Name: chromatin immunoprecipitation (chip) in mouse t-cell lines
Uploaded: 2017-06-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 39 s
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Agradecemos a P. Käse e T. Schmidt-Wöll pela excelente assistência técnica. Este trabalho foi apoiado pela bolsa de pesquisa colaborativa TRR81 e o programa Heisenberg (BO 1639 / 5-1) da DFG (Fundação Alemã de Pesquisa), a Sociedade Max Planck e o EXC 294 em Freiburg e o Cluster de Excelência para o Sistema Cardio Pulmonar (ECCPS) em Giessen para TB

NOTA: Todos os buffers e o meio utilizado neste protocolo estão listados na Tabela 1 . Dias 1 e 2 1. Crosslinking the Cells <ol><li> Transfira as células-tronco de uma placa de 6 poços para um tubo de 50 mL e centrifugue durante 5 min a 4 ° C e ~ 271 x g. Ressuspender o sedimento celular em 30 mL de meio de cultura celular IMDM e contar as células usando uma câmara Neubauer. </li><li> Coletar alíquotas de 20 x 10 6 células em novos tubos de 50 mL. </li><li> Adicionar formaldeído (FMA) a uma concentração final de 1% diretamente no meio de cultura celular e incubar à temperatura ambiente durante 10 min. Cuidado: FMA é tóxico se inalado, então trabalhe sob uma chaminé e use equipamento de proteção adequado. Além disso, lide com os resíduos FMA de acordo com as regras da instituição anfitriã. </li><li> Adicionar um volume 1/8 de glicina 1 M, pH 7,0, e incubar à temperatura ambiente durante 5 min. </li><li> Pellet as células por centrifugação por 5Min a 4 ° C e ~ 271 xg e lavar com 10 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS). </li><li> Lave o sedimento celular com 1 mL de PBS e transfira para tubos de 1,5 mL. </li></ol> 2. Lise celular e Cisma de cromatina <ol><li> Ressuspender o sedimento celular em 1 mL de tampão de lise SDS e incubar em gelo durante 10 min. </li><li> Transfira cada amostra para um tubo de sonicação e realize o corte usando um ultra-som focalizado de acordo com as configurações indicadas na Tabela 2. </li><li> Após o corte, transferir as amostras para tubos de 1,5 mL e centrifugar durante 10 min a 4 ° C e ~ 18,000 x g. </li><li> Transfira o sobrenadante para tubos novos. </li><li> Recolher 50 μL para determinar a eficiência de corte de acordo com o passo 3 e congelar instantaneamente o lisado cortado em nitrogênio líquido. Armazene o lisado em alíquotas de uso único a -80 ° C. </li></ol> 3. Determinação da Eficiência de Cisalha <ol><li> Adicionar 50 μL de tampão de eluição ao 50 &amp; #181; L de cada lisado cortado e incubar a 65 ° C durante a noite, com agitação. </li><li> Adicionar 100 μL de tampão TE e 4 μL de RNase A 10 mg / mL (concentração final 0,2 μg / μL). Misture e incube durante 2 h a 37 ° C, com agitação. </li><li> Adicionar 2 μL de 20 mg / mL de proteinase K (0,2 μg / μL de concentração final) a cada amostra e incubar durante 2 h a 55 ° C, com agitação. </li><li> Transfira cada amostra para um tubo de gel adequado para extração de fenol / clorofórmio / álcool isoamílico; Manipular de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Adicione 200 μL de álcool fenol / clorofórmio / isoamílico (25: 24: 1) e agite os tubos. Centrifugar por 5 min a 24 ° C e ~ 16.000 xg e transferir a fase superior para novos tubos. Cuidado: fenol, clorofórmio e álcool isoamílico são tóxicos se inalados e são corrosivos; Trabalhe sob uma chaminé e use equipamento de proteção pessoal apropriado. Além disso, lidar com resíduos de álcool isoamílico, fenol, clorofórmio eDe acordo com as regras da instituição anfitriã. <ol><li> Repita uma vez. </li></ol></li><li> Purifique o DNA usando colunas de purificação de acordo com as instruções do fabricante, com as seguintes modificações: <ol><li> Lave a membrana duas vezes. Após a última lavagem, deixe o tubo aberto durante 2 minutos à temperatura ambiente para evaporar o etanol residual. </li><li> Para a eluição, adicionar 50 μL de H 2 O, incubar à temperatura ambiente durante 1 min, girar o tubo durante 1 s para molhar adequadamente a membrana e incubar à temperatura ambiente durante 1 min antes de eluir o DNA por centrifugação durante 1 min a 24 ° C e ~ 17.900 x g. </li></ol></li><li> Quantifique o DNA purificado em um fluorômetro usando um kit de alta sensibilidade de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Analisar aproximadamente 500 ng do DNA purificado em um gel de agarose 1,8% e aproximadamente 1 ng em um sistema de eletroforese usando um kit de alta sensibilidade. NOTA: O esperadoE dos fragmentos de DNA está entre 200 e 500 pb. </li></ol> Dias 3 e 4 4. Imunoprecipitação <ol><li> Diluir 1 volume de lisado cortado com 5 volumes de tampão de diluição. </li><li> Preclear com 30 μL / mL de proteína A gotas de agarose (preparadas de acordo com o apêndice A ) durante 30 min enquanto gira na sala fria. </li><li> Centrifugar a 4 ° C durante 5 min a ~ 750 x g. </li><li> Coletar 10% da entrada e armazená-la a 4 ° C. </li><li> Alíquota a quantidade desejada de lisado em novos tubos (ver Tabela 3 para detalhes). Adicione os anticorpos desejados a cada tubo (ver Tabela 3 para detalhes) e gire durante a noite a 4 ° C. </li><li> Adicione 40 μL de esferas de proteína A e incube durante 1 h a 4 ° C enquanto gira. </li><li> Lave as esferas com 1 mL de tampão de baixo teor de sal, tampão de alto teor de sal, tampão de LiCl e tampão TE (para cada lavagem, incube durante 5 minutos a 4 ° C enquanto gira e centrifugaPor 3 minutos a 4 ° C e ~ 950 xg). Consulte a Tabela 3 para obter detalhes. </li><li> Adicionar 110 μL de tampão de eluição e incubar durante 15 minutos à temperatura ambiente, em vórtice a cada 2 min. </li><li> Centrifugar durante 3 minutos a 4 ° C e ~ 950 xg e transferir 100 μL de sobrenadante para um novo tubo de 1,5 mL. </li><li> Repita as etapas 4.7-4.8 com 100 μL de tampão de eluição e combine os eluatos. Adicione o buffer de eluição até 200 μL para inserir as amostras. </li><li> Incubar todas as amostras durante a noite a 65 ° C, com agitação. </li></ol> Dia 5 5. Purificação de DNA <ol><li> Adicionar 200 μL de tampão TE a cada eluato e 8 μL de RNase A 10 mg / mL (0,2 μg / μL de concentração final). Misture e incube durante 2 h a 37 ° C, com agitação. </li><li> Adicionar 4 μL de 20 μg / mL de proteinase K (0,2 μg / μL de concentração final) a cada eluato e incubar durante 2 h a 55 ° C, com agitação. </li><li> Transfira cada amostra para um gelTubo adequado para extração de fenol / clorofórmio / álcool isoamílico; Manipular de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Adicione 400 μL de álcool fenol / clorofórmio / isoamílico (25: 24: 1) e agite os tubos. Centrifugar durante 5 min a 24 ° C e ~ 16,000 x g. Transfira a fase superior para novos tubos. Cuidado: fenol, clorofórmio e álcool isoamílico são tóxicos se inalados e são corrosivos; Trabalhe sob uma chaminé e use equipamento de proteção pessoal apropriado. Além disso, manipule resíduos de fenol, clorofórmio e álcool isoamílico de acordo com as regras da instituição anfitriã. <ol><li> Repita uma vez. </li></ol></li><li> Purifique o DNA usando colunas de purificação de acordo com as instruções do fabricante, com as seguintes modificações: </li><li> Lave a membrana duas vezes. Após a última lavagem, deixe os tubos abertos durante 2 min a temperatura ambiente para evaporar o etanol residual. </li><li> Para a eluição, adicionar 50 μL de H 2 O, incubar à temperatura ambientePor 1 min, gire os tubos durante 1 s para molhar adequadamente a membrana e incubar à temperatura ambiente durante 1 min antes de eluir o DNA por centrifugação durante 1 min a 24 ° C e ~ 17,900 x g. </li></ol>

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	<li>Rothenberg, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chromatin+landscape+and+transcription+factors+in+T+cell+programming.">The chromatin landscape and transcription factors in T cell programming.</a> Trends Immunol. 35 (5), 195-204 (2014).</li><li>Zhang, J. A., Mortazavi, A., Williams, B. A., Wold, B. J., Rothenberg, E. 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Os autores não têm interesses financeiros concorrentes.

ChIP é uma técnica válida para investigar se as proteínas ou os seus PTMs são enriquecidos em regiões genômicas específicas. Os resultados do ensaio ChIP são muitas vezes difíceis de interpretar por razões biológicas ou técnicas. As razões biológicas são múltiplas e incluem ligação fraca ou indireta de proteínas ao DNA. Há também limitações técnicas, tais como especificidade limitada de anticorpos e lise celular ineficiente ou corte de cromatina. Um guia de solução de problemas ( Tabela 5 ) pode ajudar o leitor a resolver os problemas que podem ser encontrados com os ensaios ChIP. Este protocolo, que faz uso de um dispositivo de ultra-sonografia focado em resfriamento, permite cortar eficientemente a cromatina de uma linha de células T de mouse maduras. O principal passo crítico do protocolo é representado pelo corte da cromatina, que sempre deve ser otimizado para cada tipo de célula. Sugere-se que varie o número de células e o número de ciclos de sonicação. Além disso, ela<html> A eficiência de aring é influenciada negativamente pela presença de precipitados SDS nas amostras, que podem se formar durante a lise das células em gelo com tampão de lise SDS. Neste caso, é melhor incubar a amostra após a lise à temperatura ambiente por alguns minutos para reduzir a presença de precipitados SDS. Recomenda-se otimizar o protocolo para obter fragmentos cortados entre 200 e 500 pb e avaliar sempre a qualidade de cisalhamento das amostras antes de prosseguir com a imunoprecipitação. Além disso, o tempo de fixação, quantidade de anticorpo e / ou células, e as condições de lavagem devem ser otimizadas para cada anticorpo. Mais um passo crítico na elaboração de um procedimento ChIP é a escolha do anticorpo, uma vez que os anticorpos de baixa especificidade reduzem significativamente a eficiência da imunoprecipitação. Anteriormente, um procedimento de teste de qualidade unificado permitiu a avaliação da especificidade de vários anticorpos disponíveis no mercado<html> Ss = &quot;xref&quot;&gt; 19. O pipeline de triagem foi baseado em ponto blot, Western blot e ChIP, fornecendo uma lista de reagentes de alta qualidade adequados para ChIP 19 . Mais recentemente, a especificidade de vários anticorpos comercialmente disponíveis foi avaliada usando plataformas de microarrays de péptidos de histona de alta densidade, permitindo o estabelecimento de um banco de dados sobre especificidade de anticorpos 20 . O leitor pode usar essa ferramenta útil para identificar os anticorpos mais específicos que podem ser usados ​​para experiências de ChIP. Este protocolo não foi testado para células T primárias e, neste caso, o leitor deve consultar outros protocolos publicados que executam com sucesso o ChIP nas células T primárias 3 , 4 , 21 . Notavelmente, este protocolo foi usado com sucesso para executar ChIP em uma linhagem de células T de progenitor de mouse, bem como em uma linha de células endoteliais de mouse. Ove_content &quot;&gt; 5 x 10 6 células devem ser usadas para cada imunoprecipitação para a análise de marcas de histonas. Como este protocolo também pode ser adequado, com alguma otimização, para executar ChIP em TFs ou cofactores, é melhor aumentar o número de células Usado para a imunoprecipitação nesses casos. Para alcançar o número necessário de células para cada experiência, mais alíquotas de lisado cortado podem ser reunidas antes de diluir a cromatina no tampão de diluição. Este protocolo também pode ser modificado para realizar ChIP em proteínas endógenas que não se ligam diretamente ao DNA. Neste caso, a pré-fixação com reticulantes proteína-proteína ( por exemplo, adipimidato de dimetilo, DMA) pode ser necessária (ver Apêndice B para mais informações). O desempenho bem sucedido de ChIP em cofactores foi feito anteriormente por sobreexpressão de proteínas que são fundidas em uma etiqueta de biotina. Neste caso, a proteína foi purificada com estreptavidina-conjugaEsferas magnéticas e magnéticas e uma pré-fixação com DMA foi realizada 22 .

O desenvolvimento, a diferenciação e a homeostasia dependem de programas específicos de expressão gênica que são estabelecidos por eventos de sinalização que modulam a estrutura da cromatina e, portanto, determinam se um gene específico é ativado ou reprimido de uma maneira específica de célula e tempo. Durante o desenvolvimento das células T, programas específicos de expressão gênica devem ser estabelecidos para determinar adequadamente a maturação dos precursores de células T do duplo negativo (DN) para o estado único positivo (SP), passando por vários estádios intermediários 1 . Como o programa de expressão gênica é regulado dinamicamente durante o desenvolvimento das células T foi amplamente investigado em anos anteriores por vários laboratórios 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . Por modificações pós-tradução (PTMs) de histonas, a troca deHistonas canônicas com variantes de histonas, despejo de nucleossomos e metilação de DNA regulam o interruptor de genes ON / OFF. Vários grupos investigaram a distribuição genômica de PTMs e variantes de histonas para determinar marcas associadas a diferentes estados de cromatina nas regiões reguladoras proximal e distal 7 , 8 , 9 , 10 . As cascatas de sinalização orquestram a regulação dinâmica da cromatina através da troca de enzimas modificadoras de cromatina positivas e negativas (também conhecidas como modificadores de cromatina) em elementos potenciadores específicos. Esses modificadores de cromatina regulam a estrutura da cromatina e, portanto, a saída da transcrição, por exemplo, metilação histona e acetilação dinâmica. Este é o caso na via de sinalização Notch 11 , 12 , 13 ,14. PTM de histonas dinâmicas; Trocas com variantes de histonas; E a ocupação dinâmica de histonas, fatores de transcrição e cofatores podem ser investigadas por ensaios de imunoprecipitação com cromatina (ChIP). Anticorpos altamente específicos são usados ​​para purificar complexos de DNA-proteína específicos, e o DNA purificado é analisado por PCR quantitativa (qPCR); Sequenciação profunda (ChIP-Seq); Ou, com menor freqüência hoje em dia, hibridação ao microarray (ChIP-ChIP). Os ensaios ChIP são às vezes desafiadores devido a complicações com a lise das células, corte da cromatina e / ou baixa especificidade dos anticorpos. Várias estratégias foram adotadas para melhorar o protocolo, como é o caso do NEXSON 15 . O uso de sonicadores de banho de água de refrigeração evita o aquecimento da amostra que pode danificar os epítopos presentes na proteína sob investigação, mas a energia necessária para o corte das amostras é dispersa na água.Outra melhoria foi feita com o desenvolvimento de dispositivos de ultra-sonografia focados que impedem a dispersão da energia. Portanto, os dispositivos ultra-sônicos focados permitem melhorias na lise celular e no cisalhamento da cromatina, eliminando as variações induzidas pelo operador e aumentando significativamente a reprodutibilidade. Este trabalho descreve um protocolo (visão geral esquemática na Figura 1 ) para executar eficientemente o ChIP de proteínas histonas em uma linha de células T de mouse maduras chamada E2-10HA 16 , 17 . As células T são geralmente difíceis de lição, e o corte de sua cromatina revelou-se ineficiente. Neste protocolo, que faz uso de um ultra-som focado em resfriamento, o número de células, o buffer de lise e a configuração de cisalhamento foram otimizados para a linha de células T de mouse E2-10HA. Este protocolo permite executar um ChIP com alta reprodutibilidade e em um tempo razoável. Na verdade, ele exigeÉ aproximadamente dois dias para cortar a cromatina e para avaliar a qualidade do corte e três dias para realizar a imunoprecipitação, reverter a reticulação e purificar o DNA.

<table><tbody><tr><td>Agilent High Sensitivity D5000 Reagents</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5593</td><td></td></tr><tr><td>Agilent High Sensitivity D5000 ScreenTape</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5592</td><td></td></tr><tr><td>Agilent Tapestation 4200</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2991AA</td><td></td></tr><tr><td>Covaris S220 AFA System</td><td>Covaris</td><td>500217</td><td></td></tr><tr><td>dimethyl adipimidate (DMA)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>20660</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>Pan-Biotech</td><td>1502-P121301</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde (FMA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>Insulin solution human&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9278-5ML</td><td></td></tr><tr><td>Iscove&#039;s modified Dulbecco&#039;s medium (IMDM)</td><td>Gibco</td><td>21980-032</td><td></td></tr><tr><td>Minimum essential medium non-essential amino acids (MEM NEAA)</td><td>Gibco</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>nProtein A Sepharose 4 Fast Flow</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5280-02</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin&lt;br /&gt;(10,000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Peptone primatone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4963-100G</td><td></td></tr><tr><td>Phase Lock Gel Heavy 2&amp;nbsp;mL</td><td>5 Prime</td><td>2302830</td><td></td></tr><tr><td>Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1)</td><td>Roth</td><td>A156.2</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td><td>GIBCO</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K Solution (20 mg/mL), RNA grade</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25530049</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR Purification Kit (250)</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 3.0 Fluorometer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>Qubit assay tubes</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32854</td><td></td></tr><tr><td>RNase A, DNase and protease-free (10&amp;nbsp;mg/mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>Tube AFA Fiber &amp;amp; Cap</td><td>Covaris</td><td>520081</td><td></td></tr></tbody></table>

chromatin immunoprecipitation (chip) in mouse t-cell lines

As vias de sinalização regulam os programas de expressão gênica através da modulação da estrutura da cromatina em diferentes níveis, tais como modificações pós-tradução (PTMs) das caudas de histonas, troca de histonas canônicas com variantes de histonas e despejo de nucleossomos. Essa regulamentação requer a ligação de fatores de transcrição sensíveis ao sinal (TFs) que recrutam enzimas modificadoras de cromatina em elementos reguladores definidos como potenciadores. Entender como as cascatas de sinalização regulam a atividade do intensificador requer uma análise abrangente da ligação de TFs, enzimas modificadoras de cromatina e a ocupação de marcas de histonas específicas e variantes de histonas. Os ensaios de imunoprecipitação com cromatina (ChIP) utilizam anticorpos altamente específicos para imunoprecipitar complexos específicos de proteína / ADN. A análise subsequente do DNA purificado permite a identificação da região ocupada pela proteína reconhecida pelo anticorpo. Este trabalho descreve um protocolo de forma eficiente paraRIP Chift de proteínas de histonas em uma linha de células T de mouse maduras. O protocolo apresentado permite o desempenho de ensaios ChIP em um prazo razoável e com alta reprodutibilidade.

As células T murinas maduras foram submetidas à análise de ChIP para investigar o enriquecimento da mono-metilação da marca histona da lisina 4 na histona 3 (H3K4me1), tri-metilação da lisina 4 na histona 3 (H3K4me3) e acetilação da lisina 27 no Histona 3 (H3K27ac), bem como a ocupação dos nucleossomos, como revelado pelo panH3 ChIP. A qualidade de corte foi avaliada por análise em um gel de agarose 1,8% ( Figura 2A ) e em um sistema de eletroforese ( Figura 2B ). H3K4me1 e H3K4me3 geralmente são usados ​​para identificar sites e promotores de intensificação, respectivamente ( Figura 3A ). Na verdade, H3K4me3 é proeminente, mas não exclusivamente enriquecido nos promotores 5 , 8 , 14 . Uma característica dos intensificadores ativos deve ser altamente enriquecida para H3K4me1 e H3K27ac e pouco enriquecida para H3K4me3 (&lt;Classe forte = &quot;xfig&quot;&gt; Figura 3A, painel superior), enquanto que os intensificadores inativos apresentam baixos níveis de H3K4me3 e H3K27ac, mas altos níveis de H3K4me1 ( Figura 3A , painel inferior). Conforme mostrado na Figura 3B , o gene Glyceraldehyde 3-phosphate deshydrogenase ( Gapdh ) é representativo da análise de promotores de genes ativos ( promotor de Gapdh ). Na verdade, mostra níveis elevados de H3K4me3 e H3K27ac e baixos níveis de H3K4me1. Na Figura 3B , Deltex1 ( Dtx1 ) é representativo de potenciadores inativos ( Dtx1 enhancer ), pois é altamente enriquecido para H3K4me1 e mal enriquecido para H3K4me3 e H3K27ac. Gene desert é representativo de uma região que não possui genes de codificação e geralmente é processado como um controle negativo para marcas de cromatina ativas. A observação de que H3K4me1, uma marca melhoradora bem aceita 4 , 5 , </sup&gt; 7 , 14 , 18 , não está enriquecido no deserto de gene sugere que esta região não possui potenciadores. <img alt="figura 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55907/55907fig1.jpg" /> Figura 1: Visão geral esquemática do protocolo ChIP apresentado. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55907/55907fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55907/55907fig2.jpg" /> Figura 2: Controle de qualidade de corte da linha de células T maduras do mouse. ( A ) Duas alíquotas diferentes da linha de células T de ratinho maduro E2-10HA foram cortadas e aproximadamente 500 ng de DNA purificado foram analisados ​​em um gel de agarose a 1,8% para avaliar o seu cisalhamentoQualidade. ( B ) 1 ng de ADN purificado da amostra 2 foi analisado por eletroforese para avaliar a sua qualidade de corte. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55907/55907fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55907/55907fig3.jpg" /> Figura 3: marcas de cromatina que caracterizam potenciadores e promotores. ( A ) Os intensificadores ativos (painel superior) são caracterizados por H3K4me1 alto, H3K4me3 baixo e alto H3K27ac, enquanto que os intensificadores inativos (painel inferior) apresentam alta H3K4me1, H3K4me3 baixo e H3K27ac baixo. ( B ) As amostras apresentadas na Figura 2A foram agrupadas e utilizadas para análise de ChIP versus marcas de histonas H3K4me1, H3K4me3 e H3K27ac e ocupação de histonas, conforme revelado por PanH3 ChIP. Esta análise mostra que oE promotor do gene de limpeza da gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase ( promotor Gapdh ) é altamente enriquecido para H3K4me3 e H3K27ac e pouco enriquecido para H3K4me1. Por outro lado, o intensificador do gene inativo Deltex1 ( potenciador Dtx1 ) é altamente enriquecido para H3K4me1 mas pouco enriquecido para H3K4me3 e H3K27ac. O ChIP usando um anticorpo panH3 foi utilizado para investigar a ocupação dos nucleossomos. Gene desert foi usado como um controle negativo. Uma experiência representativa é mostrada. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55907/55907fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Nome do buffer </td><td> Reagente </td><td> Concentração final </td></tr><tr><td rowspan="5"> Tampão de diluição </td><td> Dodec de sódioSulfato de etilo (SDS) </td><td> 0,01% (p / v) </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> 1,1% (v / v) </td></tr><tr><td> Ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA) pH 8,0 </td><td> 1,2 mM </td></tr><tr><td> Tris-HCl pH 8,1 </td><td> 16,7 mM </td></tr><tr><td> Cloreto de sódio (NaCl) </td><td> 167 mM </td></tr><tr><td rowspan="2"> Solução DMA </td><td> Adipimidato de dimetilo (DMA) </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> Solução salina tamponada com fosfato (PBS) </td><td> 1x </td></tr><tr><td rowspan="3"> Buffer de eluição </td><td> Sulfato de dodecils de sódio (SDS) </td><td> 1% (p / v) </td></tr><tr><td> Ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA) pH 8,0 </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> Tris-HCl pH 8,0 </td><td> 50 mM </td></tr><tr><td rowspan="5"> Alto tampão de sal </td><td> Sulfato de dodecils de sódio (SDS) </td><td> 0,1% (p / v) </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> 1% (v / v) </td></tr><tr><td> EthylenediamiÁcido netetraacetico (EDTA) pH 8,0 </td><td> 2 mM </td></tr><tr><td> Tris-HCl pH 8,1 </td><td> 20 mM </td></tr><tr><td> Cloreto de sódio (NaCl) </td><td> 500 mM </td></tr><tr><td rowspan="6"> Meio IMDM </td><td> O meio Dulbecco modificado da Iscove (IMDM) </td><td> 1x </td></tr><tr><td> Soro bovino fetal (FBS) </td><td> 2% (v / v) </td></tr><tr><td> Penicilina / Estreptomicina </td><td> 1x </td></tr><tr><td> Peptona primatona </td><td> 0,3 mg / mL </td></tr><tr><td> Solução de insulina humana </td><td> 4,8 mg / mL </td></tr><tr><td> Ácidos amino essenciais não essenciais essenciais essenciais (MEM NEAA) </td><td> 1x </td></tr><tr><td rowspan="4"> Tampão de sal de LiCl </td><td> Cloreto de lítio (LiCl) </td><td> 0,25 M </td></tr><tr><td> IGEPAL-CA630 </td><td> 1% (v / v) </td></tr><tr><td> Ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA) pH 8,0 </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> Tris-HCl pH 8.1 </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td rowspan="5"> Tampão de sal baixo </td><td> Sulfato de dodecils de sódio (SDS) </td><td> 0,1% (p / v) </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> 1% (v / v) </td></tr><tr><td> Ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA) pH 8,0 </td><td> 2 mM </td></tr><tr><td> Tris-HCl pH 8,1 </td><td> 20 mM </td></tr><tr><td> Cloreto de sódio (NaCl) </td><td> 150 mM </td></tr><tr><td rowspan="5"> Proteína A Sepharose beads buffer de lavagem </td><td> Tris-HCl pH 8,0 </td><td> 20 mM </td></tr><tr><td> Cloreto de sódio (NaCl) </td><td> 500 mM </td></tr><tr><td> Ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA) pH 8,0 </td><td> 2 mM </td></tr><tr><td> Sulfato de dodecils de sódio (SDS) </td><td> 0,1% (p / v) </td></tr><tr><td> IGEPAL-CA630 </td><td> 1% (v / v) </td></tr><tr><td rowspan="3"> SDS Lysis buffer </td><td> Sulfato de dodecils de sódio (SDS) </td><td> 1% (p / v) </td></tr><tr><td> EthylenediÁcido aminetetracético (EDTA) pH 8,0 </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> Tris-HCl pH 8,1 </td><td> 50 mM </td></tr><tr><td rowspan="2"> TE buffer </td><td> Tris-HCl pH 8,0 </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> Ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA) pH 8,0 </td><td> 1 mM </td></tr></tbody></table> Tabela 1: Lista dos buffers e do meio utilizado neste protocolo. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td> EM </td><td> FORA </td></tr><tr><td> Pico de energia </td><td> 150,0 </td><td> 2.5 </td></tr><tr><td> Fator de dever </td><td> 15,0 </td><td> 15,0 </td></tr><tr><td> Ciclos / explosão </td><td> 500 </td><td> 500 </td></tr><tr><td> Número de ciclos </td><td colspan="2"> 28 </td></tr></tbody></table>Tabela 2: Configurações de corte usadas neste protocolo. Estas condições foram otimizadas para uma linha de células T de mouse maduras. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Anticorpo </td><td> Fornecedor </td><td> Quantidade de anticorpo / imunoprecipitação </td><td> Quantidade de células / imunoprecipitação </td><td> Condições de lavagem </td></tr><tr><td> H3 </td><td> Abcam (ab1791) </td><td> 2,5 mg </td><td> 5 x 10 6 </td><td> Uma vez em tampão de sal baixo, duas vezes em tampão de alto teor de sal, duas vezes em tampão de sal LiCl e três vezes em tampão TE </td></tr><tr><td> H3K4me1 </td><td> Abcam (ab8895) </td><td> 2,5 mg </td><td> 5 x 10 6 </td><td> Uma vez em tampão de sal baixo, duas vezes em tampão de alto teor de sal, duas vezes em tampão de sal LiCl e três vezes em tampão TE </td></tr><tr><td> H3K4me3 </td><td> Diagenode (pAb-003-050) </td><td> 2,5 mg </td><td> 5 x 10 6 </td><td> Uma vez em tampão de sal baixo, duas vezes em tampão de alto teor de sal, duas vezes em tampão de sal LiCl e três vezes em tampão TE </td></tr><tr><td> H3K27ac </td><td> Diagenode (pAb-174-050) </td><td> 2,5 mg </td><td> 5 x 10 6 </td><td> Oce em tampão de sal baixo, duas vezes em tampão de alto teor de sal, duas vezes em tampão de sal LiCl e três vezes em tampão TE </td></tr><tr><td> IgG </td><td> Diagenode (C15410206) </td><td> Variável* </td><td> Variável* </td><td> Variável* </td></tr><tr><td colspan="5"> * No caso do controle de IgG, a quantidade de anticorpo e células, bem como as etapas de lavagem, devem refletir as condições das outras imunoprecipitações. </td></tr></tbody></table> Tabela 3: Anticorpos e condições de lavagem utilizados neste estudo. <table border="1" fo:keEp-together.within-page = &quot;1&quot; fo: keep-with-next.within-page = &quot;always&quot;&gt; <tbody><tr><td> Gene </td><td> Guia preliminar </td><td> Primário reverso </td><td> Sonda </td></tr><tr><td> Gapdh promotor (0 kb) </td><td> 5&#39;-GGG TTC CTA TAA ATA CGG ACT GC-3 &#39; </td><td> 5&#39;-CTG GCA CTG CAC AAG AAG A-3 &#39; </td><td> 68 </td></tr><tr><td> Dtx1 enhancer (+26 kb) </td><td> 5&#39;-CTC TGG GTT GTA GGG GAC AG-3 &#39; </td><td> 5&#39;-GCA TGG GAA CTG TGT TAC AGA A-3 &#39; </td><td> 27 </td></tr><tr><td> Deserto de gene </td><td> 5&#39;-CAA TGC ATG GGT CCA GAT TT-3 &#39; </td><td> 5&#39;-ATT GGC ACG GAA GTA GTG CT-3 &#39; </td><td> 94 </td></tr></tbody></table> Tabela 4: Primers e sondas usadas para qPCR neste estudo. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page = &quot;always&quot;&gt; <tbody><tr><td> Problema </td><td> Causas </td><td> Solução </td></tr><tr><td rowspan="3"> A cromatina está cortada e os fragmentos são muito grandes. </td><td> Muitas células foram usadas. </td><td> Reduza o número de células. </td></tr><tr><td rowspan="2"> O corte é muito baixo. </td><td> Aumentar o número de ciclos de cisalhamento. </td></tr><tr><td> Aumente a potência de pico de corte, o fator de serviço e / ou os ciclos / explosão. </td></tr><tr><td rowspan="3"> A cromatina é cortada e os fragmentos são muito pequenos. </td><td> Demasiadas células foram usadas. </td><td> Aumente o número de células. </td></tr><tr><td rowspan="2"> O corte é muito alto. </td><td> Reduza o número de ciclos de cisalhamento. </td></tr><tr><td> Reduza a potência de pico de corte, o fator de serviço e / ou os ciclos / explosão. </td></tr><tr><td rowspan="11"> Recuperação muito baixa sobre IControle gG e / ou controle negativo (fundo alto). </td><td> Não foi utilizada cromatina suficiente para a experiência. </td><td> Aumentar a quantidade de cromatina. </td></tr><tr><td> A quantidade de anticorpo é muito baixa. </td><td> Aumentar a quantidade de anticorpo. </td></tr><tr><td> A quantidade de anticorpo é muito alta. </td><td> Reduza a quantidade de anticorpo. </td></tr><tr><td> O anticorpo possui baixa especificidade. </td><td> Mude o anticorpo. </td></tr><tr><td rowspan="2"> As condições de lavagem são muito rigorosas. </td><td> Reduza o número de lavagem. </td></tr><tr><td> Reduza a rigidez dos buffers de lavagem. </td></tr><tr><td rowspan="2"> As condições de lavagem não são suficientemente rigorosas. </td><td> Aumente o número de lavagem. </td></tr><tr><td> Aumente a rigidez dos buffers de lavagem. </td></tr><tr><td> Muito DNA foi pipetado no qPCR. </td><td> Reduza a quantidade de DNA pipetada no qPCR. </td></tr><tr><td rowspan="2"> As condições do qPCR não são ótimas. </td><td> Otimize as condições do qPCR. </td></tr><tr><td> Reduza o número de ciclos. </td></tr><tr><td rowspan="4"> Nenhum produto ou produto é muito baixo na reação qPCR da amostra de entrada. </td><td> Pouco DNA suficiente foi pipetado no qPCR. </td><td> Aumente a quantidade de DNA pipetada no qPCR. </td></tr><tr><td rowspan="2"> As condições do qPCR não são ótimas. </td><td> Otimize as condições do qPCR. </td></tr><tr><td> Aumentar o número de ciclos. </td></tr><tr><td> Não foi utilizada cromatina suficiente para a experiência. </td><td> Aumentar a quantidade de cromatina. </td></tr><tr><td rowspan="4"> Não há sinal no controle positivo e / ou panH3 ChIP. </td><td> Não foi utilizada cromatina suficiente para a experiência. </td><td> Aumentar a quantidade de cromatina. </td></tr><tr><td> A quantidade de anticorpo é muito baixa. </td><td> Aumentar a quantidade de anticorpo. </td></tr><tr><td> O antiO corpo possui pouca especificidade. </td><td> Mude o anticorpo. </td></tr><tr><td> A eluição é sub-ótima. </td><td> Certifique-se de freqüentemente agitar as amostras para manter as contas em solução. </td></tr></tbody></table> Tabela 5: Solução de problemas.

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Chromatin Immunoprecipitation ChIP in Mouse T-cell Lines

Este trabalho descreve um protocolo para a imunoprecipitação de cromatina (ChIP) usando uma linha de células T de mouse maduras. Este protocolo é adequado para investigar a distribuição de marcas de histonas específicas em locais promotores específicos ou em todo o genoma.

Imunoprecipitação de cromatina (ChIP) em linhas de células T de mouse

Signaling pathways regulate gene expression programs via the modulation of the chromatin structure at different levels, such as by post-translational ...

chromatin-immunoprecipitation-chip-in-mouse-t-cell-lines

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Genetics

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) in Mouse T-cell Lines

18.2K visualizações.  University of Giessen.  Este trabalho descreve um protocolo para a imunoprecipitação de cromatina (ChIP) usando uma linha de células T de mouse maduras. Este protocolo é adequado para investigar a distribuição de marcas de histonas específicas em locais promotores específicos ou em todo o genoma. 

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Improved Protocol for Chromatin Immunoprecipitation from Mouse Skeletal Muscle

We describe an efficient and reproducible protocol for the preparation of chromatin from adult mouse skeletal muscle, a physically resistant tissue with a high content of structural proteins. Dissected limb muscles from adult mice are physically disrupted by mechanical homogenisation, or a combination of mincing and douncing, in a hypotonic buffer before formaldehyde fixation of the cell lysate. The fixed nuclei are purified by further cycles of mechanical homogenisation or douncing and sequential filtrations to remove cell debris. The purified nuclei can be sonicated immediately or at a later stage after freezing. The chromatin can be efficiently sonicated and is suitable for chromatin immunoprecipitation experiments, as illustrated by the profiles obtained for transcription factors, RNA polymerase II, and covalent histone modifications. The binding events detected using chromatin prepared by this protocol are predominantly those taking place in the muscle fiber nuclei despite the presence of chromatin from other fiber-associated satellite and endothelial cells. This protocol is therefore adapted to study gene regulation in the adult mouse skeletal muscle.

A novel protocol for the preparation of chromatin from adult mouse skeletal muscle adapted to the study of gene regulation in muscle fibers by chromatin immunoprecipitation is presented.

Protocolo melhorado por imunoprecipitação da cromatina do músculo esquelético de rato

We describe an efficient and reproducible protocol for the preparation of chromatin from adult mouse skeletal muscle, a physically resistant tissue with a ...

Bioquímica

Chromatin Immunoprecipitation of Murine Brown Adipose Tissue

Most cellular processes are regulated by transcriptional modulation of specific gene programs. Such modulation is achieved through the combined actions of a wide range of transcription factors (TFs) and cofactors mediating transcriptional activation or repression via changes in chromatin structure. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a useful molecular biology approach for mapping histone modifications and profiling transcription factors/cofactors binding to DNA, thus providing a snapshot of the dynamic nuclear changes occurring during different biological processes.
To study transcriptional regulation in adipose tissue, samples derived from in vitro cell cultures of immortalized or primary cell lines are often favored in ChIP assays because of the abundance of starting material and reduced biological variability. However, these models represent a limited snapshot of the actual chromatin state in living organisms. Thus, there is a critical need for optimized protocols to perform ChIP on adipose tissue samples derived from animal models.
Here we describe a protocol for efficient ChIP-seq of both histone modifications and non-histone proteins in brown adipose tissue (BAT) isolated from a mouse. The protocol is optimized for investigating genome-wide localization of proteins of interest and epigenetic markers in the BAT, which is a morphologically and physiologically distinct tissue amongst fat depots.

Here we describe a protocol for efficient chromatin immunoprecipitation (ChIP) followed by high-throughput DNA sequencing (ChIP-seq) of brown adipose tissue (BAT) isolated from a mouse. This protocol is suitable for both mapping histone modifications and investigating genome-wide localization of non-histone proteins of interest in vivo.

Imunoprecipitação da cromatina do tecido de adiposo marrom murino

Most cellular processes are regulated by transcriptional modulation of specific gene programs. Such modulation is achieved through the combined actions of ...

Genética

Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are characterized by two fundamental properties: self-renewal and multipotency that allows a stem cell to differentiate into virtually any cell type 1. The progression stem cell to differentiated cell is characterized by loss of multipotency, structural and morphological changes and the hierarchic activity of transcription factors and signaling molecules, whose activities establish and maintain cell-type specific gene expression patterns. At the molecular level, cell differentiation involves dynamic changes of the structure and composition of chromatin and the detection of those dynamic changes can provide valuable insights into the functional features of stem cells and the cell differentiation process 2,3. Chromatin is a highly compacted DNA-protein complex that forms when cells package chromosomal DNA with proteins, mainly histones 4. Stemcellness and cell differentiation has been correlated with the presence of specific arrays of regulatory proteins such as epigenetic factors, histone variants, and transcription factors 2,3,5.
 Chromatin immunoprecipitation (ChIP) provides a valuable method to monitor the presence of RNA, proteins, and protein modifications in chromatin 6,7. The comparison of chromatin from different cell types can elucidate dynamic changes in protein-chromatin associations that occur during cell differentiation.
Chromatin immunoprecipitation involves the purification of in vivo cross-linked chromatin. The isolated chromatin is reduced to smaller fragments by enzymatic digestion or mechanical force. Chromatin fragments are precipitated using specific antibodies to target proteins or protein and DNA modifications. The precipitated DNA or RNA is purified and used as a template for PCR or DNA microarray based assays. Prerequisites for a successful ChIP are high quality antibodies to the desired antigen and the availability of chromatin from control cells that do not express the target molecule. ChIP can correlate the presence of proteins, protein and RNA modifications, and RNA with specific target DNA, and depending on the choice of outread tool, detects the association of target molecules at specific target genes or in the context of an entire genome. The comparison of the distribution of proteins in the chromatin of differentiating cells can elucidate the dynamic changes of chromatin composition that coincide with the progression of cells along a cell lineage.

The differentiation of ESC coincides with cell-type specific changes in the structure and composition of chromatin. The detection of those changes provides valuable insights into the mechanisms that define stemcellness and cell differentiation. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) represents a valuable method to dissect the molecular mechanisms underlying stem cell differentiation.

Cromatina imunoprecipitação de células estaminais embrionárias humanas

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are ...

Biologia

Chromatin Immunoprecipitation Assay Using Micrococcal Nucleases in Mammalian Cells

To express cellular phenotypes in organisms, living cells execute gene expression accordingly, and transcriptional programs play a central role in gene expression. The cellular transcriptional machinery and its chromatin modification proteins coordinate to regulate transcription. To analyze transcriptional regulation at the molecular level, several experimental methods such as electrophoretic mobility shift, transient reporter and chromatin immunoprecipitation (ChIP) assays are available. We describe a modified ChIP assay in detail in this article because of its advantages in directly showing histone modifications and the interactions between proteins and DNA in cells. One of the key steps in a successful ChIP assay is chromatin shearing. Although sonication is commonly used for shearing chromatin, it is difficult to identify reproducible conditions. Instead of shearing chromatin by sonication, we utilized enzymatic digestion with micrococcal nuclease (MNase) to obtain more reproducible results. In this article, we provide a straightforward ChIP assay protocol using MNase.

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool for understanding the molecular mechanisms of gene regulation. However, the method involves difficulties in obtaining reproducible chromatin fragmentation by mechanical shearing. Here, we provide an improved protocol for a ChIP assay using enzymatic digestion.

Ensaio de imunoprecipitação cromatina utilizando nucleases Microcócicas em células de mamíferos

To express cellular phenotypes in organisms, living cells execute gene expression accordingly, and transcriptional programs play a central role in gene ...

High-Resolution Mapping of Protein-DNA Interactions in Mouse Stem Cell-Derived Neurons using Chromatin Immunoprecipitation-Exonuclease (ChIP-Exo)

Identification of specific protein-DNA interactions on the genome is important for understanding gene regulation. Chromatin immunoprecipitation coupled with high-throughput sequencing (ChIP-seq) is widely used to identify genome-wide binding locations of DNA-binding proteins. However, the ChIP-seq method is limited by its heterogeneity in length of sonicated DNA fragments and non-specific background DNA, resulting in low mapping resolution and uncertainty in DNA-binding sites. To overcome these limitations, the combination of ChIP with exonuclease digestion (ChIP-exo) utilizes 5&#8217; to 3&#8217; exonuclease digestion to trim the heterogeneously sized immunoprecipitated DNA to the protein-DNA crosslinking site. Exonuclease treatment also eliminates non-specific background DNA. The library-prepared and exonuclease-digested DNA can be sent for high-throughput sequencing. The ChIP-exo method allows for near base-pair mapping resolution with greater detection sensitivity and reduced background signal. An optimized ChIP-exo protocol for mammalian cells and next-generation sequencing is described below.

High-Resolution Mapping of Protein-DNA Interactions in Mouse Stem Cell-Derived Neurons using Chromatin Immunoprecipitation-Exonuclease ChIP-Exo

Precise determination of protein-binding locations across the genome is important for understanding gene regulation. Here we describe a&#160;genomic mapping method that treats chromatin-immunoprecipitated DNA with exonuclease digestion (ChIP-exo) followed by high-throughput sequencing. This method detects protein-DNA interactions with near base-pair mapping resolution and high signal-to-noise ratio in mammalian neurons.

Mapeamento de alta resolução de interações proteína-DNA em neurônios derivados de células-tronco do rato usando Chromatin Immunoprecipitation-Exonuclease (ChIP-Exo)

Identification of specific protein-DNA interactions on the genome is important for understanding gene regulation. Chromatin immunoprecipitation coupled ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for Tissue-specific Genes using Early-stage Mouse Embryos

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This technique has been widely exploited in tissue culture cells, and to a lesser extent, in primary tissue. The application of ChIP to rodent embryonic tissue, especially at early times of development, is complicated by the limited amount of tissue and the heterogeneity of cell and tissue types in the embryo. Here we present a method to perform ChIP using a dissociated embryonic day 8.5 (E8.5) embryo. Sheared chromatin from a single E8.5 embryo can be divided into up to five aliquots, which allows the investigator sufficient material for controls and for investigation of specific protein:chromatin interactions.
We have utilized this technique to begin to document protein:chromatin interactions during the specification of tissue-specific gene expression programs. The heterogeneity of cell types in an embryo necessarily restricts the application of this technique because the result is the detection of protein:chromatin interactions without distinguishing whether the interactions occur in all, a subset of, or a single cell type(s). However, examination of tissue-specific genes during or following the onset of tissue-specific gene expression is feasible for two reasons. First, immunoprecipitation of tissue specific factors necessarily isolates chromatin from the cell type where the factor is expressed. Second, immunoprecipitation of coactivators and histones containing post-translational modifications that are associated with gene activation should only be found at genes and gene regulatory sequences in the cell type where the gene is being or has been activated. The technique should be applicable to the study of most tissue-specific gene activation events.
In the example described below, we utilized E8.5 and E9.5 mouse embryos to examine factor binding at a skeletal muscle specific gene promoter. Somites, which are the precursor tissues from which the skeletal muscles of the trunk and limbs will form, are present at E8.5-9.54,5. Myogenin is a regulatory factor required for skeletal muscle differentiation 6-9. The data demonstrate that myogenin is associated with its own promoter in E8.5 and E9.5 embryos. Because myogenin is only expressed in somites at this stage of development 6,10, the data indicate that myogenin interactions with its own promoter have already occurred in skeletal muscle precursor cells in E8.5 embryos.

We demonstrate a chromatin immunoprecipitation (ChIP) method to identify factor interactions at tissue-specific genes during or after the onset of tissue-specific gene expression in mouse embryonic tissue. This protocol should be widely applicable for the study of tissue-specific gene activation as it occurs during normal embryonic development.

Ensaio para imunoprecipitação da cromatina Genes Tissue-específicos usando embriões em início de carreira do rato

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This ...

Efficient Chromatin Immunoprecipitation using Limiting Amounts of Biomass

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used method for determining the interactions of different proteins with DNA in chromatin of living cells. Examples include sequence-specific DNA binding transcription factors, histones and their different modification states, enzymes such as RNA polymerases and ancillary factors, and DNA repair components. Despite its ubiquity, there is a lack of up-to-date, detailed methodologies for both bench preparation of material and for accurate analysis allowing quantitative metrics of interaction. Due to this lack of information, and also because, like any immunoprecipitation, conditions must be re-optimized for new sets of experimental conditions, the ChIP assay is susceptible to inaccurate or poorly quantitative results.
Our protocol is ultimately derived from seminal work on transcription factor:DNA interactions1,2 , but incorporates a number of improvements to sensitivity and reproducibility for difficult-to-obtain cell types. The protocol has been used successfully3,4 , both using qPCR to quantify DNA enrichment, or using a semi-quantitative variant of the below protocol.
This quantitative analysis of PCR-amplified material is performed computationally, and represents a limiting factor in the assay. Important controls and other considerations include the use of an isotype-matched antibody, as well as evaluation of a control region of genomic DNA, such as an intergenic region predicted not to be bound by the protein under study (or anticipated not to show changes under the experimental conditions). In addition, a standard curve of input material for every ChIP sample is used to derive absolute levels of enrichment in the experimental material. Use of standard curves helps to take into account differences between primer sets, regardless of how carefully they are designed, and also efficiency differences throughout the range of template concentrations for a single primer set. Our protocol is different from others that are available5-8 in that we extensively cover the later, analysis phase.

We describe a robust method for chromatin immunoprecipitation using primary T cells. The method is founded on standard approaches, but uses a specific set of conditions and reagents that improve efficiency for limited a quantities of cells. Importantly, a detailed description of the data analysis phase is presented.

Imunoprecipitação da Cromatina eficiente usando Limitando quantidades de biomassa

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a  widely-used method for determining the interactions of different proteins with  DNA in chromatin of living ...

TChIP-Seq: Cell-Type-Specific Epigenome Profiling

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological functions have been extensively studied. Indeed, the advent of next-generation deep sequencing and chromatin immunoprecipitation (ChIP) via specific histone modification antibodies has revolutionized our view of epigenetic regulation across the genome. Conversely, tissues typically consist of diverse cell types, and their complex mixture poses analytic challenges to investigating the epigenome in a particular cell type. To address the cell type-specific chromatin state in a genome-wide manner, we recently developed tandem chromatin immunoprecipitation sequencing (tChIP-Seq), which is based on the selective purification of chromatin by tagged core histone proteins from cell types of interest, followed by ChIP-Seq. The goal of this protocol is the introduction of best practices of tChIP-Seq. This technique provides a versatile tool for tissue-specific epigenome investigation in diverse histone modifications and model organisms.

We describe a step-by-step protocol for tandem chromatin immunoprecipitation sequencing (tChIP-Seq) that enables the analysis of cell-type-specific genome-wide histone modification.

TChIP-Seq: Epigenoma célula tipo-específicas de criação de perfil

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological ...

Chromatin Extraction from Frozen Chimeric Liver Tissue for Chromatin Immunoprecipitation Analysis

Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation (X-ChIP) is a widely used technique to assess levels of histone marks and occupancy of transcription factors on host and/or pathogen chromatin. Chromatin preparation from tissues creates additional challenges that need to be overcome to obtain reproducible and reliable protocols comparable to those used for cell culture. Tissue disruption and fixation are critical steps to achieve efficient shearing of chromatin. Coexistence of different cell types and clusters may also require different shearing times to reach optimal fragment size and hinders shearing reproducibility. The purpose of this method is to achieve reliable and reproducible host chromatin preparations from frozen tissue (liver) suitable for both ChIP-qPCR and next generation sequencing (NGS) applications. We observed that the combination of liquid nitrogen tissue pulverization followed by homogenization leads to increased reproducibility compared to homogenization only, since it provides a suspension consisting mostly of dissociated single cells that can be efficiently sheared. Moreover, the fixation step should be performed under mild rotation to provide homogeneous crosslinking. The fixed material is then suitable for buffer-based nuclei isolation, to reduce contamination of cytoplasmic protein and pathogen DNAs and RNAs (when applicable), avoiding time-consuming centrifugation gradients. Subsequent sonication will complete nuclear lysis and shear the chromatin, producing a specific size range according to the chosen shearing conditions. The size range should fall between 100 and 300 nt for NGS applications, while it could be higher (300-700 nt) for ChIP-qPCR analysis. Such protocol adaptations can greatly improve chromatin analyses from frozen tissue specimens.

This protocol focuses on chromatin preparation from snap frozen tissues and it is suitable for Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation (X-ChIP) followed by either quantitative PCR analysis (X-ChIP-qPCR) or next generation sequencing approaches (X-ChIP-seq).

Extração de cromatina de tecido hepático quimérico congelado para análise de imunoprecipitação de cromatina

Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation (X-ChIP) is a widely used technique to assess levels of histone marks and occupancy of transcription factors on ...

Chromatin Immunoprecipitation

Histones are proteins that help organize DNA in eukaryotic nuclei by serving as &#8220;scaffolds&#8221; around which DNA can be wrapped, forming a complex called &#8220;chromatin&#8221;. These proteins can be modified through the addition of chemical groups, and these changes affect gene expression. Researchers use a technique called chromatin immunoprecipitation (ChIP) to better understand which DNA regions associate with specific histone modifications or other gene regulatory proteins. Antibodies are used to isolate the protein of interest, and the bound DNA is extracted for analysis. Here, JoVE presents the principles behind ChIP, discussing specific histone modifications and their relationship to gene expression and DNA organization. We then review how to perform a ChIP protocol, and explore the ways scientists are currently using this technique.

Imunoprecipitação de Cromatina

Histones are proteins that help organize DNA in eukaryotic nuclei by serving as &#8220;scaffolds&#8221; around which DNA can be wrapped, forming a complex ...