この作品は、NIHの助成金CA141009とGM39067によってサポートされていました。私たちは、書かれた部分にコメントをE.パーネルとR. Yarringtonに感謝します。

1。マウス脾臓ナイーブCD4 T細胞の分離<ol><li>インスティテューショナルアニマルケアと利用委員会（IACUC）プロトコルと一致して人道的な方法でマウスを生け贄に捧げる。脾臓を分析し、10％FBSを含むDMEMを10ml含むペトリ皿に入れてください。 </li><li>脾細胞を解放するために2つのスライドガラスのフロスト端部を用いて脾臓をつぶす。 15ミリリットルコニカルチューブに細胞懸濁液を移す。 </li><li> 4℃で5分間、200×gで（典型的なローター直径の臨床遠心分離機用〜1,200 rpm）で遠心分離により細胞を回収</li><li>室温（RT）で1分間、赤血球を溶解するために2ミリリットルACKバッファーで細胞を再懸濁する。 FBSを含むDMEM 8mlのを追加することにより、反応を停止させます。 </li><li> 4℃で5分間、200×gで遠心分離によって細胞を回収</li><li> DMEM含むFBS 5mlに細胞を再懸濁し、70ミクロンメッシュフィルター（BDファルコン、カタログ番号352350）を通過する。細胞をカウントして続行ナイーブCD4の分離にメーカーの指示を使用してCD4離キット（Miltenyi社、カタログ番号130-​​095-248）を用いて細胞は、T。 4で5分間200×gで遠心分離によってT細胞℃でナイーブCD4を収集FBSと10mlのDMEMで細胞を再懸濁する。 </li></ol> 2。クロマチンの調製<ol><li>タンパク質複合体：クロスリンクDNAに15分間DMEM中で細胞懸濁液に1％の最終濃度を37％ホルムアルデヒドを加え、穏やかにRTで岩（Nutatorを用いる）。 </li><li> 125mMの最終濃度1 Mグリシンを添加することによって架橋を停止する。室温で5分間揺らし続けています。 </li><li> 4℃で5分間、200×gで遠心分離によって細胞を回収</li><li>氷冷PBS含むプロテアーゼ阻害剤の5mlに再懸濁することにより細胞を洗浄。 3回合計氷冷PBSを含むプロテアーゼ阻害剤で洗浄し、4℃で遠心分離により細胞を回収℃に</li><li> 1ml中に細胞を再懸濁しプロテアーゼ阻害剤を含む氷冷細胞溶解バッファー。 15分間、氷上でインキュベートする。細胞溶解の効率は0.4％トリパンブルー溶液（Sigma社、カタログ番号T8154）で細胞の小アリコートを再懸濁し、そして顕微鏡で観察することによって決定することができる。 </li><li> 4℃で5分間、200×gで（通常〜1,200 rpm）で遠心分離により核を集める慎重に上清を捨てる。 </li><li>プロテアーゼ阻害剤を含む核溶解緩衝液500μlの中の核を再懸濁し。 15分間、氷上でインキュベートする。 </li><li>出力レベル4、15秒バースト、氷の上で4回：Misonixソニケータ3,000、プローブの大きさ1.6ミリメートルを用いて細胞を超音波処理。各サンプルは、サンプルの過熱を防ぐために再度それを超音波処理する前に、1〜2分間氷上で冷却しなければならない。過熱は、クロスリンクの逆転を引き起こす可能性があります。 </li><li> 4で5分間16,000 xgで（マイクロで〜13,200 rpm）で超音波処理クロマチンを遠心℃に</li><li>明確なsupern20μlのアリコートを取りatant、DNAローディング染料を追加し、2％アガロースゲル（ほとんどのアプリケーションのために超音波処理したDNAの理想的な大きさが200-500 bpである）を通して電気泳動により超音波処理したDNAを確認してください。 </li><li> UV分光光度計を用いてDNA濃度を決定します。断片化クロマチンは℃のクロマチン免疫沈降反応を設定するためにすぐに使用されるか、または-80℃で保存することができます一般的に我々はマウス当たり2-3 X 10 6精製したCD4 T細胞は7.5から10μgのDNAを得る。 </li></ol> 3。クロマチン免疫沈降（すべてのステップが0-4℃で実施しなければならない） <ol><li>プロテアーゼ阻害剤付きチップ希釈バッファーでμgの/ mlの5-10のDNA濃度（総容積= 1ミリリットル）に超音波処理クロマチンを希釈。 </li><li>入力として100μlの（10％）を保存します。氷の上に保管してください。 </li><li>アリコート450μlの各アイソタイプコントロール（マウスまたはウサギIgG）及び目的の抗体としてラベル2 1.7ミリリットルマイクロチューブに。同じアイソタイプの複数の抗体が使用される場合、単一のアイソタイプCONTRオールは、この分析を実行するのに十分である。異なる動物源またはアイソタイプの抗体が使用されている場合は、複数のアイソタイプコントロールが必要になります。 </li><li>それぞれのチューブに使用する抗体の特異性に応じて、特定の抗体、またはアイソタイプコントロールの2-5μgのを追加します。 </li><li> °Cクロマチン - 抗体複合体の形成を可能にするために4℃で一晩Nutatorを使用してチューブを揺する。 </li><li>上記混合物にプロテインG磁気ビーズ（中断ビーズの1:1スラリー）を25μlを加え、4℃で少なくとも2時間揺することができ℃の我々のベンダーからビーズを直接使用することができる。 </li><li>磁気スタンドにマイクロチューブを置き、ビーズが磁化側に収集することができます。 </li><li>丁寧にビーズを乱すことなく吸引して溶液を除去。 </li><li>低塩洗浄溶液1mlを加え、穏やかにNutatorで5分間揺することができます。マグネチックスタンドを使用してビーズを収集し、洗浄溶液を除去。一回繰り返します。</li><li>高塩洗浄溶液1mlを加え、Nutator上で5分間揺することができます。マグネチックスタンドを使用してビーズを収集し、洗浄溶液を除去。一回繰り返します。 </li><li>塩化リチウムの洗浄溶液1mlを加え、Nutatorで5分間揺することができます。マグネチックスタンドを使用してビーズを収集し、洗浄溶液を除去。一回繰り返します。塩化リチウムの使用は、ビーズと非特異的クロマチン相互作用の効果的な除去を改善する。 </li><li> TE溶液1mlを加え、Nutator上で5分間揺することができます。マグネチックスタンドを使用してビーズを収集し、洗浄溶液を除去。 </li><li>溶出緩衝液を250μlを添加することによってビーズからDNAを溶出する。室温で15分間ロック。溶出液をオフにピペットして、新しい1.7ミリリットルのマイクロチューブでこの材料を保存します。もう一度繰り返し、溶出の両方を兼ね備えています。ビーズを捨てる。 </li><li>クロスリンクは最終0.3 Mの濃度とのRNase Aを1μl（20メートルに5 M NaClを追加し逆転する<html>溶出したDNAへグラム/ミリリットル）。容積500μlのように、ステップ3.2で保存した入力に溶出バッファー400μLを加える。入力に0.3 M、リボヌクレアーゼA、0.5 M EDTA、1Mトリス-HCl pH6.5の液20μlおよびプロテイナーゼK（20 mg / ml）で1μlの10μlの1μlのにNaClを加える。 </li><li>乾燥加熱ブロックで65℃で一晩チューブ℃でインキュベートする。 、サンプルの蒸発を避けるためにシールや開口部からそれらを保つためにチューブの重量を配置する。ハイブリダイゼーションオーブンを使用することもできる。 </li><li>室温に冷却管をしましょう​​。 1ミリリットルの100％エタノールを加え、-80℃で2時間、一晩インキュベート°C沈殿DNAへ。 </li><li>ペレットに15分DNAに対して16,000 xgでチューブを遠心する。 70％エタノールと空気乾燥ペレットで一度DNAペレットを洗浄します。オートクレーブ蒸留水100μlのDNAペレットを再懸濁します。 </li><li>溶出緩衝液50μlの総容積でキアクイックスピンカラム及び溶出を用いてDNAを精製する。このDNAは、PCRのために使用する準備ができました。 </li></ol>PCR反応の &quot;&gt; 4。準備（すべてのステップを氷上で実施しなければならない） <ol><li>チップと対応する入力サンプルから全DNAサンプルを収集します。また、ターゲットを絞った地域だけでなく、制御領域のすべてのPCR試薬とプライマーを集める。 &quot;ホットスタート&quot; Taq DNAポリメラーゼを使用してください。私たちは、この手順でDNA増幅を定量化するためにSYBRグリーンベースのアッセイを使用しますが、必要に応じて定量PCRマスターミックスキットを使用することができます。 </li><li>定量PCR分析における標準曲線を生成するための入力DNAの連続希釈を行う。例えば10％、1％、0.1％、溶出緩衝液中の0.01％は（ステップ3.18でキアクイックスピンカラムから）。この標準曲線テンプレートセットの濃度範囲と増分を96ウェルプレート（Genemate、カタログ番号T-3182から1の各ウェルにインプットDNAサンプルを10μl分注し等のChIP富化の予想されるレベルに基づいて変えることができる）、重複しています。 </li><li> 10ミリリットルチップアイソタイプコントロールからのDNAと同様に、それぞれに特異的な抗体をディスペンス三重で井戸。 </li><li>ターゲットプライマーまたはコントロールプライマー（各プライマー0.1μMの最終濃度）のいずれかを含む &quot;マスターミックス&quot;を作成し、各ウェルに10μLを分注する。たとえば、テンプレートで以下のマスターミックスを含有スペンスウェルに標的プライマーをウェルに緑色のマークが付けられ、コントロールプライマーを用いてマスターミックスを分配赤いマーク。 </li><li>井戸の底にすべてを収集するために、室温で1分間臨床遠心分離機（〜1,200 rpm）で、500×gで光学プラスチック封止膜と遠心分離機を用いたPCRプレートをカバーしています。 </li><li> PCR反応を開始します。私たちは、ライトサイクラー480 II（Roche）をこの例では、定量PCRを実行するためのオペレーティングライトサイクラー480SW 1.5ソフトウェアを使用します。 </li></ol>プレインキュベーション：1サイクル：95℃/ 5分。 増幅：40-45サイクル：94℃/ 5​​秒、60℃/ 5秒、72°C/10秒（温度が融点TEMPERATUR未満2-3°CであるべきアニーリングプライマーのE）。 融解曲線：1サイクル。 冷却：1サイクル。 <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 7 </td><td> 8 </td><td> 9 </td><td> 10 </td><td> 11 </td><td> 12 </td></tr><tr><td> A </td><td> 10％入力</td><td> 10％入力</td><td>アイソタイプ</td><td>特定</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> B </td><td> 1％入力</td><td> 1％入力</td><td>アイソタイプ</td><td>特定</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td&gt; <td></td><td></td></tr><tr><td> C言語</td><td> 0.1％入力</td><td> 0.1％入力</td><td>アイソタイプ</td><td>特定</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> D </td><td> 0.01％入力</td><td> 0.01％入力</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> E </td><td> 10％入力</td><td> 10％入力</td><td>アイソタイプ</td><td>特定</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> F </td><td> 1％入力</td><td> 1％入力</td><td>アイソタイプ</td><td>特定</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> G </td><td> 0.1％入力</td><td> 0.1％入力</td><td>アイソタイプ</td><td>特定</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> H </td><td> 0.01％入力</td><td> 0.01％入力</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>緑：ターゲット地域のプライマーを使用してください。 赤：制御領域のプライマーを使用してください。 5。分析<ol><li> DNAの絶対量の定量化のためのプログラムのqPCRソフトウェア。重要なのは、未知の特定及びアイソタイプ試料における補間DNA量に標準曲線を使用することは、すべてのプライマーの品質と効率の評価とのマッチングは、サンプルで見つかった濃度範囲にわたって設定可能。さらに、それはまた、モルを提供する電子usingΔΔCqおよび関連の方法よりも最終的な相対倍濃縮結果にCQ（C tまたはC p）の値を変換するための信頼できる方法。 </li><li>サンプルエディターに移動​​し、それらの標準曲線の値と種々の希釈の入力サンプルを（10％、1％、0.1％と0.01％）含むウェルをマーク。また、PCRプレートがレイアウトされているとおりに、未知のChIPサンプルを井戸にラベルを付ける。他の定量PCRマシンで使用される同等のソフトウェアでは、それに応じて各プライマーペアの反応は、標準曲線の値と実験およびアイソタイプ対照サンプルに対応する部分集合を指定する。 </li><li>ライトサイクラーソフトウェアでは、サブセットエディタに移動し、入力サンプルと井戸と同様未知のChIPサンプルを含むサブセットをマーク。未知試料を分析のために、入力サンプルの既知濃度から生成された標準曲線を用いて定量することができる。他の定量PCRマシンで使用される同等のソフトウェア、指名サブセットcorrespで各プライマーペアのすべての反応にとめどなく流れ出ること。 </li><li> PCR増幅が完了したら、 &quot;絶対Quant/2ndデリバティブマックス&quot;との分析を行い、分析し、Enterキーを押しOKためのサブセットを選択します。他の定量PCRマシンで使用される同等のソフトウェアでは、各サブセット中のDN​​A量にCqの値を変換します。 </li><li>入力サンプルの既知の濃度を用いて標準曲線を生成し、未知試料中に存在するDNAの絶対量が表示される &quot;計算&quot;を押してください。 </li><li>せん断DN​​Aの品質が良好であれば、とプライマーは、標的部位に特異的に結合する場合には、PCR効率に近い2〜でなければならない。 </li><li>可能であれば、同じサブセットに対して &quot;呼び出しのTm&quot;と融解曲線分析を行います。単一のピークは、1つの特定の製品が増幅されたことを示します。特定のDNAの増幅はまた、アガロースゲルを介してDNAラダーと共にPCR産物を電気泳動することにより試験することができる。 </li><li>としてデータをエクスポートタブさらなる分析のためにMicrosoft Excelで開くことができます区切りのテキストフ​​ァイル、。 </li><li> Microsoft Excelを使用して、標的プライマー用アイソタイプコントロールで特定の抗体のためのDNA量を割ります。制御領域のプライマーに対して、この手順を繰り返します。同じアイソタイプの抗体は、複数の異なる免​​疫沈降に使用した場合、同じアイソタイプコントロールからの値が、これらのそれぞれを正規化する。複数の標的プライマー対が使用される場合、また、単一の制御プライマー対のセットからのDNA量は、各ターゲット（ 図1および2）の正規化のために使用されるべきである。出力値は、非特異的抗体の背景免疫沈降に対する各位置における特異的抗体免疫沈降倍濃縮を表す。 </li><li>に対して相対的濃縮を取得するために制御領域プライマー倍濃縮（制御アイソタイプ）とターゲットプライマー倍濃縮を（制御アイソタイプ）割りバインドされていない領域（ 図1）を制御する。重要なのは、なぜなら各サンプルの総入力DNAと標準曲線の発生上記の免疫沈降値のそれぞれが、標準曲線から既にに正規化され、補間、およびように発現していることに注意して、マシンソフトウェアによって総入力の割合。 </li><li>免疫沈降または洗浄に使用されるバッファのストリンジェンシーが高すぎる場合には、アイソタイプ対照の増幅がサンプルが観察されない免疫沈降させながら、特異的な抗体で免疫沈降サンプルから堅牢な増幅が、観察されることが可能である。そのようなシナリオでは、標的領域と非結合領域の両方に特異的な抗体チップからのアイソタイプコントロールチップの量を減算する方がよい。相対的濃縮は、非結合領域（ 図3）差による標的領域に対する差を割ることによって算出することができる。 </li></ol>

<ol>
	<li>Weinmann, A. S., Bartley, S. M., Zhang, T., Zhang, M. Q., Farnham, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+chromatin+immunoprecipitation+to+clone+novel+E2F+target+promoters.">Use of chromatin immunoprecipitation to clone novel E2F target promoters.</a> Molecular and Cellular Biology. 21, 6820-6832 (2001).</li><li>Weinmann, A. S., Farnham, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+unknown+target+genes+of+human+transcription+factors+using+chromatin+immunoprecipitation.">Identification of unknown target genes of human transcription factors using chromatin immunoprecipitation.</a> Methods. 26, 37-47 (2002).</li><li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constitutive+nuclear+localization+of+NFAT+in+Foxp3++regulatory+T+cells+independent+of+calcineurin+activity.">Constitutive nuclear localization of NFAT in Foxp3+ regulatory T cells independent of calcineurin activity.</a> J. Immunol. 188, 4268-4277 (2012).</li><li>Shakya, A., Kang, J., Chumley, J., Williams, M. A., Tantin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oct1+is+a+switchable,+bipotential+stabilizer+of+repressed+and+inducible+transcriptional+states.">Oct1 is a switchable, bipotential stabilizer of repressed and inducible transcriptional states.</a> The Journal of Biological Chemistry. 286, 450-459 (2011).</li><li>Dahl, J. A., Collas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+micro+chromatin+immunoprecipitation+assay+(microChIP).">A rapid micro chromatin immunoprecipitation assay (microChIP).</a> Nature Protocols. 3, 1032-1045 (2008).</li><li>Lubelsky, Y., Macalpine, H. K., Macalpine, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+localization+of+replication+factors.">Genome-wide localization of replication factors.</a> Methods. 57, 187-195 (2012).</li><li>O'Neill, L. P., VerMilyea, M. D., Turner, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+characterization+of+the+early+embryo+with+a+chromatin+immunoprecipitation+protocol+applicable+to+small+cell+populations.">Epigenetic characterization of the early embryo with a chromatin immunoprecipitation protocol applicable to small cell populations.</a> Nature Genetics. 38, 835-841 (2006).</li><li>Sikes, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+streamlined+method+for+rapid+and+sensitive+chromatin+immunoprecipitation.">A streamlined method for rapid and sensitive chromatin immunoprecipitation.</a> Journal of Immunological Methods. 344, 58-63 (2009).</li><li>Rhee, H. S., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+genome-wide+protein-DNA+interactions+detected+at+single-nucleotide+resolution.">Comprehensive genome-wide protein-DNA interactions detected at single-nucleotide resolution.</a> Cell. 147, 1408-1419 (2011).</li><li>Rhee, H. S., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+structure+and+organization+of+eukaryotic+pre-initiation+complexes.">Genome-wide structure and organization of eukaryotic pre-initiation complexes.</a> Nature. 483, 295-301 (2012).</li><li>Kharchenko, P. V., Tolstorukov, M. Y., Park, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+analysis+of+ChIP-seq+experiments+for+DNA-binding+proteins.">Design and analysis of ChIP-seq experiments for DNA-binding proteins.</a> Nature Biotechnology. 26, 1351-1359 (2008).</li><li>Robertson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+profiles+of+STAT1+DNA+association+using+chromatin+immunoprecipitation+and+massively+parallel+sequencing.">Genome-wide profiles of STAT1 DNA association using chromatin immunoprecipitation and massively parallel sequencing.</a> Nature Methods. 4, 651-657 (2007).</li></ol>

利害の衝突は宣言されていない。

上記プロトコルが正確にチップを用いた主要リンパ球からDNAの濃縮を定量化する堅牢な方法を提供します。このプロトコルで堅牢性のために一つの大きな理由は、生物学的には複製が含まれていることです。上記のプロトコルは3が、独立して計算される濃縮を複製し使用しています。出力は、変動性の尺度を提供するために、計算された濃縮および標準偏差の程度を提供するために平均化さ...

<table><tbody><tr><td>Formaldehyde</td><td>Sigma</td><td>F-8775</td><td>Store at RT</td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline</td><td>Hyclone</td><td>SH30256.01</td><td>Store at 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Protease Inhibitor tablets</td><td>Roche</td><td>04693116001</td><td>Store at 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Protein G magnetic beads</td><td>Active Motif</td><td>101945</td><td>Store at 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>RNase A (20 mg/ml)</td><td>EMD Millipore</td><td>556746</td><td>Store at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Proteinase K (20 mg/ml)</td><td>Roche</td><td>03115879001</td><td>Dissolve in 50 mM Tris-HCl, 10 mM CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, pH 8.0</td></tr><tr><td>Platinum Taq DNA Polymerase</td><td>Invitrogen</td><td>10966-034</td><td>Store at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>SYBR Green I</td><td>Invitrogen</td><td>S7567</td><td>Store at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>1 M Glycine</td><td></td><td></td><td>Store at RT</td></tr><tr><td>Cell lysis buffer (5 mM Pipes, pH 8.0; 85 mM KCl; 0.5% NP-40)</td><td></td><td></td><td>Store at 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Nuclear lysis buffer (50 mM Tris, pH 8.1; 10 mM EDTA; 1% SDS)</td><td></td><td></td><td>Store at RT</td></tr><tr><td>ChIP dilution buffer (0.01% SDS; 1.1% Triton X-100; 1.2 mM EDTA; 16.7 mM Tris pH 8.1; 190 mM NaCl)</td><td></td><td></td><td>Store at 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Low salt wash buffer (0.1% SDS; 1% Triton X-100; 2 mM EDTA; 20 mM Tris pH 8.1; 150 mM NaCl)</td><td></td><td></td><td>Store at 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>High salt wash buffer (0.1% SDS; 1% Triton X-100; 2 mM EDTA; 20 mM Tris pH 8.1; 600 mM NaCl)</td><td></td><td></td><td>Store at 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>LiCl wash buffer (0.25 M LiCl; 1% NP-40; 1% Sodium Deoxycholate, 1 mM EDTA; 10 mM Tris pH 8.0)</td><td></td><td></td><td>Store at 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>TE buffer (10 mM Tris, pH 7.4, 1 mM EDTA)</td><td></td><td></td><td>Store at 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Elution buffer (1% SDS; 0.1 M NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)</td><td></td><td></td><td>Prepare fresh</td></tr><tr><td>5 M NaCl</td><td></td><td></td><td>Store at RT</td></tr><tr><td>0.5 M EDTA</td><td></td><td></td><td>Store at RT</td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl, pH 6.5</td><td></td><td></td><td>Store at RT</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Table of Specific Reagents&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Clay Adams Brand Nutator</td><td>Becton Dickinson</td><td>Model: 421105</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic Stand</td><td>Promega</td><td>Z5342</td><td></td></tr><tr><td>Qiaquick PCR Purification Kit</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>Masonix Sonicator 3000</td><td>QSonica</td><td>Model: S3000</td><td></td></tr><tr><td>UV Spectrophotometer</td><td>NanoDrop Technologies</td><td>ND-1000</td><td></td></tr><tr><td>Heating Block</td><td>VWR</td><td>13259-030</td><td></td></tr><tr><td>Rotator</td><td>VWR</td><td>80085-692</td><td></td></tr><tr><td>Refrigerated bench top centrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>Model: Allegra X-12R</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5415 D</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Table of Equipment&lt;/strong&gt; </td></tr></tbody></table>

efficient chromatin immunoprecipitation using limiting amounts of biomass

クロマチン免疫沈降（チップ）は、生きた細胞のクロマチン中のDNAと異なるタンパク質との相互作用を決定するために広く用いられている方法である。例としては、配列特異的DNA結合転写因子、ヒストンおよびそれらの異なる変形状態が、そのようなRNAポリメラーゼおよび補助因子として酵素およびDNA修復成分を含む。その普遍性にもかかわらず、最新の欠如、相互作用の定量的な評価指標を可能材のベンチの準備の両方の正確な分析のための詳細な方法論があります。この情報の欠如に起因し、また、任意の免疫沈降のように、条件は実験条件の新しいセットの再最適化する必要があり、あるため、ChIP解析が不正確又は不十分な定量結果を受けやすい。 我々のプロトコルは、最終的に転写因子で精液の仕事に由来する：DNA相互作用1,2が、感作に多くの改良を組み込ん困難な得る細胞タイプに対するVITY及び再現。プロトコルは、DNAの濃縮を定量する定量PCRを用いて、以下のプロトコルの半定量的変異体を使用して両方が正常3,4使用されている。 PCR増幅された材料のこの定量的な分析は、計算行い、アッセイにおける制限因子を表す。重要なコントロールやその他の考慮事項は、下に変更を表示しないようにこのような研究対象のタンパク質（または予想に拘束されることにしないと予測遺伝子間領域としてアイソタイプをマッチさせた抗体の使用だけでなく、ゲノムDNAの制御領域の評価を含んで実験条件）。さらに、すべてのChIPのサンプルの入力材料の標準曲線を実験材料で濃縮度の絶対レベルを導出するために使用される。標準曲線の使用は関係なく設計されているどのように慎重にの、プライマーセット間のアカウントの違いを考慮するのに役立ち、また、効率が異なる単一プライマーセット用のテンプレート濃度の範囲全体にわたってences。我々のプロトコルは、我々は広範囲に後で、分析フェーズをカバーするという点で5-8利用可能な他のものとは異なっている。

もしあればクロマチン免疫沈降（ChIPの）プロトコルは、このように &quot;ローディングコントロール&quot;として、ゲノムの非結合領域を増幅するプライマー対を使用してPCRで使用されるDNAの量で、相違のためにここコントロールを提示した。 図3に示す例では、標的領域としてマウスIL2プロモーターの利息および転写因子NFAT結合部位の我々のタンパク質に結合していない領...

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Efficient Chromatin Immunoprecipitation using Limiting Amounts of Biomass

我々は、一次T細胞を用いたクロマチン免疫沈降のための堅牢な方法が記載されている。メソッドは、標準的なアプローチの上に成り立ったが、細胞の数量限定のために効率を改善条件や試薬の特定のセットを使用しています。重要なことは、データ分析段階の詳細な説明が提示される。

バイオマスの制限額を使用して効率的なクロマチン免疫沈降

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a  widely-used method for determining the interactions of different proteins with  DNA in chromatin of living ...

efficient-chromatin-immunoprecipitation-using-limiting-amounts

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

14.2K ビュー.  University of Utah School of Medicine. 我々は、一次T細胞を用いたクロマチン免疫沈降のための堅牢な方法が記載されている。メソッドは、標準的なアプローチの上に成り立ったが、細胞の数量限定のために効率を改善条件や試薬の特定のセットを使用しています。重要なことは、データ分析段階の詳細な説明が提示される。

ビデオ: Efficient Chromatin Immunoprecipitation using Limiting Amounts of Biomass

Analysis of the c-KIT Ligand Promoter Using Chromatin Immunoprecipitation

Multiple cellular processes, including DNA replication and repair, DNA recombination, and gene expression, require interactions between proteins and DNA. Therefore, DNA-protein interactions regulate multiple physiological, pathophysiological, and biological functions, such as cell differentiation, cell proliferation, cell cycle control, chromosome stability, epigenetic gene regulation, and cell transformation. In eukaryotic cells, the DNA interacts with histone and nonhistone proteins and is condensed into chromatin. Several technical tools can be used to analyze DNA-protein interactions, such as the Electrophoresis (gel) Mobility Shift Assay (EMSA) and DNase I footprinting. However, these techniques analyze the protein-DNA interaction in vitro, not within the cellular context. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a technique that captures proteins at their specific DNA binding sites, thereby allowing for the identification of DNA-protein interactions within their chromatin context. It is done by fixation&#160;of the DNA-protein interaction, followed by&#160;immunoprecipitation of the protein of interest. Subsequently, the genomic site that the protein was bound to is characterized. Here, we describe and discuss ChIP and demonstrate its analytical value for the identification of the Transforming Growth Factor-&#946; (TGF-&#946;)-induced binding of the transcription factor SMAD2 to SMAD Binding Elements (SBE) within the promoter region of the tyrosine-protein kinase Kit (c-KIT) receptor ligand Stem Cell Factor (SCF).

DNA-protein interactions are essential for multiple biological processes. During the evaluation of cellular functions, the analysis of DNA-protein interactions is indispensable for understanding gene regulation. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to analyze such interactions in vivo.

クロマチン免疫沈降法を用いたc-KITリガンドプロモーターの解析

Multiple cellular processes, including DNA replication and repair, DNA recombination, and gene expression, require interactions between proteins and DNA. ...

遺伝学

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, transcription factors, or chromatin-modifying enzymes at a given locus or on a genome-wide scale. The combination of ChIP assays with next-generation sequencing (i.e., ChIP-Seq) is a powerful approach to globally uncover gene regulatory networks and to improve the functional annotation of genomes, especially of non-coding regulatory sequences. ChIP protocols normally require large amounts of cellular material, thus precluding the applicability of this method to investigating rare cell types or small tissue biopsies. In order to make the ChIP assay compatible with the amount of biological material that can typically be obtained in vivo during early vertebrate embryogenesis, we describe here a simplified ChIP protocol in which the number of steps required to complete the assay were reduced to minimize sample loss. This ChIP protocol has been successfully used to investigate different histone modifications in various embryonic chicken and adult mouse tissues using low to medium cell numbers (5 x 104 - 5 x 105 cells). Importantly, this protocol is compatible with ChIP-seq technology using standard library preparation methods, thus providing global epigenomic maps in highly relevant embryonic tissues.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Here, we describe a chromatin immunoprecipitation (ChIP) and ChIP-seq library preparation protocol to generate global epigenomic profiles from low-abundance chicken embryonic samples.

クロマチン免疫沈降 (チップ) プロトコル低豊富な胚サンプル

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, ...

A Filtration-based Method of Preparing High-quality Nuclei from Cross-linked Skeletal Muscle for Chromatin Immunoprecipitation

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful method to determine protein binding to chromatin DNA. Fiber-rich skeletal muscle, however, has been a challenge for ChIP due to technical difficulty in isolation of high-quality nuclei with minimal contamination of myofibrils. Previous protocols have attempted to purify nuclei before cross-linking, which incurs the risk of altered DNA-protein interaction during the prolonged nuclei preparation process. In the current protocol, we first cross-linked the skeletal muscle tissue collected from mice, and the tissues were minced and sonicated. Since we found that ultracentrifugation was not able to separate nuclei from myofibrils using cross-linked muscle tissue, we devised a sequential filtration procedure to obtain high-quality nuclei devoid of significant myofibril contamination. We subsequently prepared chromatin by using an ultrasonicator, and ChIP assays with anti-BMAL1 antibody revealed robust circadian binding pattern of BMAL1 to target gene promoters. This filtration protocol constitutes an easily applicable method to isolate high-quality nuclei from cross-linked skeletal muscle tissue, allowing consistent sample processing for circadian and other time-sensitive studies. In combination with next-generation sequencing (NGS), our method can be deployed for various mechanistic and genomic studies focusing on skeletal muscle function.

We present a filtration-based protocol to isolate high-quality nuclei from cross-linked mouse skeletal muscle wherein we removed the need for ultracentrifugation, making it easily applicable. We show that chromatin prepared from the nuclei is suitable for chromatin immunoprecipitation and likely chromatin immunoprecipitation sequencing studies.

クロマチン免疫沈降のための架橋された骨格筋からの高品質核の調製のためのろ過に基づく方法

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful method to determine protein binding to chromatin DNA. Fiber-rich skeletal muscle, however, has been a ...

生化学

Improved Protocol for Chromatin Immunoprecipitation from Mouse Skeletal Muscle

We describe an efficient and reproducible protocol for the preparation of chromatin from adult mouse skeletal muscle, a physically resistant tissue with a high content of structural proteins. Dissected limb muscles from adult mice are physically disrupted by mechanical homogenisation, or a combination of mincing and douncing, in a hypotonic buffer before formaldehyde fixation of the cell lysate. The fixed nuclei are purified by further cycles of mechanical homogenisation or douncing and sequential filtrations to remove cell debris. The purified nuclei can be sonicated immediately or at a later stage after freezing. The chromatin can be efficiently sonicated and is suitable for chromatin immunoprecipitation experiments, as illustrated by the profiles obtained for transcription factors, RNA polymerase II, and covalent histone modifications. The binding events detected using chromatin prepared by this protocol are predominantly those taking place in the muscle fiber nuclei despite the presence of chromatin from other fiber-associated satellite and endothelial cells. This protocol is therefore adapted to study gene regulation in the adult mouse skeletal muscle.

A novel protocol for the preparation of chromatin from adult mouse skeletal muscle adapted to the study of gene regulation in muscle fibers by chromatin immunoprecipitation is presented.

クロマチン免疫沈降マウス骨格筋からの改善されたプロトコル

We describe an efficient and reproducible protocol for the preparation of chromatin from adult mouse skeletal muscle, a physically resistant tissue with a ...

Chromatin Immunoprecipitation of Murine Brown Adipose Tissue

Most cellular processes are regulated by transcriptional modulation of specific gene programs. Such modulation is achieved through the combined actions of a wide range of transcription factors (TFs) and cofactors mediating transcriptional activation or repression via changes in chromatin structure. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a useful molecular biology approach for mapping histone modifications and profiling transcription factors/cofactors binding to DNA, thus providing a snapshot of the dynamic nuclear changes occurring during different biological processes.
To study transcriptional regulation in adipose tissue, samples derived from in vitro cell cultures of immortalized or primary cell lines are often favored in ChIP assays because of the abundance of starting material and reduced biological variability. However, these models represent a limited snapshot of the actual chromatin state in living organisms. Thus, there is a critical need for optimized protocols to perform ChIP on adipose tissue samples derived from animal models.
Here we describe a protocol for efficient ChIP-seq of both histone modifications and non-histone proteins in brown adipose tissue (BAT) isolated from a mouse. The protocol is optimized for investigating genome-wide localization of proteins of interest and epigenetic markers in the BAT, which is a morphologically and physiologically distinct tissue amongst fat depots.

Here we describe a protocol for efficient chromatin immunoprecipitation (ChIP) followed by high-throughput DNA sequencing (ChIP-seq) of brown adipose tissue (BAT) isolated from a mouse. This protocol is suitable for both mapping histone modifications and investigating genome-wide localization of non-histone proteins of interest in vivo.

マウスの褐色脂肪組織のクロマチン免疫沈降

Most cellular processes are regulated by transcriptional modulation of specific gene programs. Such modulation is achieved through the combined actions of ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay Using Micrococcal Nucleases in Mammalian Cells

To express cellular phenotypes in organisms, living cells execute gene expression accordingly, and transcriptional programs play a central role in gene expression. The cellular transcriptional machinery and its chromatin modification proteins coordinate to regulate transcription. To analyze transcriptional regulation at the molecular level, several experimental methods such as electrophoretic mobility shift, transient reporter and chromatin immunoprecipitation (ChIP) assays are available. We describe a modified ChIP assay in detail in this article because of its advantages in directly showing histone modifications and the interactions between proteins and DNA in cells. One of the key steps in a successful ChIP assay is chromatin shearing. Although sonication is commonly used for shearing chromatin, it is difficult to identify reproducible conditions. Instead of shearing chromatin by sonication, we utilized enzymatic digestion with micrococcal nuclease (MNase) to obtain more reproducible results. In this article, we provide a straightforward ChIP assay protocol using MNase.

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool for understanding the molecular mechanisms of gene regulation. However, the method involves difficulties in obtaining reproducible chromatin fragmentation by mechanical shearing. Here, we provide an improved protocol for a ChIP assay using enzymatic digestion.

哺乳類細胞における微小コッカルヌクレアーゼを用いてクロマチン免疫沈殿アッセイ

To express cellular phenotypes in organisms, living cells execute gene expression accordingly, and transcriptional programs play a central role in gene ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for Tissue-specific Genes using Early-stage Mouse Embryos

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This technique has been widely exploited in tissue culture cells, and to a lesser extent, in primary tissue. The application of ChIP to rodent embryonic tissue, especially at early times of development, is complicated by the limited amount of tissue and the heterogeneity of cell and tissue types in the embryo. Here we present a method to perform ChIP using a dissociated embryonic day 8.5 (E8.5) embryo. Sheared chromatin from a single E8.5 embryo can be divided into up to five aliquots, which allows the investigator sufficient material for controls and for investigation of specific protein:chromatin interactions.
We have utilized this technique to begin to document protein:chromatin interactions during the specification of tissue-specific gene expression programs. The heterogeneity of cell types in an embryo necessarily restricts the application of this technique because the result is the detection of protein:chromatin interactions without distinguishing whether the interactions occur in all, a subset of, or a single cell type(s). However, examination of tissue-specific genes during or following the onset of tissue-specific gene expression is feasible for two reasons. First, immunoprecipitation of tissue specific factors necessarily isolates chromatin from the cell type where the factor is expressed. Second, immunoprecipitation of coactivators and histones containing post-translational modifications that are associated with gene activation should only be found at genes and gene regulatory sequences in the cell type where the gene is being or has been activated. The technique should be applicable to the study of most tissue-specific gene activation events.
In the example described below, we utilized E8.5 and E9.5 mouse embryos to examine factor binding at a skeletal muscle specific gene promoter. Somites, which are the precursor tissues from which the skeletal muscles of the trunk and limbs will form, are present at E8.5-9.54,5. Myogenin is a regulatory factor required for skeletal muscle differentiation 6-9. The data demonstrate that myogenin is associated with its own promoter in E8.5 and E9.5 embryos. Because myogenin is only expressed in somites at this stage of development 6,10, the data indicate that myogenin interactions with its own promoter have already occurred in skeletal muscle precursor cells in E8.5 embryos.

We demonstrate a chromatin immunoprecipitation (ChIP) method to identify factor interactions at tissue-specific genes during or after the onset of tissue-specific gene expression in mouse embryonic tissue. This protocol should be widely applicable for the study of tissue-specific gene activation as it occurs during normal embryonic development.

初期段階のマウス胚を用いて組織特異的遺伝子のためのクロマチン免疫沈降アッセイ

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This ...

生物学

The ChroP Approach Combines ChIP and Mass Spectrometry to Dissect Locus-specific Proteomic Landscapes of Chromatin

Chromatin is a highly dynamic nucleoprotein complex made of DNA and proteins that controls various DNA-dependent processes. Chromatin structure and function at specific regions is regulated by the local enrichment of histone post-translational modifications (hPTMs) and variants, chromatin-binding proteins, including transcription factors, and DNA methylation. The proteomic characterization of chromatin composition at distinct functional regions has been so far hampered by the lack of efficient protocols to enrich such domains at the appropriate purity and amount for the subsequent in-depth analysis by Mass Spectrometry (MS). We describe here a newly designed chromatin proteomics strategy, named ChroP (Chromatin Proteomics), whereby a preparative chromatin immunoprecipitation is used to isolate distinct chromatin regions whose features, in terms of hPTMs, variants and co-associated non-histonic proteins, are analyzed by MS. We illustrate here the setting up of ChroP for the enrichment and analysis of transcriptionally silent heterochromatic regions, marked by the presence of tri-methylation of lysine 9 on histone H3. The results achieved demonstrate the potential of ChroP in thoroughly characterizing the heterochromatin proteome and prove it as a powerful analytical strategy for understanding how the distinct protein determinants of chromatin interact and synergize to establish locus-specific structural and functional configurations.

By combining native and crosslinking chromatin immunoprecipitation with high-resolution Mass Spectrometry, ChroP approach enables to dissect the composite proteomic architecture of histone modifications, variants and non-histonic proteins synergizing at functionally distinct chromatin domains.

ChroPアプローチは、クロマチンの遺伝子座特異的プロテオームの風景を分析するために、チップと質量分析を組み合わせ

Chromatin is a highly dynamic nucleoprotein complex made of DNA and proteins that controls various DNA-dependent processes. Chromatin structure and ...

Chromatin Extraction from Frozen Chimeric Liver Tissue for Chromatin Immunoprecipitation Analysis

Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation (X-ChIP) is a widely used technique to assess levels of histone marks and occupancy of transcription factors on host and/or pathogen chromatin. Chromatin preparation from tissues creates additional challenges that need to be overcome to obtain reproducible and reliable protocols comparable to those used for cell culture. Tissue disruption and fixation are critical steps to achieve efficient shearing of chromatin. Coexistence of different cell types and clusters may also require different shearing times to reach optimal fragment size and hinders shearing reproducibility. The purpose of this method is to achieve reliable and reproducible host chromatin preparations from frozen tissue (liver) suitable for both ChIP-qPCR and next generation sequencing (NGS) applications. We observed that the combination of liquid nitrogen tissue pulverization followed by homogenization leads to increased reproducibility compared to homogenization only, since it provides a suspension consisting mostly of dissociated single cells that can be efficiently sheared. Moreover, the fixation step should be performed under mild rotation to provide homogeneous crosslinking. The fixed material is then suitable for buffer-based nuclei isolation, to reduce contamination of cytoplasmic protein and pathogen DNAs and RNAs (when applicable), avoiding time-consuming centrifugation gradients. Subsequent sonication will complete nuclear lysis and shear the chromatin, producing a specific size range according to the chosen shearing conditions. The size range should fall between 100 and 300 nt for NGS applications, while it could be higher (300-700 nt) for ChIP-qPCR analysis. Such protocol adaptations can greatly improve chromatin analyses from frozen tissue specimens.

This protocol focuses on chromatin preparation from snap frozen tissues and it is suitable for Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation (X-ChIP) followed by either quantitative PCR analysis (X-ChIP-qPCR) or next generation sequencing approaches (X-ChIP-seq).

クロマチン免疫沈降分析のための凍結キメラ肝臓組織からのクロマチン抽出

Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation (X-ChIP) is a widely used technique to assess levels of histone marks and occupancy of transcription factors on ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay: A Technique to Study Protein-DNA Interactions in Cells

Source: Fuchs, A. R.,et al. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/t/58270">A Chromatin Immunoprecipitation Assay to Identify Novel NFAT2 Target Genes in Chronic Lymphocytic Leukemia.</a> J. Vis. Exp. (2018).
This video describes protocol for chromatin immunoprecipitation (ChIP) assay, which is a classic technique to demonstrate protein-DNA interactions.This technique is used to identify target genes in human chronic lymphocytic leukemia cells.

クロマチン免疫沈降アッセイ:細胞内のタンパク質-DNA相互作用を研究する技術

Source: Fuchs, A. R.,et al. A Chromatin Immunoprecipitation Assay to Identify Novel NFAT2 Target Genes in Chronic Lymphocytic Leukemia. J. Vis. Exp. ...