Wir danken P. Käse und T. Schmidt-Wöll für hervorragende technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde durch die Kooperationsforschung TRR81 und das Heisenberg-Programm (BO 1639 / 5-1) der DFG, der Max-Planck-Gesellschaft und der EXC 294 in Freiburg sowie des Exzellenzclusters für Cardio-Pulmonalsystem unterstützt (ECCPS) in Gießen nach TB

HINWEIS: Alle Puffer und das in diesem Protokoll verwendete Medium sind in Tabelle 1 aufgelistet . Tage 1 und 2 1. Vernetzung der Zellen <ol><li> Übertragen Sie die Maus-T-Zellen aus einer 6-Well-Platte in ein 50 ml-Röhrchen und zentrifugieren Sie für 5 min bei 4 ° C und ~ 271 x g. Das Zellpellet wird in 30 ml IMDM-Zellkulturmedium resuspendiert und die Zellen mit einer Neubauer-Kammer gezählt. </li><li> Sammle Aliquots von 20 x 10 6 Zellen in neue 50 ml Röhrchen. </li><li> Füge Formaldehyd (FMA) zu einer 1% Endkonzentration direkt zum Zellkulturmedium hinzu und inkubiere bei Raumtemperatur für 10 min. Achtung: FMA ist giftig, wenn eingeatmet, so unter einer Dunstabzugshaube arbeiten und geeignete Schutzausrüstung tragen. Auch bitte behandeln FMA Abfälle nach den Regeln der Gasthochschule. </li><li> Füge 1/8-Volumen 1 M Glycin, pH 7,0 hinzu und inkubiere bei Raumtemperatur für 5 min. </li><li> Pellet die Zellen durch Zentrifugation für 5Min bei 4 ° C und ~ 271 xg und waschen mit 10 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). </li><li> Das Zellpellet mit 1 ml PBS waschen und auf 1,5 ml Röhrchen überführen. </li></ol> 2. Zell-Lyse und Chromatin-Scherung <ol><li> Das Zellpellet wird in 1 ml SDS-Lysepuffer resuspendiert und 10 min auf Eis inkubiert. </li><li> Übertragen Sie jede Probe auf ein Ultraschallrohr und führen Sie die Scherung mit einem fokussierten Ultraschallgerät gemäß den in Tabelle 2 angegebenen Einstellungen durch . </li><li> Nach dem Scheren die Proben auf 1,5 ml Röhrchen übergeben und 10 min bei 4 ° C und ~ 18.000 x g zentrifugieren. </li><li> Übertragen Sie den Überstand auf neue Röhren. </li><li> Sammeln Sie 50 μl, um die Scherwirkung nach Schritt 3 zu bestimmen und das gescherte Lysat in flüssigem Stickstoff einzufrieren. Das Lysat in Einwegaliquots bei -80 ° C aufbewahren. </li></ol> 3. Bestimmung der Scherwirkung <ol><li> Füge 50 μl Elutionspuffer zu den 50 &amp; #181, L von jedem geschorenen Lysat und inkubieren bei 65 ° C über Nacht, mit Schütteln. </li><li> 100 μl TE-Puffer und 4 μl 10 mg / mL RNase A (0,2 μg / μL Endkonzentration) zugeben. Mischen und inkubieren für 2 h bei 37 ° C, unter Schütteln. </li><li> 2 μl 20 mg / ml Proteinase K (0,2 μg / μL Endkonzentration) zu jeder Probe geben und 2 h bei 55 ° C unter Schütteln inkubieren. </li><li> Übertragen Sie jede Probe auf ein Gel-Rohr, das für die Bildung von Phenol / Chloroform / Isoamylalkohol geeignet ist; Handhaben nach den Anweisungen des Herstellers. </li><li> 200 μl Phenol / Chloroform / Isoamylalkohol (25: 24: 1) zugeben und die Röhrchen schütteln. 5 min bei 24 ° C und ~ 16.000 xg zentrifugieren und die obere Phase in neue Röhrchen überführen. Achtung: Phenol, Chloroform und Isoamylalkohol sind bei Einatmen giftig und korrosiv; Arbeit unter einer Dunstabzugshaube und trage eine persönliche Schutzausrüstung. Auch behandeln Phenol, Chloroform und Isoamylalkohol Abfälle acNach den Regeln der gastgebenden Einrichtung. <ol><li> Wiederhole einmal. </li></ol></li><li> Reinigen Sie die DNA unter Verwendung von Reinigungsspalten gemäß der Anweisungen des Herstellers mit den folgenden Modifikationen: <ol><li> Die Membran zweimal waschen. Nach dem letzten Waschen lassen Sie das Röhrchen für 2 min bei Raumtemperatur stehen, um das restliche Ethanol zu verdampfen. </li><li> Für die Elution werden 50 &amp; mgr; l H 2 O zugegeben, bei Raumtemperatur für 1 min inkubiert, das Röhrchen für 1 s gedünstet, um die Membran richtig zu benetzen und bei Raumtemperatur für 1 min vor der Eluierung der DNA durch Zentrifugation für 1 min bei inkubieren 24 ° C und ~ 17.900 x g. </li></ol></li><li> Quantifizieren Sie die gereinigte DNA auf einem Fluorometer mit einem hochempfindlichen Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Analysieren Sie etwa 500 ng der gereinigten DNA auf einem 1,8% Agarosegel und etwa 1 ng auf einem Elektrophoresesystem unter Verwendung eines hochempfindlichen Kits. HINWEIS: Das erwartete SizE der DNA-Fragmente zwischen 200 und 500 bp liegt. </li></ol> Tage 3 und 4 4. Immunpräzipitation <ol><li> 1 Volumen geschliffenes Lysat mit 5 Volumina Verdünnungspuffer verdünnen </li><li> Mit 30 &amp; mgr; l / ml Protein A-Agarose-Kügelchen (hergestellt gemäß Anhang A ) für 30 min unter Rotation im kalten Raum vorschneiden. </li><li> Bei 4 ° C für 5 min bei 750 x g zentrifugieren </li><li> Sammle 10% des Eingangs und stelle sie bei 4 ° C auf. </li><li> Aliquot die gewünschte Menge an Lysat in neue Röhrchen (siehe Tabelle 3 für Details). Fügen Sie die gewünschten Antikörper zu jeder Röhre hinzu (siehe Tabelle 3 für Details) und drehen Sie sich über Nacht bei 4 ° C. </li><li> 40 &amp; mgr; l Protein A-Kügelchen zugeben und 1 h bei 4 ° C während des Rotierens inkubieren. </li><li> Waschen Sie die Perlen mit 1 ml salzarmer Puffer, hochsalzigem Puffer, LiCl-Puffer und TE-Puffer (für jede Wäsche, inkubieren für 5 min bei 4 ° C während Rotieren und ZentrifugierenFür 3 min bei 4 ° C und ~ 950 xg). Siehe Tabelle 3 für Details. </li><li> Füge 110 μl Elutionspuffer hinzu und inkubiere für 15 min bei Raumtemperatur, Vortexen alle 2 min. </li><li> 3 min bei 4 ° C und ~ 950 xg zentrifugieren und 100 μl Überstand in ein neues 1,5-ml-Röhrchen überführen. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 4.7-4.8 mit 100 μl Elutionspuffer und kombinieren Sie die Eluate. Füge den Elutionspuffer bis zu 200 μl hinzu, um die Proben zu geben. </li><li> Inkubieren Sie alle Proben über Nacht bei 65 ° C unter Schütteln. </li></ol> Tag 5 5. DNA-Reinigung <ol><li> Zugabe von 200 μl TE-Puffer zu jedem Eluat und 8 μl 10 mg / ml RNase A (0,2 μg / μL Endkonzentration). Mischen und inkubieren für 2 h bei 37 ° C, unter Schütteln. </li><li> 4 μl 20 mg / ml Proteinase K (0,2 μg / μL Endkonzentration) zu jedem Eluat geben und 2 h bei 55 ° C unter Schütteln inkubieren. </li><li> Übertragen Sie jede Probe in ein GelRohr geeignet für Phenol / Chloroform / Isoamylalkohol Extraktion; Handhaben nach den Anweisungen des Herstellers. </li><li> 400 μl Phenol / Chloroform / Isoamylalkohol (25: 24: 1) zugeben und die Röhrchen schütteln. 5 min bei 24 ° C und ~ 16.000 x g zentrifugieren Übertragen Sie die obere Phase auf neue Röhren. Achtung: Phenol, Chloroform und Isoamylalkohol sind bei Einatmen giftig und korrosiv; Arbeit unter einer Dunstabzugshaube und trage eine persönliche Schutzausrüstung. Auch Phenol-, Chloroform- und Isoamylalkoholabfälle nach den Regeln der gastgebenden Einrichtung behandeln. <ol><li> Wiederhole einmal. </li></ol></li><li> Reinigen Sie die DNA mit Reinigungsspalten gemäß den Anweisungen des Herstellers mit den folgenden Modifikationen: </li><li> Die Membran zweimal waschen. Nach dem letzten Waschvorgang die Röhrchen für 2 min bei Raumtemperatur öffnen, um das restliche Ethanol zu verdampfen. </li><li> Für die Elution 50 μl H 2 O zugeben, bei Raumtemperatur inkubierenRe für 1 min, drehen die Röhrchen für 1 s, um die Membran richtig zu benetzen und bei Raumtemperatur für 1 min vor dem Eluieren der DNA durch Zentrifugation für 1 min bei 24 ° C und ~ 17.900 x g zu inkubieren. </li></ol>

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	<li>Rothenberg, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chromatin+landscape+and+transcription+factors+in+T+cell+programming.">The chromatin landscape and transcription factors in T cell programming.</a> Trends Immunol. 35 (5), 195-204 (2014).</li><li>Zhang, J. A., Mortazavi, A., Williams, B. A., Wold, B. J., Rothenberg, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+transformations+of+genome-wide+epigenetic+marking+and+transcriptional+control+establish+T+cell+identity.">Dynamic transformations of genome-wide epigenetic marking and transcriptional control establish T cell identity.</a> Cell. 149 (2), 467-482 (2012).</li><li>Cauchy, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+recruitment+of+Ets1+to+both+nucleosome-occupied+and+-depleted+enhancer+regions+mediates+a+transcriptional+program+switch+during+early+T-cell+differentiation.">Dynamic recruitment of Ets1 to both nucleosome-occupied and -depleted enhancer regions mediates a transcriptional program switch during early T-cell differentiation.</a> Nucl Acids Res. 44 (8), 3567-3585 (2016).</li><li>Koch, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+initiation+platforms+and+GTF+recruitment+at+tissue-specific+enhancers+and+promoters.">Transcription initiation platforms and GTF recruitment at tissue-specific enhancers and promoters.</a> Nat Struct Mol Biol. 18 (8), 956-963 (2011).</li><li>Pekowska, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H3K4+tri-methylation+provides+an+epigenetic+signature+of+active+enhancers.">H3K4 tri-methylation provides an epigenetic signature of active enhancers.</a> EMBO J. 30 (20), 4198-4210 (2011).</li><li>Vanhille, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+and+quantitative+assessment+of+enhancer+activity+in+mammals+by+CapStarr-seq.">High-throughput and quantitative assessment of enhancer activity in mammals by CapStarr-seq.</a> Nat Commun. 6, 6905 (2015).</li><li>Barski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+profiling+of+histone+methylations+in+the+human+genome.">High-resolution profiling of histone methylations in the human genome.</a> Cell. 129 (4), 823-837 (2007).</li><li>Heintzman, N. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+assessment+of+histone-modification+antibody+quality.">An assessment of histone-modification antibody quality.</a> Nat Struct Mol Biol. 18 (1), 91-93 (2011).</li><li>Rothbart, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Interactive+Database+for+the+Assessment+of+Histone+Antibody+Specificity.">An Interactive Database for the Assessment of Histone Antibody Specificity.</a> Mol Cell. 59 (3), 502-511 (2015).</li><li>Fenouil, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CpG+islands+and+GC+content+dictate+nucleosome+depletion+in+a+transcription-independent+manner+at+mammalian+promoters.">CpG islands and GC content dictate nucleosome depletion in a transcription-independent manner at mammalian promoters.</a> Genome Res. 22 (12), 2399-2408 (2012).</li><li>Hein, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+methylation+of+Notch1+controls+the+amplitude+and+duration+of+the+Notch1+response.">Site-specific methylation of Notch1 controls the amplitude and duration of the Notch1 response.</a> Sci Signal. 8 (369), ra30 (2015).</li></ol>

Die Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

ChIP ist eine gültige Technik, um zu untersuchen, ob Proteine ​​oder ihre PTMs an bestimmten genomischen Regionen angereichert sind. ChIP-Assay-Ergebnisse sind oft schwierig, aus biologischen oder technischen Gründen zu interpretieren. Die biologischen Gründe sind vielfach und beinhalten eine schwache oder indirekte Bindung von Proteinen an DNA. Es gibt auch technische Einschränkungen, wie z. B. begrenzte Antikörperspezifität und ineffiziente Zelllyse oder Chromatinscherung. Ein Handbuch zur Fehlerbehebung ( Tabelle 5 ) kann dem Leser helfen, die Probleme zu lösen, die bei ChIP-Assays auftreten können. Dieses Protokoll, das eine kühlende fokussierte Ultraschallvorrichtung verwendet, ermöglicht es, das Chromatin einer reifen Maus-T-Zelllinie effizient zu scheren. Der wichtigste kritische Schritt des Protokolls wird durch die Scherung des Chromatins dargestellt, die immer für jeden Zelltyp optimiert werden muss. Es wird empfohlen, die Anzahl der Zellen und die Anzahl der Beschallungszyklen zu variieren. Außerdem ist sie das<html> Wird durch die Anwesenheit von SDS-Präzipitaten in den Proben, die sich bei der Lyse der Zellen auf Eis mit SDS-Lysepuffer bilden können, negativ beeinflusst. In diesem Fall ist es am besten, die Probe nach der Lyse bei Raumtemperatur für einige Minuten zu inkubieren, um das Vorhandensein von SDS-Präzipitaten zu reduzieren. Es wird empfohlen, das Protokoll zu optimieren, um gescherte Fragmente zwischen 200 und 500 bp zu erhalten und immer die Scherqualität der Proben zu bewerten, bevor sie mit der Immunpräzipitation fortfahren. Zusätzlich müssen die Fixierungszeit, die Menge an Antikörper und / oder Zellen und die Waschbedingungen für jeden Antikörper optimiert werden. Ein weiterer kritischer Schritt bei der erfolgreichen ChIP-Prozedur ist die Wahl des Antikörpers, da Antikörper mit niedriger Spezifität die Effizienz der Immunpräzipitation deutlich reduzieren. Bisher hat ein einheitliches Qualitätsprüfverfahren die Bewertung der Spezifität mehrerer auf dem Markt verfügbarer Antikörper ermöglicht<html> Ss = &quot;xref&quot;&gt; 19 Die Screening-Pipeline basierte auf Dot-Blot, Western Blot und ChIP und lieferte eine Liste von hochwertigen Reagenzien, die für ChIP 19 geeignet sind. In jüngerer Zeit wurde die Spezifität von mehreren handelsüblichen Antikörpern mit hochdichten Histonpeptid-Mikroarray-Plattformen ausgewertet, was die Einrichtung einer Datenbank über die Antikörperspezifität 20 ermöglicht. Der Leser kann dieses nützliche Werkzeug verwenden, um die spezifischsten Antikörper zu identifizieren, die für ChIP-Experimente verwendet werden können. Dieses Protokoll wurde nicht auf primäre T-Zellen getestet und in diesem Fall sollte sich der Leser auf andere veröffentlichte Protokolle beziehen, die ChIP auf den primären T-Zellen 3 , 4 , 21 erfolgreich durchführen. Bemerkenswert ist, dass dieses Protokoll erfolgreich verwendet wurde, um ChIP auf einer Maus-Progenitor-T-Zelllinie sowie auf einer Maus-Endothelzelllinie durchzuführen. Ove_content &quot;&gt; 5 x 10 6 Zellen sollten für jede Immunpräzipitation für die Analyse von Histonmarken verwendet werden. Da dieses Protokoll auch bei einigen Optimierungen geeignet ist, ChIP auf TFs oder Cofaktoren durchzuführen, ist es am besten, die Anzahl der Zellen zu erhöhen Die für die Immunpräzipitation in diesen Fällen verwendet werden. Um die erforderliche Anzahl von Zellen für jedes Experiment zu erreichen, können mehr Aliquots von geschertem Lysat zusammengemischt werden, bevor das Chromatin in dem Verdünnungspuffer verdünnt wird. Dieses Protokoll könnte auch modifiziert werden, um ChIP auf endogenen Proteinen durchzuführen, die nicht direkt an die DNA binden. In diesem Fall kann eine Vorfixierung mit Protein-Protein-Vernetzern ( z. B. Dimethyladipimidat, DMA) erforderlich sein (siehe Anhang B für weitere Informationen). Die erfolgreiche Leistung von ChIP auf Kofaktoren wurde zuvor durch Überexpression von Proteinen, die mit einem Biotin-Tag fusioniert wurden, durchgeführt. In diesem Fall wurde das Protein mit Streptavidin-Konjuga gereinigtMagnetische Perlen und eine Vorfixierung mit DMA wurde durchgeführt 22 .

Entwicklung, Differenzierung und Homöostase hängen von spezifischen Genexpressionsprogrammen ab, die durch Signalisierungsereignisse bestimmt werden, die die Chromatinstruktur modulieren und somit bestimmen, ob ein spezifisches Gen zell- und zeitabhängig aktiviert oder unterdrückt wird. Während der T-Zell-Entwicklung müssen spezifische Genexpressionsprogramme etabliert werden, um die Reifung von T-Zell-Vorläufern vom doppelnegativen (DN) zum ein-positiven (SP) -Zustand zu bestimmen, indem sie mehrere Zwischenstufen 1 durchlaufen. Wie das Genexpressionsprogramm während der T-Zell-Entwicklung dynamisch reguliert wird, wurde in den vergangenen Jahren von mehreren Laboratorien 2 , 3 , 4 , 5 , 6 weitgehend untersucht. Durch posttranslationale Modifikationen (PTMs) von Histonen, der Austausch vonKanonische Histone mit Histonvarianten, Nukleosomen-Räumung und DNA-Methylierung regulieren den ON / OFF-Schalter von Genen. Mehrere Gruppen haben die genomweite Verteilung von PTMs und Histonvarianten untersucht, um Markierungen zu bestimmen, die mit verschiedenen Chromatinzuständen an den proximalen und distalen regulatorischen Regionen 7 , 8 , 9 , 10 assoziiert sind. Signalisierungskaskaden orchestrieren die dynamische Chromatinregelung über den Austausch von positiven und negativen chromatinmodifizierenden Enzymen (auch als Chromatinmodifikatoren bekannt) an spezifischen Enhancer-Elementen. Diese Chromatin-Modifizierungsmittel regulieren die Chromatinstruktur und damit die Transkriptionsausgabe beispielsweise durch dynamische Histon-Methylierung und Acetylierung. Dies ist der Fall in dem Notch-Signalweg 11 , 12 , 13 ,14 Dynamische Histon-PTMs; Austausch mit Histonvarianten; Und die dynamische Belegung von Histonen, Transkriptionsfaktoren und Cofaktoren können durch Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP) -Assays untersucht werden. Hochspezifische Antikörper werden verwendet, um spezifische DNA-Protein-Komplexe zu reinigen, und die gereinigte DNA wird durch quantitative PCR (qPCR) analysiert; Tiefsequenzierung (ChIP-Seq); Oder, seltener heutzutage, Hybridisierung mit Mikroarray (ChIP-ChIP). ChIP-Assays sind manchmal anspruchsvoll aufgrund von Komplikationen mit der Lyse der Zellen, Scherung des Chromatins und / oder geringer Spezifität der Antikörper. Es wurden mehrere Strategien zur Verbesserung des Protokolls verabschiedet, wie es bei NEXSON 15 der Fall ist. Die Verwendung von Kühlwasser-Bad-Sonicatoren vermeidet Probenerwärmung, die die auf dem zu untersuchenden Protein vorhandenen Epitope beschädigen könnte, aber die Energie, die für das Scheren der Proben erforderlich ist, wird in das Wasser dispergiert.Eine weitere Verbesserung wurde mit der Entwicklung von fokussierten Ultraschallgeräten gemacht, die die Verteilung der Energie verhindern. Daher ermöglichen fokussierte Ultraschallgeräte Verbesserungen bei der Zelllyse und Chromatinscherung, eliminieren durch Operator-induzierte Variationen und erhöhen die Reproduzierbarkeit erheblich. Diese Arbeit beschreibt ein Protokoll (schematische Übersicht in Abbildung 1 ), um das ChIP von Histonproteinen in einer reifen Maus-T-Zelllinie mit der Bezeichnung E2-10HA 16 , 17 effizient durchzuführen. T-Zellen sind in der Regel schwer zu lysieren, und die Scherung ihrer Chromatin wurde offenbart, um ineffizient zu sein. In diesem Protokoll, das einen kühlenfokussierten Ultraschallgerät nutzt, wurden die Anzahl der Zellen, der Lysepuffer und die Schereinstellung für die E2-10HA-Maus-T-Zelllinie optimiert. Dieses Protokoll erlaubt es, ChIP mit hoher Reproduzierbarkeit und in einer angemessenen Zeit durchzuführen. In der Tat, es requirEs etwa zwei Tage, um das Chromatin zu scheren und die Qualität der Scherung zu bewerten, und drei Tage, um die Immunpräzipitation durchzuführen, die Vernetzung umzukehren und die DNA zu reinigen.

<table><tbody><tr><td>Agilent High Sensitivity D5000 Reagents</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5593</td><td></td></tr><tr><td>Agilent High Sensitivity D5000 ScreenTape</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5592</td><td></td></tr><tr><td>Agilent Tapestation 4200</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2991AA</td><td></td></tr><tr><td>Covaris S220 AFA System</td><td>Covaris</td><td>500217</td><td></td></tr><tr><td>dimethyl adipimidate (DMA)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>20660</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>Pan-Biotech</td><td>1502-P121301</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde (FMA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>Insulin solution human&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9278-5ML</td><td></td></tr><tr><td>Iscove&#039;s modified Dulbecco&#039;s medium (IMDM)</td><td>Gibco</td><td>21980-032</td><td></td></tr><tr><td>Minimum essential medium non-essential amino acids (MEM NEAA)</td><td>Gibco</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>nProtein A Sepharose 4 Fast Flow</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5280-02</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin&lt;br /&gt;(10,000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Peptone primatone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4963-100G</td><td></td></tr><tr><td>Phase Lock Gel Heavy 2&amp;nbsp;mL</td><td>5 Prime</td><td>2302830</td><td></td></tr><tr><td>Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1)</td><td>Roth</td><td>A156.2</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td><td>GIBCO</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K Solution (20 mg/mL), RNA grade</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25530049</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR Purification Kit (250)</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 3.0 Fluorometer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>Qubit assay tubes</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32854</td><td></td></tr><tr><td>RNase A, DNase and protease-free (10&amp;nbsp;mg/mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>Tube AFA Fiber &amp;amp; Cap</td><td>Covaris</td><td>520081</td><td></td></tr></tbody></table>

chromatin immunoprecipitation (chip) in mouse t-cell lines

Signalisierungswege regulieren Genexpressionsprogramme über die Modulation der Chromatinstruktur auf verschiedenen Ebenen, wie durch posttranslationale Modifikationen (PTMs) von Histonschwänzen, den Austausch von kanonischen Histonen mit Histonvarianten und Nukleosomenvorsätze. Eine solche Regulation erfordert die Bindung von signalempfindlichen Transkriptionsfaktoren (TFs), die chromatinmodifizierende Enzyme an regulatorischen Elementen, die als Enhancer definiert sind, rekrutieren. Das Verständnis, wie Signalkaskaden die Enhancer-Aktivität regulieren, erfordert eine umfassende Analyse der Bindung von TFs, chromatinmodifizierenden Enzymen und der Belegung von spezifischen Histonmarken und Histonvarianten. Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP) -Assays verwenden hochspezifische Antikörper gegen Immunpräzipitation spezifischer Protein / DNA-Komplexe. Die anschließende Analyse der gereinigten DNA ermöglicht die Identifizierung der Region, die von dem vom Antikörper erkannten Protein besetzt ist. Diese Arbeit beschreibt ein Protokoll für effizientes peRip ChIP von Histonproteinen in einer reifen Maus-T-Zelllinie. Das dargestellte Protokoll erlaubt die Durchführung von ChIP-Assays in einem angemessenen Zeitrahmen und mit hoher Reproduzierbarkeit.

Reife murine T-Zellen wurden einer ChIP-Analyse unterzogen, um die Anreicherung der Histonmark-Monomethylierung von Lysin 4 auf Histon 3 (H3K4me1), Tri-Methylierung von Lysin 4 auf Histon 3 (H3K4me3) und Acetylierung von Lysin 27 zu untersuchen Histon 3 (H3K27ac), sowie die Nukleosomenbelegung, wie aus panH3 ChIP hervorgeht. Die Scherqualität wurde durch Analyse auf einem 1,8% Agarosegel ( Fig. 2A ) und auf einem Elektrophorese-System ( Fig. 2B ) bewertet. H3K4me1 und H3K4me3 werden im Allgemeinen verwendet, um Enhancer-Stellen und Promotoren zu identifizieren (Abbildung 3A ). Tatsächlich ist H3K4me3 prominent, aber nicht ausschließlich an den Promotoren 5 , 8 , 14 angereichert. Eine Eigenschaft von aktiven Enhancern ist für H3K4me1 und H3K27ac hoch angereichert und für H3K4me3 (&lt;Starke Klasse = &quot;xfig&quot;&gt; Abbildung 3A, oberes Panel), während inaktive Enhancer niedrige Niveaus von H3K4me3 und H3K27ac aber hohen Niveaus von H3K4me1 (Abbildung 3A , unteres Panel) darstellen. Wie in Fig. 3B gezeigt , ist das Glyceraldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase ( Gapdh ) -Gen repräsentativ für die Analyse von aktiven Gen-Promotoren ( Gapdh-Promotor ). In der Tat zeigt es hohe Niveaus von H3K4me3 und H3K27ac und niedrigem Niveau von H3K4me1. In Abbildung 3B ist Deltex1 ( Dtx1 ) repräsentativ für inaktive Enhancer ( Dtx1 Enhancer ), da es für H3K4me1 hoch angereichert und für H3K4me3 und H3K27ac schlecht angereichert ist. Die Gen-Wüste ist repräsentativ für eine Region, die keine kodierenden Gene enthält und wird gewöhnlich als Negativkontrolle für aktive Chromatin-Markierungen verklagt. Die Beobachtung, dass H3K4me1, eine gut akzeptierte Enhancer Mark 4 , 5 , </sup&gt; 7 , 14 , 18 , ist nicht bereichert an Gene Wüste deutet darauf hin, dass diese Region fehlt Enhancer. <img alt="Abbildung 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55907/55907fig1.jpg" /> Abbildung 1: Schematische Übersicht über das vorgestellte ChIP-Protokoll. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55907/55907fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55907/55907fig2.jpg" /> Abbildung 2: Scherqualitätskontrolle der reifen Maus-T-Zelllinie. ( A ) Zwei verschiedene Aliquots der reifen Maus-T-Zelllinie E2-10HA wurden geschert und etwa 500 ng gereinigte DNA wurden auf einem 1,8% Agarosegel analysiert, um ihre Scherung zu bewertenQualität. ( B ) 1 ng gereinigter DNA aus Probe 2 wurde durch Elektrophorese analysiert, um ihre Scherqualität zu bewerten. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55907/55907fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55907/55907fig3.jpg" /> Abbildung 3: Chromatin-Marken, die Enhancer und Promotoren charakterisieren. ( A ) Aktive Verstärker (obere Tafel) zeichnen sich durch hohe H3K4me1, niedrige H3K4me3 und hohe H3K27ac aus, während inaktive Enhancer (untere Tafel) hohe H3K4me1, niedrige H3K4me3 und niedrige H3K27ac vorhanden sind. ( B ) Die in Fig. 2A dargestellten Proben wurden zusammengefaßt und für die ChIP-Analyse gegenüber den Histonmarken H3K4me1, H3K4me3 und H3K27ac und Histonbelegung verwendet, wie durch panH3-ChIP aufgedeckt wurde. Diese Analyse zeigt, dass thE-Promotor des Haushaltgens Glyceraldehyd 3-Phosphat-Dehydrogenase ( Gapdh-Promotor ) ist für H3K4me3 und H3K27ac hoch angereichert und für H3K4me1 niedrig angereichert. Auf der anderen Seite ist der Enhancer des inaktiven Gens Deltex1 ( Dtx1 Enhancer ) für H3K4me1 hoch angereichert, aber schlecht angereichert für H3K4me3 und H3K27ac. ChIP unter Verwendung eines panH3-Antikörpers wurde verwendet, um die Nukleosomenbelegung zu untersuchen. Gene Wüste wurde als Negativkontrolle verwendet. Ein repräsentatives Experiment wird gezeigt. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55907/55907fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Name des Puffers </td><td> Reagens </td><td> Endkonzentration </td></tr><tr><td rowspan="5"> Verdünnungspuffer </td><td> NatriumdodecYl-sulfat (SDS) </td><td> 0,01% (w / v) </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> 1,1% (v / v) </td></tr><tr><td> Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) pH 8,0 </td><td> 1,2 mM </td></tr><tr><td> Tris-HCl pH 8.1 </td><td> 16,7 mM </td></tr><tr><td> Natriumchlorid (NaCl) </td><td> 167 mM </td></tr><tr><td rowspan="2"> DMA-Lösung </td><td> Dimethyladipimidat (DMA) </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) </td><td> 1x </td></tr><tr><td rowspan="3"> Elutionspuffer </td><td> Natriumdodecylsulfat (SDS) </td><td> 1% (w / v) </td></tr><tr><td> Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) pH 8,0 </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> Tris-HCl pH 8,0 </td><td> 50 mM </td></tr><tr><td rowspan="5"> Hochsalzpuffer </td><td> Natriumdodecylsulfat (SDS) </td><td> 0,1% (w / v) </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> 1% (v / v) </td></tr><tr><td> EthylendiamiNetetraessigsäure (EDTA) pH 8,0 </td><td> 2 mM </td></tr><tr><td> Tris-HCl pH 8.1 </td><td> 20 mM </td></tr><tr><td> Natriumchlorid (NaCl) </td><td> 500 mM </td></tr><tr><td rowspan="6"> IMDM-Medium </td><td> Iscoves modifiziertes Dulbecco-Medium (IMDM) </td><td> 1x </td></tr><tr><td> Fetales Rinderserum (FBS) </td><td> 2% (v / v) </td></tr><tr><td> Penicillin / Streptomycin </td><td> 1x </td></tr><tr><td> Pepton-Primaton </td><td> 0,3 mg / ml </td></tr><tr><td> Insulinlösung Mensch </td><td> 4,8 mg / ml </td></tr><tr><td> Minimale essentielle wesentliche nicht-essentielle Aminosäuren (MEM NEAA) </td><td> 1x </td></tr><tr><td rowspan="4"> LiCl-Salzpuffer </td><td> Lithiumchlorid (LiCl) </td><td> 0,25 M </td></tr><tr><td> IGEPAL-CA630 </td><td> 1% (v / v) </td></tr><tr><td> Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) pH 8,0 </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> Tris-HCl pH 8.1 </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td rowspan="5"> Niedriger Salzpuffer </td><td> Natriumdodecylsulfat (SDS) </td><td> 0,1% (w / v) </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> 1% (v / v) </td></tr><tr><td> Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) pH 8,0 </td><td> 2 mM </td></tr><tr><td> Tris-HCl pH 8.1 </td><td> 20 mM </td></tr><tr><td> Natriumchlorid (NaCl) </td><td> 150 mM </td></tr><tr><td rowspan="5"> Protein A Sepharose Perlen Waschpuffer </td><td> Tris-HCl pH 8,0 </td><td> 20 mM </td></tr><tr><td> Natriumchlorid (NaCl) </td><td> 500 mM </td></tr><tr><td> Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) pH 8,0 </td><td> 2 mM </td></tr><tr><td> Natriumdodecylsulfat (SDS) </td><td> 0,1% (w / v) </td></tr><tr><td> IGEPAL-CA630 </td><td> 1% (v / v) </td></tr><tr><td rowspan="3"> SDS-Lyse-Puffer </td><td> Natriumdodecylsulfat (SDS) </td><td> 1% (w / v) </td></tr><tr><td> EthylendiAmintetraessigsäure (EDTA) pH 8,0 </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> Tris-HCl pH 8.1 </td><td> 50 mM </td></tr><tr><td rowspan="2"> TE-Puffer </td><td> Tris-HCl pH 8,0 </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) pH 8,0 </td><td> 1 mM </td></tr></tbody></table> Tabelle 1: Liste der Puffer und des in diesem Protokoll verwendeten Mediums. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td> AUF </td><td> AUS </td></tr><tr><td> Spitzenleistung </td><td> 150,0 </td><td> 2.5 </td></tr><tr><td> Duty Faktor </td><td> 15.0 </td><td> 15.0 </td></tr><tr><td> Zyklen / Burst </td><td> 500 </td><td> 500 </td></tr><tr><td> Anzahl der Zyklen </td><td colspan="2"> 28 </td></tr></tbody></table>Tabelle 2: Schereinstellungen, die in diesem Protokoll verwendet werden. Diese Bedingungen wurden für eine reife Maus-T-Zelllinie optimiert. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Antikörper </td><td> Lieferant </td><td> Menge an Antikörper / Immunpräzipitation </td><td> Menge der Zellen / Immunpräzipitation </td><td> Waschbedingungen </td></tr><tr><td> H3 </td><td> Abcam (ab1791) </td><td> 2,5 mg </td><td> 5 x 10 6 </td><td> Einmal in niedrigem Salzpuffer, zweimal in hohem Salzpuffer, zweimal in LiCl-Salzpuffer und dreimal in TE-Puffer </td></tr><tr><td> H3K4me1 </td><td> Abcam (ab8895) </td><td> 2,5 mg </td><td> 5 x 10 6 </td><td> Einmal in niedrigem Salzpuffer, zweimal in hohem Salzpuffer, zweimal in LiCl-Salzpuffer und dreimal in TE-Puffer </td></tr><tr><td> H3K4me3 </td><td> Diagenode (pAb-003-050) </td><td> 2,5 mg </td><td> 5 x 10 6 </td><td> Einmal in niedrigem Salzpuffer, zweimal in hohem Salzpuffer, zweimal in LiCl-Salzpuffer und dreimal in TE-Puffer </td></tr><tr><td> H3K27ac </td><td> Diagenode (pAb-174-050) </td><td> 2,5 mg </td><td> 5 x 10 6 </td><td> Oce in niedrigem Salzpuffer, zweimal in hohem Salzpuffer, zweimal in LiCl-Salzpuffer und dreimal in TE-Puffer </td></tr><tr><td> IgG </td><td> Diagenode (C15410206) </td><td> Variable* </td><td> Variable* </td><td> Variable* </td></tr><tr><td colspan="5"> * Im Fall der IgG-Kontrolle müssen die Menge an Antikörper und Zellen sowie die Waschschritte die Bedingungen der anderen Immunpräzipitationen spiegeln. </td></tr></tbody></table> Tabelle 3: In dieser Studie verwendete Antikörper und Waschbedingungen <table border="1" fo:keEp-together.within-page = &quot;1&quot; fo: keep-with-next.within-page = &quot;immer&quot;&gt; <tbody><tr><td> Gen </td><td> Vorwärtsprimer </td><td> Rückwärtsprimer </td><td> Sonde </td></tr><tr><td> Gapdh-Promoter (0 kb) </td><td> 5&#39;-GGG TTC CTA TAA ATA CGG ACT GC-3 &#39; </td><td> 5&#39;-CTG GCA CTG CAC AAG AAG A-3 &#39; </td><td> 68 </td></tr><tr><td> Dtx1 Enhancer (+26 kb) </td><td> 5&#39;-CTC TGG GTT GTA GGG GAC AG-3 &#39; </td><td> 5&#39;-GCA TGG GAA CTG TGT TAC AGA A-3 &#39; </td><td> 27 </td></tr><tr><td> Gene Wüste </td><td> 5&#39;-CAA TGC ATG GGT CCA GAT TT-3 &#39; </td><td> 5&#39;-ATT GGC ACG GAA GTA GTG CT-3 &#39; </td><td> 94 </td></tr></tbody></table> Tabelle 4: Primer und Sonden für qPCR in dieser Studie verwendet. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page = &quot;immer&quot;&gt; <tbody><tr><td> Problem </td><td> Ursachen </td><td> Lösung </td></tr><tr><td rowspan="3"> Chromatin ist unter Schere und Fragmente sind zu groß. </td><td> Zu viele Zellen wurden verwendet. </td><td> Reduzieren Sie die Anzahl der Zellen. </td></tr><tr><td rowspan="2"> Die Scherung ist zu niedrig. </td><td> Erhöhung der Anzahl der Scherzyklen. </td></tr><tr><td> Erhöhen Sie die Scherspitzenleistung, das Tastverhältnis und / oder die Zyklen / Burst. </td></tr><tr><td rowspan="3"> Chromatin ist über geschert und Fragmente sind zu klein. </td><td> Es wurden nur wenige Zellen verwendet. </td><td> Erhöhe die Anzahl der Zellen. </td></tr><tr><td rowspan="2"> Das Scheren ist zu hoch. </td><td> Reduzieren Sie die Anzahl der Scherzyklen. </td></tr><tr><td> Reduzieren Sie die Scherspitzenleistung, das Tastverhältnis und / oder die Zyklen / Burst. </td></tr><tr><td rowspan="11"> Zu wenig Erholung über IGG-Steuerung und / oder Negativkontrolle (hoher Hintergrund). </td><td> Nicht genug Chromatin für das Experiment verwendet. </td><td> Erhöhung der Chromatinmenge </td></tr><tr><td> Die Menge des Antikörpers ist zu niedrig. </td><td> Erhöhe die Menge an Antikörper. </td></tr><tr><td> Die Menge des Antikörpers ist zu hoch. </td><td> Reduzieren Sie die Menge an Antikörper. </td></tr><tr><td> Der Antikörper hat eine geringe Spezifität. </td><td> Ändern Sie den Antikörper. </td></tr><tr><td rowspan="2"> Waschbedingungen sind zu streng. </td><td> Reduzieren Sie die Anzahl der Wäsche. </td></tr><tr><td> Reduzieren Sie die Stringenz der Waschpuffer. </td></tr><tr><td rowspan="2"> Waschbedingungen sind nicht streng genug. </td><td> Erhöhen Sie die Anzahl der Wäsche. </td></tr><tr><td> Erhöhe die Stringenz der Waschpuffer. </td></tr><tr><td> Zu viel DNA wurde im qPCR pipettiert. </td><td> Reduzieren Sie die Menge an DNA, die im qPCR pipettiert wurde. </td></tr><tr><td rowspan="2"> QPCR-Bedingungen sind nicht optimal. </td><td> Optimiere die qPCR-Bedingungen. </td></tr><tr><td> Reduzieren Sie die Anzahl der Zyklen. </td></tr><tr><td rowspan="4"> Bei der qPCR-Reaktion der Eingangsmuster ist kein Produkt oder Produkt zu niedrig. </td><td> Nicht genügend DNA wurde im qPCR pipettiert. </td><td> Erhöhe die DNA-Menge, die im qPCR pipettiert wurde. </td></tr><tr><td rowspan="2"> QPCR-Bedingungen sind nicht optimal. </td><td> Optimiere die qPCR-Bedingungen. </td></tr><tr><td> Erhöhung der Anzahl der Zyklen. </td></tr><tr><td> Nicht genug Chromatin für das Experiment verwendet. </td><td> Erhöhung der Chromatinmenge </td></tr><tr><td rowspan="4"> Kein Signal in der Positivkontrolle und / oder PanH3 ChIP. </td><td> Nicht genug Chromatin für das Experiment verwendet. </td><td> Erhöhung der Chromatinmenge </td></tr><tr><td> Die Menge des Antikörpers ist zu niedrig. </td><td> Erhöhe die Menge an Antikörper. </td></tr><tr><td> Die AntiKörper hat eine geringe Spezifität. </td><td> Ändern Sie den Antikörper. </td></tr><tr><td> Elution ist suboptimal. </td><td> Achten Sie darauf, die Proben häufig zu verwirbeln, um die Perlen in Lösung zu halten. </td></tr></tbody></table> Tabelle 5: Fehlersuche.

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Chromatin Immunoprecipitation ChIP in Mouse T-cell Lines

Diese Arbeit beschreibt ein Protokoll für die Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP) unter Verwendung einer reifen Maus-T-Zelllinie. Dieses Protokoll ist geeignet, um die Verteilung von spezifischen Histonmarken an bestimmten Promotorstellen oder genomweiten zu untersuchen.

Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP) in Maus-T-Zell-Linien

Signaling pathways regulate gene expression programs via the modulation of the chromatin structure at different levels, such as by post-translational ...

chromatin-immunoprecipitation-chip-in-mouse-t-cell-lines

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Genetics

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) in Mouse T-cell Lines

18.2K Aufrufe.  University of Giessen.  Diese Arbeit beschreibt ein Protokoll für die Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP) unter Verwendung einer reifen Maus-T-Zelllinie. Dieses Protokoll ist geeignet, um die Verteilung von spezifischen Histonmarken an bestimmten Promotorstellen oder genomweiten zu untersuchen. 

Serie: Chromatin Immunoprecipitation ChIP in Mouse T-cell Lines

Improved Protocol for Chromatin Immunoprecipitation from Mouse Skeletal Muscle

We describe an efficient and reproducible protocol for the preparation of chromatin from adult mouse skeletal muscle, a physically resistant tissue with a high content of structural proteins. Dissected limb muscles from adult mice are physically disrupted by mechanical homogenisation, or a combination of mincing and douncing, in a hypotonic buffer before formaldehyde fixation of the cell lysate. The fixed nuclei are purified by further cycles of mechanical homogenisation or douncing and sequential filtrations to remove cell debris. The purified nuclei can be sonicated immediately or at a later stage after freezing. The chromatin can be efficiently sonicated and is suitable for chromatin immunoprecipitation experiments, as illustrated by the profiles obtained for transcription factors, RNA polymerase II, and covalent histone modifications. The binding events detected using chromatin prepared by this protocol are predominantly those taking place in the muscle fiber nuclei despite the presence of chromatin from other fiber-associated satellite and endothelial cells. This protocol is therefore adapted to study gene regulation in the adult mouse skeletal muscle.

A novel protocol for the preparation of chromatin from adult mouse skeletal muscle adapted to the study of gene regulation in muscle fibers by chromatin immunoprecipitation is presented.

Verbesserte Protokoll für Chromatin Immunopräzipitation aus Maus skelettartiger Muskel

We describe an efficient and reproducible protocol for the preparation of chromatin from adult mouse skeletal muscle, a physically resistant tissue with a ...

Forschung

Biochemie

Chromatin Immunoprecipitation of Murine Brown Adipose Tissue

Most cellular processes are regulated by transcriptional modulation of specific gene programs. Such modulation is achieved through the combined actions of a wide range of transcription factors (TFs) and cofactors mediating transcriptional activation or repression via changes in chromatin structure. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a useful molecular biology approach for mapping histone modifications and profiling transcription factors/cofactors binding to DNA, thus providing a snapshot of the dynamic nuclear changes occurring during different biological processes.
To study transcriptional regulation in adipose tissue, samples derived from in vitro cell cultures of immortalized or primary cell lines are often favored in ChIP assays because of the abundance of starting material and reduced biological variability. However, these models represent a limited snapshot of the actual chromatin state in living organisms. Thus, there is a critical need for optimized protocols to perform ChIP on adipose tissue samples derived from animal models.
Here we describe a protocol for efficient ChIP-seq of both histone modifications and non-histone proteins in brown adipose tissue (BAT) isolated from a mouse. The protocol is optimized for investigating genome-wide localization of proteins of interest and epigenetic markers in the BAT, which is a morphologically and physiologically distinct tissue amongst fat depots.

Here we describe a protocol for efficient chromatin immunoprecipitation (ChIP) followed by high-throughput DNA sequencing (ChIP-seq) of brown adipose tissue (BAT) isolated from a mouse. This protocol is suitable for both mapping histone modifications and investigating genome-wide localization of non-histone proteins of interest in vivo.

Chromatin Immunopräzipitation der murinen braunen Fettgewebe

Most cellular processes are regulated by transcriptional modulation of specific gene programs. Such modulation is achieved through the combined actions of ...

Genetik

Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are characterized by two fundamental properties: self-renewal and multipotency that allows a stem cell to differentiate into virtually any cell type 1. The progression stem cell to differentiated cell is characterized by loss of multipotency, structural and morphological changes and the hierarchic activity of transcription factors and signaling molecules, whose activities establish and maintain cell-type specific gene expression patterns. At the molecular level, cell differentiation involves dynamic changes of the structure and composition of chromatin and the detection of those dynamic changes can provide valuable insights into the functional features of stem cells and the cell differentiation process 2,3. Chromatin is a highly compacted DNA-protein complex that forms when cells package chromosomal DNA with proteins, mainly histones 4. Stemcellness and cell differentiation has been correlated with the presence of specific arrays of regulatory proteins such as epigenetic factors, histone variants, and transcription factors 2,3,5.
 Chromatin immunoprecipitation (ChIP) provides a valuable method to monitor the presence of RNA, proteins, and protein modifications in chromatin 6,7. The comparison of chromatin from different cell types can elucidate dynamic changes in protein-chromatin associations that occur during cell differentiation.
Chromatin immunoprecipitation involves the purification of in vivo cross-linked chromatin. The isolated chromatin is reduced to smaller fragments by enzymatic digestion or mechanical force. Chromatin fragments are precipitated using specific antibodies to target proteins or protein and DNA modifications. The precipitated DNA or RNA is purified and used as a template for PCR or DNA microarray based assays. Prerequisites for a successful ChIP are high quality antibodies to the desired antigen and the availability of chromatin from control cells that do not express the target molecule. ChIP can correlate the presence of proteins, protein and RNA modifications, and RNA with specific target DNA, and depending on the choice of outread tool, detects the association of target molecules at specific target genes or in the context of an entire genome. The comparison of the distribution of proteins in the chromatin of differentiating cells can elucidate the dynamic changes of chromatin composition that coincide with the progression of cells along a cell lineage.

The differentiation of ESC coincides with cell-type specific changes in the structure and composition of chromatin. The detection of those changes provides valuable insights into the mechanisms that define stemcellness and cell differentiation. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) represents a valuable method to dissect the molecular mechanisms underlying stem cell differentiation.

Chromatin Immunopräzipitation von humanen embryonalen Stammzellen

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are ...

Biologie

Chromatin Immunoprecipitation Assay Using Micrococcal Nucleases in Mammalian Cells

To express cellular phenotypes in organisms, living cells execute gene expression accordingly, and transcriptional programs play a central role in gene expression. The cellular transcriptional machinery and its chromatin modification proteins coordinate to regulate transcription. To analyze transcriptional regulation at the molecular level, several experimental methods such as electrophoretic mobility shift, transient reporter and chromatin immunoprecipitation (ChIP) assays are available. We describe a modified ChIP assay in detail in this article because of its advantages in directly showing histone modifications and the interactions between proteins and DNA in cells. One of the key steps in a successful ChIP assay is chromatin shearing. Although sonication is commonly used for shearing chromatin, it is difficult to identify reproducible conditions. Instead of shearing chromatin by sonication, we utilized enzymatic digestion with micrococcal nuclease (MNase) to obtain more reproducible results. In this article, we provide a straightforward ChIP assay protocol using MNase.

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool for understanding the molecular mechanisms of gene regulation. However, the method involves difficulties in obtaining reproducible chromatin fragmentation by mechanical shearing. Here, we provide an improved protocol for a ChIP assay using enzymatic digestion.

Chromatin Immunoprecipitation Assay mit Mikrokokken-Nukleasen in Säugetierzellen

To express cellular phenotypes in organisms, living cells execute gene expression accordingly, and transcriptional programs play a central role in gene ...

High-Resolution Mapping of Protein-DNA Interactions in Mouse Stem Cell-Derived Neurons using Chromatin Immunoprecipitation-Exonuclease (ChIP-Exo)

Identification of specific protein-DNA interactions on the genome is important for understanding gene regulation. Chromatin immunoprecipitation coupled with high-throughput sequencing (ChIP-seq) is widely used to identify genome-wide binding locations of DNA-binding proteins. However, the ChIP-seq method is limited by its heterogeneity in length of sonicated DNA fragments and non-specific background DNA, resulting in low mapping resolution and uncertainty in DNA-binding sites. To overcome these limitations, the combination of ChIP with exonuclease digestion (ChIP-exo) utilizes 5&#8217; to 3&#8217; exonuclease digestion to trim the heterogeneously sized immunoprecipitated DNA to the protein-DNA crosslinking site. Exonuclease treatment also eliminates non-specific background DNA. The library-prepared and exonuclease-digested DNA can be sent for high-throughput sequencing. The ChIP-exo method allows for near base-pair mapping resolution with greater detection sensitivity and reduced background signal. An optimized ChIP-exo protocol for mammalian cells and next-generation sequencing is described below.

High-Resolution Mapping of Protein-DNA Interactions in Mouse Stem Cell-Derived Neurons using Chromatin Immunoprecipitation-Exonuclease ChIP-Exo

Precise determination of protein-binding locations across the genome is important for understanding gene regulation. Here we describe a&#160;genomic mapping method that treats chromatin-immunoprecipitated DNA with exonuclease digestion (ChIP-exo) followed by high-throughput sequencing. This method detects protein-DNA interactions with near base-pair mapping resolution and high signal-to-noise ratio in mammalian neurons.

Hochauflösende Kartierung von Protein-DNA-Wechselwirkungen in Mausstammzell-abgeleiteten Neuronen mit Chromatin-Immunpräzipitation-Exonuklease (ChIP-Exo)

Identification of specific protein-DNA interactions on the genome is important for understanding gene regulation. Chromatin immunoprecipitation coupled ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for Tissue-specific Genes using Early-stage Mouse Embryos

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This technique has been widely exploited in tissue culture cells, and to a lesser extent, in primary tissue. The application of ChIP to rodent embryonic tissue, especially at early times of development, is complicated by the limited amount of tissue and the heterogeneity of cell and tissue types in the embryo. Here we present a method to perform ChIP using a dissociated embryonic day 8.5 (E8.5) embryo. Sheared chromatin from a single E8.5 embryo can be divided into up to five aliquots, which allows the investigator sufficient material for controls and for investigation of specific protein:chromatin interactions.
We have utilized this technique to begin to document protein:chromatin interactions during the specification of tissue-specific gene expression programs. The heterogeneity of cell types in an embryo necessarily restricts the application of this technique because the result is the detection of protein:chromatin interactions without distinguishing whether the interactions occur in all, a subset of, or a single cell type(s). However, examination of tissue-specific genes during or following the onset of tissue-specific gene expression is feasible for two reasons. First, immunoprecipitation of tissue specific factors necessarily isolates chromatin from the cell type where the factor is expressed. Second, immunoprecipitation of coactivators and histones containing post-translational modifications that are associated with gene activation should only be found at genes and gene regulatory sequences in the cell type where the gene is being or has been activated. The technique should be applicable to the study of most tissue-specific gene activation events.
In the example described below, we utilized E8.5 and E9.5 mouse embryos to examine factor binding at a skeletal muscle specific gene promoter. Somites, which are the precursor tissues from which the skeletal muscles of the trunk and limbs will form, are present at E8.5-9.54,5. Myogenin is a regulatory factor required for skeletal muscle differentiation 6-9. The data demonstrate that myogenin is associated with its own promoter in E8.5 and E9.5 embryos. Because myogenin is only expressed in somites at this stage of development 6,10, the data indicate that myogenin interactions with its own promoter have already occurred in skeletal muscle precursor cells in E8.5 embryos.

We demonstrate a chromatin immunoprecipitation (ChIP) method to identify factor interactions at tissue-specific genes during or after the onset of tissue-specific gene expression in mouse embryonic tissue. This protocol should be widely applicable for the study of tissue-specific gene activation as it occurs during normal embryonic development.

Chromatin Immunopräzipitation-Assay für Tissue-spezifische Gene mit Frühzeitige muriner Embryonen

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This ...

Efficient Chromatin Immunoprecipitation using Limiting Amounts of Biomass

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used method for determining the interactions of different proteins with DNA in chromatin of living cells. Examples include sequence-specific DNA binding transcription factors, histones and their different modification states, enzymes such as RNA polymerases and ancillary factors, and DNA repair components. Despite its ubiquity, there is a lack of up-to-date, detailed methodologies for both bench preparation of material and for accurate analysis allowing quantitative metrics of interaction. Due to this lack of information, and also because, like any immunoprecipitation, conditions must be re-optimized for new sets of experimental conditions, the ChIP assay is susceptible to inaccurate or poorly quantitative results.
Our protocol is ultimately derived from seminal work on transcription factor:DNA interactions1,2 , but incorporates a number of improvements to sensitivity and reproducibility for difficult-to-obtain cell types. The protocol has been used successfully3,4 , both using qPCR to quantify DNA enrichment, or using a semi-quantitative variant of the below protocol.
This quantitative analysis of PCR-amplified material is performed computationally, and represents a limiting factor in the assay. Important controls and other considerations include the use of an isotype-matched antibody, as well as evaluation of a control region of genomic DNA, such as an intergenic region predicted not to be bound by the protein under study (or anticipated not to show changes under the experimental conditions). In addition, a standard curve of input material for every ChIP sample is used to derive absolute levels of enrichment in the experimental material. Use of standard curves helps to take into account differences between primer sets, regardless of how carefully they are designed, and also efficiency differences throughout the range of template concentrations for a single primer set. Our protocol is different from others that are available5-8 in that we extensively cover the later, analysis phase.

We describe a robust method for chromatin immunoprecipitation using primary T cells. The method is founded on standard approaches, but uses a specific set of conditions and reagents that improve efficiency for limited a quantities of cells. Importantly, a detailed description of the data analysis phase is presented.

Effiziente Chromatin Immunopräzipitation mit limitierende Mengen an Biomasse

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a  widely-used method for determining the interactions of different proteins with  DNA in chromatin of living ...

TChIP-Seq: Cell-Type-Specific Epigenome Profiling

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological functions have been extensively studied. Indeed, the advent of next-generation deep sequencing and chromatin immunoprecipitation (ChIP) via specific histone modification antibodies has revolutionized our view of epigenetic regulation across the genome. Conversely, tissues typically consist of diverse cell types, and their complex mixture poses analytic challenges to investigating the epigenome in a particular cell type. To address the cell type-specific chromatin state in a genome-wide manner, we recently developed tandem chromatin immunoprecipitation sequencing (tChIP-Seq), which is based on the selective purification of chromatin by tagged core histone proteins from cell types of interest, followed by ChIP-Seq. The goal of this protocol is the introduction of best practices of tChIP-Seq. This technique provides a versatile tool for tissue-specific epigenome investigation in diverse histone modifications and model organisms.

We describe a step-by-step protocol for tandem chromatin immunoprecipitation sequencing (tChIP-Seq) that enables the analysis of cell-type-specific genome-wide histone modification.

TChIP-Seq: Cell-Type-Specific Epigenom Profilierung

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological ...

Chromatin Extraction from Frozen Chimeric Liver Tissue for Chromatin Immunoprecipitation Analysis

Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation (X-ChIP) is a widely used technique to assess levels of histone marks and occupancy of transcription factors on host and/or pathogen chromatin. Chromatin preparation from tissues creates additional challenges that need to be overcome to obtain reproducible and reliable protocols comparable to those used for cell culture. Tissue disruption and fixation are critical steps to achieve efficient shearing of chromatin. Coexistence of different cell types and clusters may also require different shearing times to reach optimal fragment size and hinders shearing reproducibility. The purpose of this method is to achieve reliable and reproducible host chromatin preparations from frozen tissue (liver) suitable for both ChIP-qPCR and next generation sequencing (NGS) applications. We observed that the combination of liquid nitrogen tissue pulverization followed by homogenization leads to increased reproducibility compared to homogenization only, since it provides a suspension consisting mostly of dissociated single cells that can be efficiently sheared. Moreover, the fixation step should be performed under mild rotation to provide homogeneous crosslinking. The fixed material is then suitable for buffer-based nuclei isolation, to reduce contamination of cytoplasmic protein and pathogen DNAs and RNAs (when applicable), avoiding time-consuming centrifugation gradients. Subsequent sonication will complete nuclear lysis and shear the chromatin, producing a specific size range according to the chosen shearing conditions. The size range should fall between 100 and 300 nt for NGS applications, while it could be higher (300-700 nt) for ChIP-qPCR analysis. Such protocol adaptations can greatly improve chromatin analyses from frozen tissue specimens.

This protocol focuses on chromatin preparation from snap frozen tissues and it is suitable for Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation (X-ChIP) followed by either quantitative PCR analysis (X-ChIP-qPCR) or next generation sequencing approaches (X-ChIP-seq).

Chromatinextraktion aus gefrorenem chimärem Lebergewebe für die Chromatin-Immunpräzipitationsanalyse

Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation (X-ChIP) is a widely used technique to assess levels of histone marks and occupancy of transcription factors on ...

Chromatin Immunoprecipitation

Histones are proteins that help organize DNA in eukaryotic nuclei by serving as &#8220;scaffolds&#8221; around which DNA can be wrapped, forming a complex called &#8220;chromatin&#8221;. These proteins can be modified through the addition of chemical groups, and these changes affect gene expression. Researchers use a technique called chromatin immunoprecipitation (ChIP) to better understand which DNA regions associate with specific histone modifications or other gene regulatory proteins. Antibodies are used to isolate the protein of interest, and the bound DNA is extracted for analysis. Here, JoVE presents the principles behind ChIP, discussing specific histone modifications and their relationship to gene expression and DNA organization. We then review how to perform a ChIP protocol, and explore the ways scientists are currently using this technique.

Chromatin-Immunpräzipitation

Histones are proteins that help organize DNA in eukaryotic nuclei by serving as &#8220;scaffolds&#8221; around which DNA can be wrapped, forming a complex ...