（SDS） </td><td> 0.1％（w / v） </td></tr><tr><td>トリトンX-100 </td><td> 1％（v / v） </td></tr><tr><td>エチレンジアミネトラテトラ酢酸（EDTA）pH8.0 </td><td> 2mM </td></tr><tr><td>トリス-HCl pH 8.1 </td><td> 20mM </td></tr><tr><td>塩化ナトリウム（NaCl） </td><td> 500mM </td></tr><tr><td rowspan="6"> IMDM媒体</td><td>イスコフ改変ダルベッコ培地（IMDM） </td><td> 1倍</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清（FBS） </td><td> 2％（v / v） </td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td> 1倍</td></tr><tr><td>ペプトンプリマトン</td><td> 0.3mg / mL </td></tr><tr><td>ヒトインスリン溶液</td><td> 4.8mg / mL </td></tr><tr><td>最小必須培地非必須アミノ酸（MEM NEAA） </td><td> 1倍</td></tr><tr><td rowspan="4"> LiCl塩緩衝液</td><td>塩化リチウム（LiCl） </td><td> 0.25M </td></tr><tr><td> IGEPAL-CA630 </td><td> 1％（v / v） </td></tr><tr><td>エチレンジアミン四酢酸（EDTA）pH8.0 </td><td> 1mM </td></tr><tr><td>トリス-HCl pH8。1 </td><td> 10mM </td></tr><tr><td rowspan="5">低塩分緩衝液</td><td>ドデシル硫酸ナトリウム（SDS） </td><td> 0.1％（w / v） </td></tr><tr><td>トリトンX-100 </td><td> 1％（v / v） </td></tr><tr><td>エチレンジアミン四酢酸（EDTA）pH8.0 </td><td> 2mM </td></tr><tr><td>トリス-HCl pH 8.1 </td><td> 20mM </td></tr><tr><td>塩化ナトリウム（NaCl） </td><td> 150mM </td></tr><tr><td rowspan="5">プロテインAセファロースビーズ洗浄バッファー</td><td>トリス-HCl pH 8.0 </td><td> 20mM </td></tr><tr><td>塩化ナトリウム（NaCl） </td><td> 500mM </td></tr><tr><td>エチレンジアミン四酢酸（EDTA）pH8.0 </td><td> 2mM </td></tr><tr><td>ドデシル硫酸ナトリウム（SDS） </td><td> 0.1％（w / v） </td></tr><tr><td> IGEPAL-CA630 </td><td> 1％（v / v） </td></tr><tr><td rowspan="3"> SDS溶解緩衝液</td><td>ドデシル硫酸ナトリウム（SDS） </td><td> 1％（w / v） </td></tr><tr><td>エチレンジアミンアミノテトラ酢酸（EDTA）pH8.0 </td><td> 10mM </td></tr><tr><td>トリス-HCl pH 8.1 </td><td> 50mM </td></tr><tr><td rowspan="2"> TE緩衝液</td><td>トリス-HCl pH 8.0 </td><td> 10mM </td></tr><tr><td>エチレンジアミン四酢酸（EDTA）pH8.0 </td><td> 1mM </td></tr></tbody></table> 表1：このプロトコルで使用されるバッファおよび媒体のリスト。 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td> に </td><td> オフ </td></tr><tr><td>最大電力</td><td> 150.0。 </td><td> 2.5 </td></tr><tr><td>デューティファクタ</td><td> 15.0 </td><td> 15.0 </td></tr><tr><td>サイクル/バースト</td><td> 500 </td><td> 500 </td></tr><tr><td>サイクル数</td><td colspan="2"> 28 </td></tr></tbody></table>表2：このプロトコルで使用されるシャーリング設定。これらの条件は、成熟マウスT細胞株に対して最適化されている。 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 抗体 </td><td> サプライヤー </td><td> 抗体/免疫沈降の量 </td><td> 細胞量/免疫沈降 </td><td> 洗濯条件 </td></tr><tr><td> H3 </td><td>アブカム（ab1791） </td><td> 2.5 mg </td><td> 5×10 6 </td><td>いったん低塩緩衝液に入れ、高塩緩衝液で2回、LiCl塩緩衝液で2回、TE緩衝液で3回</td></tr><tr><td> H3K4me1 </td><td>アブカム（ab8895） </td><td> 2.5 mg </td><td> 5×10 6 </td><td>いったん低塩緩衝液に入れ、高塩緩衝液で2回、LiCl塩緩衝液で2回、TE緩衝液で3回</td></tr><tr><td> H3K4me3 </td><td>ジアゲノド（pAb-003-050） </td><td> 2.5 mg </td><td> 5×10 6 </td><td>いったん低塩緩衝液に入れ、高塩緩衝液で2回、LiCl塩緩衝液で2回、TE緩衝液で3回</td></tr><tr><td> H3K27ac </td><td>ジアゲノイド（pAb-174-050） </td><td> 2.5 mg </td><td> 5×10 6 </td><td>低塩緩衝液中のOce、高塩濃度緩衝液中で2回、LiCl塩緩衝液中で2回およびTE緩衝液中で3回</td></tr><tr><td> IgG </td><td>ジアゲノド（C15410206） </td><td>変数* </td><td>変数* </td><td>変数* </td></tr><tr><td colspan="5"> IgGコントロールの場合、抗体および細胞の両方の量、ならびに洗浄工程は、他の免疫沈降の条件を反映しなければならない。 </td></tr></tbody></table> 表3：本研究で用いた抗体および洗浄条件。 <table border="1" fo:keep-together.within-page = &quot;1&quot; fo：keep-with-next.within-page = &quot;always&quot;&gt; <tbody><tr><td> 遺伝子 </td><td> フォワードプライマー </td><td> リバースプライマー </td><td> プローブ </td></tr><tr><td> Gapdhプロモーター （0kb） </td><td> 5&#39;-GGG TTC CTA TAA ATA CGG ACT GC-3 &#39; </td><td> 5&#39;-CTG GCA CTG C​​AC AAG AAG A-3 &#39; </td><td> 68 </td></tr><tr><td> Dtx1エンハンサー （+ 26kb ） </td><td> 5&#39;-CTC TGG GTT GTA GGG GAC AG-3 &#39; </td><td> 5&#39;-GCA TGG GAA CTG TGT TAC AGA A-3 &#39; </td><td> 27 </td></tr><tr><td> 遺伝子砂漠 </td><td> 5&#39;-CAA TGCATGGGTCCAGATTT-3 &#39; </td><td> 5&#39;-ATT GGC ACG GAA GTA GTG CT-3 &#39; </td><td> 94 </td></tr></tbody></table> 表4：この研究におけるqPCRに使用されるプライマーおよびプローブ。 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page = &quot;always&quot;&gt; <tbody><tr><td> 問題 </td><td> 原因 </td><td> 溶液 </td></tr><tr><td rowspan="3">クロマチンは剪断されており、断片は大きすぎます。 </td><td>あまりにも多くの細胞が使用されている。 </td><td>細胞の数を減らす。 </td></tr><tr><td rowspan="2">せん断が低すぎます。 </td><td>せん断サイクル数を増やす。 </td></tr><tr><td>せん断ピーク電力、デューティファクタおよび/またはサイクル/バーストを増加させる。 </td></tr><tr><td rowspan="3">クロマチンが剪断され、断片が小さすぎます。 </td><td>使用された細胞が少なすぎます。 </td><td>細胞の数を増やす。 </td></tr><tr><td rowspan="2">せん断が高すぎます。 </td><td>せん断サイクル数を減らす。 </td></tr><tr><td>せん断ピーク電力、デューティファクタおよび/またはサイクル/バーストを低減する。 </td></tr><tr><td rowspan="11">私よりも回復が低すぎるgGコントロールおよび/またはネガティブコントロール（高いバックグラウンド）。 </td><td>実験に使用されるクロマチンが足りません。 </td><td>クロマチンの量を増やす。 </td></tr><tr><td>抗体の量が少なすぎます。 </td><td>抗体の量を増やしてください。 </td></tr><tr><td>抗体の量が多すぎます。 </td><td>抗体の量を減らす。 </td></tr><tr><td>この抗体は特異性が低い。 </td><td>抗体を交換する。 </td></tr><tr><td rowspan="2">洗濯条件が厳しすぎる。 </td><td>洗濯回数を減らす。 </td></tr><tr><td>洗浄バッファーのストリンジェンシーを下げてください。 </td></tr><tr><td rowspan="2">洗濯条件は厳格ではありません。 </td><td>洗濯回数を増やしてください。 </td></tr><tr><td>洗浄バッファーのストリンジェンシーを増加させます。 </td></tr><tr><td> qPCRには多量のDNAをピペットで分注した。 </td><td> qPCRでピペッティングされたDNAの量を減らす。 </td></tr><tr><td rowspan="2"> qPCR条件は最適ではない。 </td><td> qPCR条件を最適化する。 </td></tr><tr><td>サイクル数を減らしてください。 </td></tr><tr><td rowspan="4">入力サンプルのqPCR反応が低すぎる製品も製品もありません。 </td><td>十分なDNAがqPCRにピペッティングされていません。 </td><td> qPCRでピペッティングされたDNAの量を増やします。 </td></tr><tr><td rowspan="2"> qPCR条件は最適ではない。 </td><td> qPCR条件を最適化する。 </td></tr><tr><td>サイクル数を増やしてください。 </td></tr><tr><td>実験に使用されるクロマチンが足りません。 </td><td>クロマチンの量を増やす。 </td></tr><tr><td rowspan="4">陽性対照および/またはpanH3 ChIPにシグナルがない。 </td><td>実験に使用されるクロマチンが足りません。 </td><td>クロマチンの量を増やす。 </td></tr><tr><td>抗体の量が少なすぎます。 </td><td>抗体の量を増やしてください。 </td></tr><tr><td>アンチ体は特異性が低い。 </td><td>抗体を交換する。 </td></tr><tr><td>溶出は最適ではない。 </td><td>溶液中でビーズを維持するために、サンプルを頻繁にボルテックスしてください。 </td></tr></tbody></table> 表5：トラブルシューティング

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Chromatin Immunoprecipitation ChIP in Mouse T-cell Lines

この研究は、成熟マウスT細胞株を用いたクロマチン免疫沈降（ChIP）のためのプロトコールを記載している。このプロトコルは、特定のプロモーター部位またはゲノムワイドにおける特定のヒストンマークの分布を調べるのに適しています。

マウスT細胞株におけるクロマチン免疫沈降（ChIP）

Signaling pathways regulate gene expression programs via the modulation of the chromatin structure at different levels, such as by post-translational ...

chromatin-immunoprecipitation-chip-in-mouse-t-cell-lines

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Genetics

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) in Mouse T-cell Lines

18.2K ビュー.  University of Giessen. この研究は、成熟マウスT細胞株を用いたクロマチン免疫沈降（ChIP）のためのプロトコールを記載している。このプロトコルは、特定のプロモーター部位またはゲノムワイドにおける特定のヒストンマークの分布を調べるのに適しています。 

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Improved Protocol for Chromatin Immunoprecipitation from Mouse Skeletal Muscle

We describe an efficient and reproducible protocol for the preparation of chromatin from adult mouse skeletal muscle, a physically resistant tissue with a high content of structural proteins. Dissected limb muscles from adult mice are physically disrupted by mechanical homogenisation, or a combination of mincing and douncing, in a hypotonic buffer before formaldehyde fixation of the cell lysate. The fixed nuclei are purified by further cycles of mechanical homogenisation or douncing and sequential filtrations to remove cell debris. The purified nuclei can be sonicated immediately or at a later stage after freezing. The chromatin can be efficiently sonicated and is suitable for chromatin immunoprecipitation experiments, as illustrated by the profiles obtained for transcription factors, RNA polymerase II, and covalent histone modifications. The binding events detected using chromatin prepared by this protocol are predominantly those taking place in the muscle fiber nuclei despite the presence of chromatin from other fiber-associated satellite and endothelial cells. This protocol is therefore adapted to study gene regulation in the adult mouse skeletal muscle.

A novel protocol for the preparation of chromatin from adult mouse skeletal muscle adapted to the study of gene regulation in muscle fibers by chromatin immunoprecipitation is presented.

クロマチン免疫沈降マウス骨格筋からの改善されたプロトコル

We describe an efficient and reproducible protocol for the preparation of chromatin from adult mouse skeletal muscle, a physically resistant tissue with a ...

生化学

Chromatin Immunoprecipitation of Murine Brown Adipose Tissue

Most cellular processes are regulated by transcriptional modulation of specific gene programs. Such modulation is achieved through the combined actions of a wide range of transcription factors (TFs) and cofactors mediating transcriptional activation or repression via changes in chromatin structure. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a useful molecular biology approach for mapping histone modifications and profiling transcription factors/cofactors binding to DNA, thus providing a snapshot of the dynamic nuclear changes occurring during different biological processes.
To study transcriptional regulation in adipose tissue, samples derived from in vitro cell cultures of immortalized or primary cell lines are often favored in ChIP assays because of the abundance of starting material and reduced biological variability. However, these models represent a limited snapshot of the actual chromatin state in living organisms. Thus, there is a critical need for optimized protocols to perform ChIP on adipose tissue samples derived from animal models.
Here we describe a protocol for efficient ChIP-seq of both histone modifications and non-histone proteins in brown adipose tissue (BAT) isolated from a mouse. The protocol is optimized for investigating genome-wide localization of proteins of interest and epigenetic markers in the BAT, which is a morphologically and physiologically distinct tissue amongst fat depots.

Here we describe a protocol for efficient chromatin immunoprecipitation (ChIP) followed by high-throughput DNA sequencing (ChIP-seq) of brown adipose tissue (BAT) isolated from a mouse. This protocol is suitable for both mapping histone modifications and investigating genome-wide localization of non-histone proteins of interest in vivo.

マウスの褐色脂肪組織のクロマチン免疫沈降

Most cellular processes are regulated by transcriptional modulation of specific gene programs. Such modulation is achieved through the combined actions of ...

遺伝学

Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are characterized by two fundamental properties: self-renewal and multipotency that allows a stem cell to differentiate into virtually any cell type 1. The progression stem cell to differentiated cell is characterized by loss of multipotency, structural and morphological changes and the hierarchic activity of transcription factors and signaling molecules, whose activities establish and maintain cell-type specific gene expression patterns. At the molecular level, cell differentiation involves dynamic changes of the structure and composition of chromatin and the detection of those dynamic changes can provide valuable insights into the functional features of stem cells and the cell differentiation process 2,3. Chromatin is a highly compacted DNA-protein complex that forms when cells package chromosomal DNA with proteins, mainly histones 4. Stemcellness and cell differentiation has been correlated with the presence of specific arrays of regulatory proteins such as epigenetic factors, histone variants, and transcription factors 2,3,5.
 Chromatin immunoprecipitation (ChIP) provides a valuable method to monitor the presence of RNA, proteins, and protein modifications in chromatin 6,7. The comparison of chromatin from different cell types can elucidate dynamic changes in protein-chromatin associations that occur during cell differentiation.
Chromatin immunoprecipitation involves the purification of in vivo cross-linked chromatin. The isolated chromatin is reduced to smaller fragments by enzymatic digestion or mechanical force. Chromatin fragments are precipitated using specific antibodies to target proteins or protein and DNA modifications. The precipitated DNA or RNA is purified and used as a template for PCR or DNA microarray based assays. Prerequisites for a successful ChIP are high quality antibodies to the desired antigen and the availability of chromatin from control cells that do not express the target molecule. ChIP can correlate the presence of proteins, protein and RNA modifications, and RNA with specific target DNA, and depending on the choice of outread tool, detects the association of target molecules at specific target genes or in the context of an entire genome. The comparison of the distribution of proteins in the chromatin of differentiating cells can elucidate the dynamic changes of chromatin composition that coincide with the progression of cells along a cell lineage.

The differentiation of ESC coincides with cell-type specific changes in the structure and composition of chromatin. The detection of those changes provides valuable insights into the mechanisms that define stemcellness and cell differentiation. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) represents a valuable method to dissect the molecular mechanisms underlying stem cell differentiation.

ヒト胚性幹細胞からクロマチン免疫沈降

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are ...

生物学

Chromatin Immunoprecipitation Assay Using Micrococcal Nucleases in Mammalian Cells

To express cellular phenotypes in organisms, living cells execute gene expression accordingly, and transcriptional programs play a central role in gene expression. The cellular transcriptional machinery and its chromatin modification proteins coordinate to regulate transcription. To analyze transcriptional regulation at the molecular level, several experimental methods such as electrophoretic mobility shift, transient reporter and chromatin immunoprecipitation (ChIP) assays are available. We describe a modified ChIP assay in detail in this article because of its advantages in directly showing histone modifications and the interactions between proteins and DNA in cells. One of the key steps in a successful ChIP assay is chromatin shearing. Although sonication is commonly used for shearing chromatin, it is difficult to identify reproducible conditions. Instead of shearing chromatin by sonication, we utilized enzymatic digestion with micrococcal nuclease (MNase) to obtain more reproducible results. In this article, we provide a straightforward ChIP assay protocol using MNase.

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool for understanding the molecular mechanisms of gene regulation. However, the method involves difficulties in obtaining reproducible chromatin fragmentation by mechanical shearing. Here, we provide an improved protocol for a ChIP assay using enzymatic digestion.

哺乳類細胞における微小コッカルヌクレアーゼを用いてクロマチン免疫沈殿アッセイ

To express cellular phenotypes in organisms, living cells execute gene expression accordingly, and transcriptional programs play a central role in gene ...

High-Resolution Mapping of Protein-DNA Interactions in Mouse Stem Cell-Derived Neurons using Chromatin Immunoprecipitation-Exonuclease (ChIP-Exo)

Identification of specific protein-DNA interactions on the genome is important for understanding gene regulation. Chromatin immunoprecipitation coupled with high-throughput sequencing (ChIP-seq) is widely used to identify genome-wide binding locations of DNA-binding proteins. However, the ChIP-seq method is limited by its heterogeneity in length of sonicated DNA fragments and non-specific background DNA, resulting in low mapping resolution and uncertainty in DNA-binding sites. To overcome these limitations, the combination of ChIP with exonuclease digestion (ChIP-exo) utilizes 5&#8217; to 3&#8217; exonuclease digestion to trim the heterogeneously sized immunoprecipitated DNA to the protein-DNA crosslinking site. Exonuclease treatment also eliminates non-specific background DNA. The library-prepared and exonuclease-digested DNA can be sent for high-throughput sequencing. The ChIP-exo method allows for near base-pair mapping resolution with greater detection sensitivity and reduced background signal. An optimized ChIP-exo protocol for mammalian cells and next-generation sequencing is described below.

High-Resolution Mapping of Protein-DNA Interactions in Mouse Stem Cell-Derived Neurons using Chromatin Immunoprecipitation-Exonuclease ChIP-Exo

Precise determination of protein-binding locations across the genome is important for understanding gene regulation. Here we describe a&#160;genomic mapping method that treats chromatin-immunoprecipitated DNA with exonuclease digestion (ChIP-exo) followed by high-throughput sequencing. This method detects protein-DNA interactions with near base-pair mapping resolution and high signal-to-noise ratio in mammalian neurons.

クロマチン免疫沈降-エキソヌクレアーゼ(ChIP-Exo)を用いたマウス幹細胞由来ニューロンにおけるタンパク質-DNA相互作用の高分解能マッピング

Identification of specific protein-DNA interactions on the genome is important for understanding gene regulation. Chromatin immunoprecipitation coupled ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

In response to a variety of extracellular ligands, the STAT (signal transducer and activator of transcription) transcription factors are rapidly recruited from their latent state in the cytoplasm to cell surface receptors where they are activated by phosphorylation at a single tyrosine residue1. They then dimerize and translocate to the nucleus to drive the transcription of target genes, affecting growth, differentiation, homeostasis and the immune response. Not surprisingly, given their widespread involvement in normal cell processes, dysregulation of STAT function contributes to human disease, particularly to cancers2 and autoimmune diseases3. It is well established that transcription is regulated by alterations to the chromatin template4,5. These alterations include the activities of ATP-dependent complexes, as well as covalent histone modifications and DNA methylation6. Because STAT activation of gene expression is both rapid and transient, it requires specific mechanisms for modulating the chromatin template at STAT-dependent gene loci. To define these mechanisms, we characterize the histone modifications and the enzymatic activities that generate them at gene loci that respond to STAT signaling. This protocol describes chromatin immunoprecipitation, a method that is valuable for the study of STAT signaling to chromatin in activated gene expression.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

This protocol describes how chromatin immunoprecipitation (ChIP) is used to study the dynamic alterations to the chromatin template that regulate transcription induced by a signal transduction pathway.

ヒト細胞において活性化遺伝子発現のアッセイのダイナミックヒストン修飾のクロマチン免疫沈降（ChIP）

In response to a variety of extracellular ligands, the STAT (signal transducer and activator of transcription) transcription factors are rapidly recruited ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for Tissue-specific Genes using Early-stage Mouse Embryos

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This technique has been widely exploited in tissue culture cells, and to a lesser extent, in primary tissue. The application of ChIP to rodent embryonic tissue, especially at early times of development, is complicated by the limited amount of tissue and the heterogeneity of cell and tissue types in the embryo. Here we present a method to perform ChIP using a dissociated embryonic day 8.5 (E8.5) embryo. Sheared chromatin from a single E8.5 embryo can be divided into up to five aliquots, which allows the investigator sufficient material for controls and for investigation of specific protein:chromatin interactions.
We have utilized this technique to begin to document protein:chromatin interactions during the specification of tissue-specific gene expression programs. The heterogeneity of cell types in an embryo necessarily restricts the application of this technique because the result is the detection of protein:chromatin interactions without distinguishing whether the interactions occur in all, a subset of, or a single cell type(s). However, examination of tissue-specific genes during or following the onset of tissue-specific gene expression is feasible for two reasons. First, immunoprecipitation of tissue specific factors necessarily isolates chromatin from the cell type where the factor is expressed. Second, immunoprecipitation of coactivators and histones containing post-translational modifications that are associated with gene activation should only be found at genes and gene regulatory sequences in the cell type where the gene is being or has been activated. The technique should be applicable to the study of most tissue-specific gene activation events.
In the example described below, we utilized E8.5 and E9.5 mouse embryos to examine factor binding at a skeletal muscle specific gene promoter. Somites, which are the precursor tissues from which the skeletal muscles of the trunk and limbs will form, are present at E8.5-9.54,5. Myogenin is a regulatory factor required for skeletal muscle differentiation 6-9. The data demonstrate that myogenin is associated with its own promoter in E8.5 and E9.5 embryos. Because myogenin is only expressed in somites at this stage of development 6,10, the data indicate that myogenin interactions with its own promoter have already occurred in skeletal muscle precursor cells in E8.5 embryos.

We demonstrate a chromatin immunoprecipitation (ChIP) method to identify factor interactions at tissue-specific genes during or after the onset of tissue-specific gene expression in mouse embryonic tissue. This protocol should be widely applicable for the study of tissue-specific gene activation as it occurs during normal embryonic development.

初期段階のマウス胚を用いて組織特異的遺伝子のためのクロマチン免疫沈降アッセイ

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This ...

Efficient Chromatin Immunoprecipitation using Limiting Amounts of Biomass

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used method for determining the interactions of different proteins with DNA in chromatin of living cells. Examples include sequence-specific DNA binding transcription factors, histones and their different modification states, enzymes such as RNA polymerases and ancillary factors, and DNA repair components. Despite its ubiquity, there is a lack of up-to-date, detailed methodologies for both bench preparation of material and for accurate analysis allowing quantitative metrics of interaction. Due to this lack of information, and also because, like any immunoprecipitation, conditions must be re-optimized for new sets of experimental conditions, the ChIP assay is susceptible to inaccurate or poorly quantitative results.
Our protocol is ultimately derived from seminal work on transcription factor:DNA interactions1,2 , but incorporates a number of improvements to sensitivity and reproducibility for difficult-to-obtain cell types. The protocol has been used successfully3,4 , both using qPCR to quantify DNA enrichment, or using a semi-quantitative variant of the below protocol.
This quantitative analysis of PCR-amplified material is performed computationally, and represents a limiting factor in the assay. Important controls and other considerations include the use of an isotype-matched antibody, as well as evaluation of a control region of genomic DNA, such as an intergenic region predicted not to be bound by the protein under study (or anticipated not to show changes under the experimental conditions). In addition, a standard curve of input material for every ChIP sample is used to derive absolute levels of enrichment in the experimental material. Use of standard curves helps to take into account differences between primer sets, regardless of how carefully they are designed, and also efficiency differences throughout the range of template concentrations for a single primer set. Our protocol is different from others that are available5-8 in that we extensively cover the later, analysis phase.

We describe a robust method for chromatin immunoprecipitation using primary T cells. The method is founded on standard approaches, but uses a specific set of conditions and reagents that improve efficiency for limited a quantities of cells. Importantly, a detailed description of the data analysis phase is presented.

バイオマスの制限額を使用して効率的なクロマチン免疫沈降

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a  widely-used method for determining the interactions of different proteins with  DNA in chromatin of living ...

TChIP-Seq: Cell-Type-Specific Epigenome Profiling

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological functions have been extensively studied. Indeed, the advent of next-generation deep sequencing and chromatin immunoprecipitation (ChIP) via specific histone modification antibodies has revolutionized our view of epigenetic regulation across the genome. Conversely, tissues typically consist of diverse cell types, and their complex mixture poses analytic challenges to investigating the epigenome in a particular cell type. To address the cell type-specific chromatin state in a genome-wide manner, we recently developed tandem chromatin immunoprecipitation sequencing (tChIP-Seq), which is based on the selective purification of chromatin by tagged core histone proteins from cell types of interest, followed by ChIP-Seq. The goal of this protocol is the introduction of best practices of tChIP-Seq. This technique provides a versatile tool for tissue-specific epigenome investigation in diverse histone modifications and model organisms.

We describe a step-by-step protocol for tandem chromatin immunoprecipitation sequencing (tChIP-Seq) that enables the analysis of cell-type-specific genome-wide histone modification.

TChIP-Seq: 細胞型特異エピゲノムのプロファイリング

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological ...

Chromatin Extraction from Frozen Chimeric Liver Tissue for Chromatin Immunoprecipitation Analysis

Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation (X-ChIP) is a widely used technique to assess levels of histone marks and occupancy of transcription factors on host and/or pathogen chromatin. Chromatin preparation from tissues creates additional challenges that need to be overcome to obtain reproducible and reliable protocols comparable to those used for cell culture. Tissue disruption and fixation are critical steps to achieve efficient shearing of chromatin. Coexistence of different cell types and clusters may also require different shearing times to reach optimal fragment size and hinders shearing reproducibility. The purpose of this method is to achieve reliable and reproducible host chromatin preparations from frozen tissue (liver) suitable for both ChIP-qPCR and next generation sequencing (NGS) applications. We observed that the combination of liquid nitrogen tissue pulverization followed by homogenization leads to increased reproducibility compared to homogenization only, since it provides a suspension consisting mostly of dissociated single cells that can be efficiently sheared. Moreover, the fixation step should be performed under mild rotation to provide homogeneous crosslinking. The fixed material is then suitable for buffer-based nuclei isolation, to reduce contamination of cytoplasmic protein and pathogen DNAs and RNAs (when applicable), avoiding time-consuming centrifugation gradients. Subsequent sonication will complete nuclear lysis and shear the chromatin, producing a specific size range according to the chosen shearing conditions. The size range should fall between 100 and 300 nt for NGS applications, while it could be higher (300-700 nt) for ChIP-qPCR analysis. Such protocol adaptations can greatly improve chromatin analyses from frozen tissue specimens.

This protocol focuses on chromatin preparation from snap frozen tissues and it is suitable for Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation (X-ChIP) followed by either quantitative PCR analysis (X-ChIP-qPCR) or next generation sequencing approaches (X-ChIP-seq).

クロマチン免疫沈降分析のための凍結キメラ肝臓組織からのクロマチン抽出

Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation (X-ChIP) is a widely used technique to assess levels of histone marks and occupancy of transcription factors on ...