Agradecemos a P. Käse y T. Schmidt-Wöll su excelente asistencia técnica. Este trabajo fue apoyado por la beca de investigación colaborativa TRR81 y el programa Heisenberg (BO 1639 / 5-1) de la DFG (Fundación Alemana de Investigación), la Sociedad Max Planck y la EXC 294 en Friburgo y el Cluster de Excelencia para el Sistema Cardio Pulmonar (ECCPS) en Giessen a TB

NOTA: Todos los búferes y el medio utilizado en este protocolo se enumeran en la Tabla 1 . Días 1 y 2 1. Reticulación de las células <ol><li> Transferir las células T de ratón de una placa de 6 pocillos a un tubo de 50 ml y centrifugar durante 5 min a 4 ° C y ~ 271 x g. Resuspender el sedimento celular en 30 ml de medio de cultivo celular IMDM y contar las células utilizando una cámara Neubauer. </li><li> Recoja alícuotas de 20 x 10 6 células en nuevos tubos de 50 ml. </li><li> Añadir formaldehído (FMA) a una concentración final del 1% directamente al medio de cultivo celular e incubar a temperatura ambiente durante 10 min. Precaución: FMA es tóxico si se inhala, así que trabaje bajo una campana extractora y use equipo de protección adecuado. También, maneje los residuos FMA de acuerdo con las reglas de la institución anfitriona. </li><li> Añadir un 1/8-volumen de 1 M de glicina, pH 7,0, e incubar a temperatura ambiente durante 5 min. </li><li> Pellet las células por centrifugación de 5Min a 4 ° C y ~ 271 xg y se lava con 10 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS). </li><li> Lavar el sedimento celular con 1 mL de PBS y transferir a tubos de 1,5 mL. </li></ol> 2. Lisis Celular y Cizallamiento de Cromatina <ol><li> Resuspender el sedimento celular en 1 mL de tampón de lisis SDS e incubar en hielo durante 10 min. </li><li> Transferir cada muestra a un tubo de sonicación y realizar el cizallamiento usando un ultrasonizador enfocado de acuerdo con los ajustes indicados en la Tabla 2. </li><li> Tras el cizallamiento, se transfieren las muestras a tubos de 1,5 ml y se centrifugan durante 10 min a 4 ° C y ~ 18.000 x g. </li><li> Transferir el sobrenadante a nuevos tubos. </li><li> Recoger 50 μL para determinar el rendimiento de cizallamiento de acuerdo con el paso 3 y congelar rápidamente el lisado cortado en nitrógeno líquido. Almacene el lisado en alícuotas de un solo uso a -80 ° C. </li></ol> 3. Determinación de la eficiencia de corte <ol><li> Añadir 50 μl de tampón de elución al 50 &amp; #181 mu L de cada lisado sometido a cizallamiento e incubar a 65ºC durante la noche, con agitación. </li><li> Añadir 100 μl de tampón TE y 4 μL de RNasa A 10 mg / ml (concentración final de 0,2 μg / μL). Mezclar e incubar durante 2 ha 37 ° C, con agitación. </li><li> Añadir 2 μL de 20 mg / ml de proteinasa K (concentración final de 0,2 μg / μl) a cada muestra e incubar durante 2 ha 55 ° C, con agitación. </li><li> Transferir cada muestra a un tubo de gel adecuado para la extracción de fenol / cloroformo / alcohol isoamílico; Manejar de acuerdo con las instrucciones del fabricante. </li><li> Añadir 200 μl de fenol / cloroformo / alcohol isoamílico (25: 24: 1) y agitar los tubos. Centrifugar durante 5 min a 24 ° C y ~ 16.000 xg y transferir la fase superior a nuevos tubos. Precaución: El fenol, el cloroformo y el alcohol isoamílico son tóxicos si son inhalados y son corrosivos; Trabajar debajo de una campana de humos y usar equipo de protección personal adecuado. También, manejar fenol, cloroformo y residuos de alcohol isoamílico acDe acuerdo con las normas de la institución de acogida. <ol><li> Repita una vez. </li></ol></li><li> Purificar el ADN utilizando columnas de purificación de acuerdo con las instrucciones del fabricante, con las siguientes modificaciones: <ol><li> Lave la membrana dos veces. Después del último lavado, dejar el tubo abierto durante 2 min a temperatura ambiente para evaporar el etanol residual. </li><li> Para la elución, añadir 50 μl de H2O, incubar a temperatura ambiente durante 1 minuto, centrifugar el tubo durante 1 s para humedecer adecuadamente la membrana e incubar a temperatura ambiente durante 1 minuto antes de eluir el ADN por centrifugación durante 1 minuto a 24 ° C y ~ 17.900 x g. </li></ol></li><li> Cuantificar el ADN purificado en un fluorómetro utilizando un kit de alta sensibilidad de acuerdo con las instrucciones del fabricante. </li><li> Analizar aproximadamente 500 ng del ADN purificado en un gel de agarosa al 1,8% y aproximadamente 1 ng en un sistema de electroforesis usando un kit de alta sensibilidad. NOTA: El esperado sizE de los fragmentos de ADN está entre 200 y 500 pb. </li></ol> Días 3 y 4 4. Inmunoprecipitación <ol><li> Diluir 1 volumen de lisado cortado con 5 volúmenes de tampón de dilución. </li><li> Preclear con 30 μL / ml de perlas de agarosa de proteína A (preparadas de acuerdo con el Apéndice A ) durante 30 min mientras gira en la habitación fría. </li><li> Centrifugar a 4 ° C durante 5 min a ~ 750 x g. </li><li> Recoger el 10% de la entrada y almacenarla a 4 ° C. </li><li> Alícuota de la cantidad deseada de lisado en nuevos tubos (ver Tabla 3 para más detalles). Añadir los anticuerpos deseados a cada tubo (véase la Tabla 3 para más detalles) y girar durante una noche a 4 ° C. </li><li> Añadir 40 μL de perlas de proteína A e incubar durante 1 h a 4 ° C mientras giraba. </li><li> Lavar las perlas con 1 mL de tampón de baja sal, tampón de alto contenido en sal, tampón LiCl y tampón TE (para cada lavado, incubar durante 5 minutos a 4 ° C mientras gira y centrifugaDurante 3 min a 4 ° C y ~ 950 xg). Consulte la Tabla 3 para obtener más detalles. </li><li> Añadir 110 μl de tampón de elución e incubar durante 15 min a temperatura ambiente, agitando vorticialmente cada 2 min. </li><li> Centrifugar durante 3 min a 4 ° C y ~ 950 xg y transferir 100 μ l de sobrenadante a un nuevo tubo de 1,5 ml. </li><li> Repita los pasos 4.7-4.8 con 100 μl de tampón de elución y combine los eluatos. Añadir tampón de elución hasta 200 μL para introducir las muestras. </li><li> Incubar todas las muestras durante la noche a 65 ° C, con agitación. </li></ol> Día 5 5. Purificación de ADN <ol><li> Añadir 200 μl de tampón TE a cada eluato y 8 μl de RNasa A 10 mg / mL (concentración final de 0,2 μg / μl). Mezclar e incubar durante 2 ha 37 ° C, con agitación. </li><li> Añadir 4 μL de 20 μg / ml de proteinasa K (concentración final de 0,2 μg / μl) a cada eluato e incubar durante 2 ha 55 ° C, con agitación. </li><li> Transferir cada muestra a un gelTubo adecuado para la extracción de fenol / cloroformo / alcohol isoamílico; Manejar de acuerdo con las instrucciones del fabricante. </li><li> Añadir 400 μl de fenol / cloroformo / alcohol isoamílico (25: 24: 1) y agitar los tubos. Centrifugar durante 5 min a 24 ° C y ~ 16.000 x g. Transferir la fase superior a nuevos tubos. Precaución: El fenol, el cloroformo y el alcohol isoamílico son tóxicos si son inhalados y son corrosivos; Trabajar debajo de una campana de humos y usar equipo de protección personal adecuado. También, manejar residuos de fenol, cloroformo y alcohol isoamílico de acuerdo con las reglas de la institución de acogida. <ol><li> Repita una vez. </li></ol></li><li> Purificar el ADN utilizando columnas de purificación de acuerdo con las instrucciones del fabricante, con las siguientes modificaciones: </li><li> Lave la membrana dos veces. Después del último lavado, dejar los tubos abiertos durante 2 min a temperatura ambiente para evaporar el etanol residual. </li><li> Para la elución, añadir 50 μl de H2O, incubar a temperatura ambienteDurante 1 min, centrifugar los tubos durante 1 s para humedecer adecuadamente la membrana, e incubar a temperatura ambiente durante 1 min antes de eluir el ADN por centrifugación durante 1 min a 24 ° C y ~ 17.900 x g. </li></ol>

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	<li>Rothenberg, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chromatin+landscape+and+transcription+factors+in+T+cell+programming.">The chromatin landscape and transcription factors in T cell programming.</a> Trends Immunol. 35 (5), 195-204 (2014).</li><li>Zhang, J. A., Mortazavi, A., Williams, B. A., Wold, B. J., Rothenberg, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+transformations+of+genome-wide+epigenetic+marking+and+transcriptional+control+establish+T+cell+identity.">Dynamic transformations of genome-wide epigenetic marking and transcriptional control establish T cell identity.</a> Cell. 149 (2), 467-482 (2012).</li><li>Cauchy, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+recruitment+of+Ets1+to+both+nucleosome-occupied+and+-depleted+enhancer+regions+mediates+a+transcriptional+program+switch+during+early+T-cell+differentiation.">Dynamic recruitment of Ets1 to both nucleosome-occupied and -depleted enhancer regions mediates a transcriptional program switch during early T-cell differentiation.</a> Nucl Acids Res. 44 (8), 3567-3585 (2016).</li><li>Koch, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+initiation+platforms+and+GTF+recruitment+at+tissue-specific+enhancers+and+promoters.">Transcription initiation platforms and GTF recruitment at tissue-specific enhancers and promoters.</a> Nat Struct Mol Biol. 18 (8), 956-963 (2011).</li><li>Pekowska, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H3K4+tri-methylation+provides+an+epigenetic+signature+of+active+enhancers.">H3K4 tri-methylation provides an epigenetic signature of active enhancers.</a> EMBO J. 30 (20), 4198-4210 (2011).</li><li>Vanhille, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+and+quantitative+assessment+of+enhancer+activity+in+mammals+by+CapStarr-seq.">High-throughput and quantitative assessment of enhancer activity in mammals by CapStarr-seq.</a> Nat Commun. 6, 6905 (2015).</li><li>Barski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+profiling+of+histone+methylations+in+the+human+genome.">High-resolution profiling of histone methylations in the human genome.</a> Cell. 129 (4), 823-837 (2007).</li><li>Heintzman, N. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+assessment+of+histone-modification+antibody+quality.">An assessment of histone-modification antibody quality.</a> Nat Struct Mol Biol. 18 (1), 91-93 (2011).</li><li>Rothbart, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Interactive+Database+for+the+Assessment+of+Histone+Antibody+Specificity.">An Interactive Database for the Assessment of Histone Antibody Specificity.</a> Mol Cell. 59 (3), 502-511 (2015).</li><li>Fenouil, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CpG+islands+and+GC+content+dictate+nucleosome+depletion+in+a+transcription-independent+manner+at+mammalian+promoters.">CpG islands and GC content dictate nucleosome depletion in a transcription-independent manner at mammalian promoters.</a> Genome Res. 22 (12), 2399-2408 (2012).</li><li>Hein, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+methylation+of+Notch1+controls+the+amplitude+and+duration+of+the+Notch1+response.">Site-specific methylation of Notch1 controls the amplitude and duration of the Notch1 response.</a> Sci Signal. 8 (369), ra30 (2015).</li></ol>

Los autores no tienen intereses financieros en competencia.

ChIP es una técnica válida para investigar si las proteínas o sus PTM se enriquecen en regiones genómicas específicas. Los resultados del ensayo CHIP a menudo son difíciles de interpretar debido a razones biológicas o técnicas. Las razones biológicas son múltiples e incluyen la unión débil o indirecta de proteínas al ADN. También existen limitaciones técnicas, tales como la limitada especificidad de anticuerpos y la lisis celular ineficiente o el cizallamiento de la cromatina. Una guía de solución de problemas ( Tabla 5 ) puede ayudar al lector a resolver los problemas que pueden encontrarse con los ensayos ChIP. Este protocolo, haciendo uso de un dispositivo de ultrasonido enfocado enfriamiento, permite cortar eficientemente la cromatina de una línea de células T de ratón madura. El principal paso crítico del protocolo está representado por el cizallamiento de la cromatina, que siempre debe optimizarse para cada tipo de célula. Se sugiere variar el número de células y el número de ciclos de sonicación. Además, la<html> Aring está influenciada negativamente por la presencia de precipitados de SDS en las muestras, que pueden formarse durante la lisis de las células sobre hielo con tampón de lisis SDS. En este caso, es mejor incubar la muestra después de la lisis a temperatura ambiente durante unos minutos para reducir la presencia de precipitados de SDS. Se recomienda optimizar el protocolo para obtener fragmentos cortados entre 200 y 500 pb y evaluar siempre la calidad de corte de las muestras antes de proceder con la inmunoprecipitación. Adicionalmente, el tiempo de fijación, la cantidad de anticuerpo y / o células, y las condiciones de lavado deben optimizarse para cada anticuerpo. Un paso más crítico para hacer que un procedimiento de CHIP tenga éxito es la elección del anticuerpo, ya que los anticuerpos de baja especificidad reducen significativamente la eficacia de la inmunoprecipitación. Anteriormente, un procedimiento de prueba de calidad unificado permitió la evaluación de la especificidad de varios anticuerpos disponibles en el mercado<html> Ss = &quot;xref&quot;&gt; 19. La tubería de detección se basó en dot blot, Western blot y ChIP, proporcionando una lista de reactivos de alta calidad adecuados para ChIP 19 . Más recientemente, se evaluó la especificidad de varios anticuerpos comercialmente disponibles utilizando plataformas de microarrays de péptidos de histonas de alta densidad, lo que permitió establecer una base de datos sobre la especificidad de anticuerpos 20 . El lector puede utilizar esta herramienta útil para identificar los anticuerpos más específicos que se pueden utilizar para los experimentos de ChIP. Este protocolo no ha sido probado para las células T primarias y, en este caso, el lector debe referirse a otros protocolos publicados que llevan a cabo con éxito ChIP en células T primarias 3 , 4 , 21 . En particular, este protocolo se ha utilizado con éxito para realizar ChIP en una línea de células T progenitoras de ratón, así como en una línea de células endoteliales de ratón. Ove_content &quot;&gt; Para cada inmunoprecipitación se deben utilizar 5 x 10 6 células para el análisis de las marcas histonas, ya que este protocolo también puede ser adecuado, con alguna optimización, para realizar ChIP en TFs o cofactores, lo mejor es aumentar el número de células Utilizado para la inmunoprecipitación en estos casos Para alcanzar el número requerido de células para cada experimento, se pueden agrupar más partes alícuotas de lisado cortado antes de diluir la cromatina en el tampón de dilución. Este protocolo también podría ser modificado para realizar ChIP en proteínas endógenas que no se unen directamente al ADN. En este caso, se puede requerir una fijación previa con reticulantes proteína-proteína ( por ejemplo, adipimidato de dimetilo, DMA) (ver Apéndice B para más información). El rendimiento exitoso de ChIP en cofactores se realizó previamente mediante la sobreexpresión de proteínas que se fusionan a una etiqueta de biotina. En este caso, la proteína se purificó con estreptavidina-conjugaTed granos magnéticos, y una pre-fijación con DMA se realizó [ 22] .

El desarrollo, la diferenciación y la homeostasis dependen de programas de expresión génica específicos que se establecen mediante eventos de señalización que modulan la estructura de la cromatina y, por tanto, determinan si un gen específico se activa o se reprime de una manera específica de la célula y del tiempo. Durante el desarrollo de células T, se deben establecer programas específicos de expresión génica para determinar adecuadamente la maduración de los precursores de células T desde el estado doblemente negativo (DN) hasta el estado positivo único (SP), pasando por varias etapas intermedias 1 . La forma en que el programa de expresión génica se regula dinámicamente durante el desarrollo de células T ha sido ampliamente investigado en años anteriores por varios laboratorios 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . Por modificaciones postraduccionales (PTMs) de las histonas, el intercambio deLas histonas canónicas con variantes de histonas, el desalojo de nucleosomas y la metilación del ADN regulan el interruptor ON / OFF de los genes. Varios grupos han investigado la distribución de todo el genoma de PTMs y variantes de histonas para determinar las marcas que se asocian con diferentes estados de cromatina en ambas regiones reguladoras proximal y distal 7 , 8 , 9 , 10 . Las cascadas de señalización orquestan la regulación dinámica de la cromatina mediante el intercambio de enzimas modificadoras de la cromatina positivas y negativas (también conocidas como modificadores de la cromatina) en elementos potenciadores específicos. Estos modificadores de la cromatina regulan la estructura de la cromatina y, por tanto, la producción transcripcional, por ejemplo, por metilación dinámica de las histonas y acetilación. Este es el caso en la vía de señalización Notch 11 , 12 , 13 ,14. PTM histonas dinámicas; Intercambios con variantes de histonas; Y la ocupación dinámica de histonas, factores de transcripción y cofactores pueden ser investigados mediante ensayos de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP). Los anticuerpos altamente específicos se usan para purificar complejos específicos de ADN-proteína, y el ADN purificado se analiza por PCR cuantitativa (qPCR); Secuenciación profunda (ChIP-Seq); O, menos frecuentemente hoy en día, hibridación a microarrays (ChIP-ChIP). Los ensayos de CHIP a veces son desafiantes debido a complicaciones con la lisis de las células, cizallamiento de la cromatina y / o baja especificidad de los anticuerpos. Se han adoptado varias estrategias para mejorar el protocolo, como es el caso de NEXSON 15 . El uso de sonicadores de baño de agua de refrigeración evita el calentamiento de la muestra que podría dañar los epítopos presentes en la proteína bajo investigación, pero la energía requerida para el cizallamiento de las muestras se dispersa en el agua.Otra mejora se hizo con el desarrollo de dispositivos de ultrasonidos enfocados que evitan la dispersión de la energía. Por lo tanto, los dispositivos de ultrasonidos enfocados permiten mejoras en la lisis celular y en el cizallamiento de la cromatina, eliminando las variaciones inducidas por el operador y aumentando significativamente la reproducibilidad. Este trabajo describe un protocolo (descripción esquemática en la Figura 1 ) para realizar eficientemente el ChIP de las proteínas histonas en una línea de células T de ratón madura llamada E2-10HA 16 , 17 . Las células T suelen ser difíciles de lisar, y el cizallamiento de su cromatina se ha revelado que es ineficiente. En este protocolo, que hace uso de un enfriador enfocado ultrasonidos, el número de células, el tampón de lisis y el ajuste de cizallamiento se optimizaron para la línea de células T de ratón E2-10HA. Este protocolo permite realizar un ChIP con alta reproducibilidad y en un tiempo razonable. De hecho, requiereEs aproximadamente dos días para cortar la cromatina y evaluar la calidad del cizallamiento, y tres días para realizar la inmunoprecipitación, revertir la reticulación y purificar el ADN.

<table><tbody><tr><td>Agilent High Sensitivity D5000 Reagents</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5593</td><td></td></tr><tr><td>Agilent High Sensitivity D5000 ScreenTape</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5592</td><td></td></tr><tr><td>Agilent Tapestation 4200</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2991AA</td><td></td></tr><tr><td>Covaris S220 AFA System</td><td>Covaris</td><td>500217</td><td></td></tr><tr><td>dimethyl adipimidate (DMA)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>20660</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>Pan-Biotech</td><td>1502-P121301</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde (FMA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>Insulin solution human&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9278-5ML</td><td></td></tr><tr><td>Iscove&#039;s modified Dulbecco&#039;s medium (IMDM)</td><td>Gibco</td><td>21980-032</td><td></td></tr><tr><td>Minimum essential medium non-essential amino acids (MEM NEAA)</td><td>Gibco</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>nProtein A Sepharose 4 Fast Flow</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5280-02</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin&lt;br /&gt;(10,000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Peptone primatone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4963-100G</td><td></td></tr><tr><td>Phase Lock Gel Heavy 2&amp;nbsp;mL</td><td>5 Prime</td><td>2302830</td><td></td></tr><tr><td>Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1)</td><td>Roth</td><td>A156.2</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td><td>GIBCO</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K Solution (20 mg/mL), RNA grade</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25530049</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR Purification Kit (250)</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 3.0 Fluorometer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>Qubit assay tubes</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32854</td><td></td></tr><tr><td>RNase A, DNase and protease-free (10&amp;nbsp;mg/mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>Tube AFA Fiber &amp;amp; Cap</td><td>Covaris</td><td>520081</td><td></td></tr></tbody></table>

chromatin immunoprecipitation (chip) in mouse t-cell lines

Las vías de señalización regulan los programas de expresión génica a través de la modulación de la estructura de la cromatina a diferentes niveles, como las modificaciones postraduccionales (PTMs) de las colas histonas, el intercambio de histonas canónicas con variantes de histonas y el desalojo de nucleosomas. Tal regulación requiere la unión de factores de transcripción sensibles a señales (TFs) que reclutan enzimas modificadoras de la cromatina en elementos reguladores definidos como potenciadores. Entender cómo las cascadas de señalización regulan la actividad potenciadora requiere un análisis exhaustivo de la unión de TFs, enzimas modificadoras de la cromatina y la ocupación de marcas histonas específicas y variantes de histonas. Los ensayos de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) utilizan anticuerpos altamente específicos para inmunoprecipitar complejos específicos de proteína / ADN. El análisis subsiguiente del ADN purificado permite identificar la región ocupada por la proteína reconocida por el anticuerpo. Este trabajo describe un protocolo paraRform ChIP de las proteínas histonas en una línea de células T de ratón madura. El protocolo presentado permite la realización de ensayos ChIP en un plazo razonable y con alta reproducibilidad.

Las células T murinas maduras se sometieron a análisis de ChIP para investigar el enriquecimiento de la mono-metilación de la histona de la lisina 4 en la histona 3 (H3K4me1), la trimetilación de la lisina 4 en la histona 3 (H3K4me3) y la acetilación de la lisina 27 sobre Histona 3 (H3K27ac), así como la ocupación de los nucleosomas, como se revela por panH3 ChIP. La calidad de cizallamiento se evaluó mediante análisis en un gel de agarosa al 1,8% ( Figura 2A ) y en un sistema de electroforesis ( Figura 2B ). H3K4me1 y H3K4me3 se usan generalmente para identificar sitios potenciadores y promotores, respectivamente ( Figura 3A ). De hecho, H3K4me3 es prominente pero no exclusivamente enriquecido en los promotores 5 , 8 , 14 . Una característica de los potenciadores activos debe ser altamente enriquecida para H3K4me1 y H3K27ac y mal enriquecida para H3K4me3 (&lt;Mientras que los intensificadores inactivos presentan niveles bajos de H3K4me3 y H3K27ac pero altos niveles de H3K4me1 ( Figura 3A , panel inferior). Como se muestra en la Figura 3B , el gen de la gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa ( Gapdh ) es representativo del análisis de promotores de genes activos ( promotor Gapdh ). De hecho, muestra altos niveles de H3K4me3 y H3K27ac y bajos niveles de H3K4me1. En la Figura 3B , Deltex1 ( Dtx1 ) es representativo de potenciadores inactivos ( Dtx1 potenciador ), ya que está altamente enriquecido para H3K4me1 y mal enriquecido para H3K4me3 y H3K27ac. El desierto génico es representativo de una región que carece de genes codificadores y suele ser demandado como un control negativo de las marcas activas de la cromatina. La observación de que H3K4me1, una marca de potenciador bien aceptada 4 , 5 , </sup&gt; 7 , 14 , 18 , no está enriquecido en Gene desierto sugiere que esta región carece de potenciadores. <img alt="Figura 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55907/55907fig1.jpg" /> Figura 1: Visión general esquemática del protocolo ChIP presentado. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55907/55907fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55907/55907fig2.jpg" /> Figura 2: Control de calidad de corte de la línea de células T de ratón madura. ( A ) Dos partes alícuotas diferentes de la línea de células T de ratón madura E2-10HA se cortaron y aproximadamente 500 ng de ADN purificado se analizaron en un gel de agarosa al 1,8% para evaluar su cizallaCalidad. ( B ) 1 ng de ADN purificado de la muestra 2 se analizó por electroforesis para evaluar su calidad de cizallamiento. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55907/55907fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="figura 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55907/55907fig3.jpg" /> Figura 3: Marcas de cromatina que caracterizan potenciadores y promotores. ( A ) Los potenciadores activos (panel superior) se caracterizan por H3K4me1 alto, H3K4me3 bajo y H3K27ac alto, mientras que los intensificadores inactivos (panel inferior) presentan H3K4me1 alto, H3K4me3 bajo y H3K27ac bajo. ( B ) Las muestras presentadas en la Figura 2A se agruparon y se usaron para el análisis de ChIP frente a las marcas de histonas H3K4me1, H3K4me3 y H3K27ac y la ocupación de las histonas, como se reveló por panH3 ChIP. Este análisis muestra queE promotor del gen doméstico El gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa ( promotor Gapdh ) está altamente enriquecido para H3K4me3 y H3K27ac y poco enriquecido para H3K4me1. Por otra parte, el potenciador del gen inactivo Deltex1 ( potenciador Dtx1 ) está altamente enriquecido para H3K4me1 pero pobremente enriquecido para H3K4me3 y H3K27ac. ChIP utilizando un anticuerpo panH3 se utilizó para investigar la ocupación de nucleosomas. Gene desierto se utilizó como un control negativo. Un experimento representativo es mostrado. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55907/55907fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Nombre del buffer </td><td> Reactivo </td><td> Concentración final </td></tr><tr><td rowspan="5"> Tampón de dilución </td><td> Sodio dodecIlo (SDS) </td><td> 0,01% (p / v) </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> 1,1% (v / v) </td></tr><tr><td> Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) pH 8,0 </td><td> 1,2 mM </td></tr><tr><td> Tris - HCl pH 8,1 </td><td> 16,7 mM </td></tr><tr><td> Cloruro sódico (NaCl) </td><td> 167 mm </td></tr><tr><td rowspan="2"> Solución DMA </td><td> El adipimidato de dimetilo (DMA) </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> Solución salina tamponada con fosfato (PBS) </td><td> 1x </td></tr><tr><td rowspan="3"> Tampón de elución </td><td> El dodecilsulfato sódico (SDS) </td><td> 1% (p / v) </td></tr><tr><td> Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) pH 8,0 </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> Tris - HCl pH 8,0 </td><td> 50 mM </td></tr><tr><td rowspan="5"> Alto tampón de sal </td><td> El dodecilsulfato sódico (SDS) </td><td> 0,1% (p / v) </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> 1% (v / v) </td></tr><tr><td> EtilendiamiÁcido netetraacético (EDTA) pH 8,0 </td><td> 2 mM </td></tr><tr><td> Tris - HCl pH 8,1 </td><td> 20 mM </td></tr><tr><td> Cloruro sódico (NaCl) </td><td> 500 mM </td></tr><tr><td rowspan="6"> Medio IMDM </td><td> El medio de Dulbecco modificado por Iscove (IMDM) </td><td> 1x </td></tr><tr><td> El suero bovino fetal (FBS) </td><td> 2% (v / v) </td></tr><tr><td> Penicilina / Estreptomicina </td><td> 1x </td></tr><tr><td> Peptona primatona </td><td> 0,3 mg / ml </td></tr><tr><td> Solución de insulina humana </td><td> 4,8 mg / ml </td></tr><tr><td> Medio esencial mínimo aminoácidos no esenciales (MEM NEAA) </td><td> 1x </td></tr><tr><td rowspan="4"> Tampón de sal de LiCl </td><td> Cloruro de litio (LiCl) </td><td> 0,25 M </td></tr><tr><td> IGEPAL-CA630 </td><td> 1% (v / v) </td></tr><tr><td> Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) pH 8,0 </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> Tris - HCl pH 8.1 </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td rowspan="5"> Bajo tampón de sal </td><td> El dodecilsulfato sódico (SDS) </td><td> 0,1% (p / v) </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> 1% (v / v) </td></tr><tr><td> Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) pH 8,0 </td><td> 2 mM </td></tr><tr><td> Tris - HCl pH 8,1 </td><td> 20 mM </td></tr><tr><td> Cloruro sódico (NaCl) </td><td> 150 mM </td></tr><tr><td rowspan="5"> Proteína A Sepharose perlas buffer de lavado </td><td> Tris - HCl pH 8,0 </td><td> 20 mM </td></tr><tr><td> Cloruro sódico (NaCl) </td><td> 500 mM </td></tr><tr><td> Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) pH 8,0 </td><td> 2 mM </td></tr><tr><td> El dodecilsulfato sódico (SDS) </td><td> 0,1% (p / v) </td></tr><tr><td> IGEPAL-CA630 </td><td> 1% (v / v) </td></tr><tr><td rowspan="3"> SDS tampón de lisis </td><td> El dodecilsulfato sódico (SDS) </td><td> 1% (p / v) </td></tr><tr><td> EtilenodiÁcido aminotetraacético (EDTA) pH 8,0 </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> Tris - HCl pH 8,1 </td><td> 50 mM </td></tr><tr><td rowspan="2"> Tampón TE </td><td> Tris - HCl pH 8,0 </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) pH 8,0 </td><td> 1 mM </td></tr></tbody></table> Tabla 1: Lista de los tampones y el medio utilizado en este protocolo. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td> EN </td><td> APAGADO </td></tr><tr><td> La punta del Poder </td><td> 150,0 </td><td> 2,5 </td></tr><tr><td> Factor de servicio </td><td> 15,0 </td><td> 15,0 </td></tr><tr><td> Ciclos / explosión </td><td> 500 </td><td> 500 </td></tr><tr><td> Número de ciclos </td><td colspan="2"> 28 </td></tr></tbody></table>Tabla 2: Configuraciones de corte usadas en este protocolo. Estas condiciones se han optimizado para una línea de células T de ratón madura. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Anticuerpo </td><td> Proveedor </td><td> Cantidad de anticuerpo / inmunoprecipitación </td><td> Cantidad de células / inmunoprecipitación </td><td> Condiciones de lavado </td></tr><tr><td> H3 </td><td> Abcam (ab1791) </td><td> 2,5 mg </td><td> 5 x 10 6 </td><td> Una vez en tampón de sal bajo, dos veces en tampón de salina alta, dos veces en tampón de sal de LiCl y tres veces en tampón de TE </td></tr><tr><td> H3K4me1 </td><td> Abcam (ab8895) </td><td> 2,5 mg </td><td> 5 x 10 6 </td><td> Una vez en tampón de sal bajo, dos veces en tampón de salina alta, dos veces en tampón de sal de LiCl y tres veces en tampón de TE </td></tr><tr><td> H3K4me3 </td><td> Diagenode (pAb-003-050) </td><td> 2,5 mg </td><td> 5 x 10 6 </td><td> Una vez en tampón de sal bajo, dos veces en tampón de salina alta, dos veces en tampón de sal de LiCl y tres veces en tampón de TE </td></tr><tr><td> H3K27ac </td><td> Diagenode (pAb-174-050) </td><td> 2,5 mg </td><td> 5 x 10 6 </td><td> Oce en tampón de baja sal, dos veces en tampón de salina alta, dos veces en tampón de sal de LiCl y tres veces en tampón de TE </td></tr><tr><td> IgG </td><td> Diagenode (C15410206) </td><td> Variable* </td><td> Variable* </td><td> Variable* </td></tr><tr><td colspan="5"> * En el caso del control IgG, la cantidad de anticuerpo y células, así como las etapas de lavado, tienen que reflejar las condiciones de las otras inmunoprecipitaciones. </td></tr></tbody></table> Tabla 3: Anticuerpos y condiciones de lavado utilizados en este estudio. <table border="1" fo:keEp-together.within-page = &quot;1&quot; para: keep-with-next.within-page = &quot;siempre&quot;&gt; <tbody><tr><td> Gene </td><td> Primer directo </td><td> Primer inverso </td><td> sonda </td></tr><tr><td> Promotor de Gapdh (0 kb) </td><td> 5&#39;-GGG TTC CTA TAA ATA CGG ACT GC-3 &#39; </td><td> 5&#39;-CTG GCA CTG CAC AAG AAG A-3 &#39; </td><td> 68 </td></tr><tr><td> Dtx1 potenciador (+26 kb) </td><td> 5&#39;-CTC TGG GTT GTA GGG GAC AG-3 &#39; </td><td> 5&#39;-GCA TGG GAA CTG TGT TAC AGA A-3 &#39; </td><td> 27 </td></tr><tr><td> Desierto de genes </td><td> 5&#39;-CAA TGC ATG GGT CCA GAT TT-3 &#39; </td><td> 5&#39;-ATT GGC ACG GAA GTA GTG CT-3 &#39; </td><td> 94 </td></tr></tbody></table> Tabla 4: Primers y sondas utilizadas para qPCR en este estudio. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page = &quot;siempre&quot;&gt; <tbody><tr><td> Problema </td><td> Causas </td><td> Solución </td></tr><tr><td rowspan="3"> La cromatina está bajo cizallamiento y los fragmentos son demasiado grandes. </td><td> Se han utilizado demasiadas celdas. </td><td> Reduzca el número de celdas. </td></tr><tr><td rowspan="2"> El cizallamiento es demasiado bajo. </td><td> Aumentar el número de ciclos de corte. </td></tr><tr><td> Aumentar la potencia de pico de cizallamiento, el factor de servicio y / o los ciclos / ráfaga. </td></tr><tr><td rowspan="3"> La cromatina es excesivamente cortada y los fragmentos son demasiado pequeños. </td><td> Se han utilizado muy pocas células. </td><td> Aumentar el número de celdas. </td></tr><tr><td rowspan="2"> El cizallamiento es demasiado alto. </td><td> Reducir el número de ciclos de corte. </td></tr><tr><td> Reducir la potencia máxima de cizallamiento, el factor de servicio y / o los ciclos / ráfagas. </td></tr><tr><td rowspan="11"> Demasiado baja recuperación sobre IControl gG y / o control negativo (fondo alto). </td><td> No se usó suficiente cromatina para el experimento. </td><td> Aumentar la cantidad de cromatina. </td></tr><tr><td> La cantidad de anticuerpo es demasiado baja. </td><td> Aumentar la cantidad de anticuerpos. </td></tr><tr><td> La cantidad de anticuerpo es demasiado alta. </td><td> Reducir la cantidad de anticuerpos. </td></tr><tr><td> El anticuerpo tiene una especificidad baja. </td><td> Cambiar el anticuerpo. </td></tr><tr><td rowspan="2"> Las condiciones de lavado son demasiado estrictas. </td><td> Reducir el número de lavado. </td></tr><tr><td> Reducir la rigurosidad de los tampones de lavado. </td></tr><tr><td rowspan="2"> Las condiciones de lavado no son lo suficientemente estrictas. </td><td> Aumentar el número de lavado. </td></tr><tr><td> Aumentar la rigurosidad de los tampones de lavado. </td></tr><tr><td> Demasiado ADN se pipeteó en el qPCR. </td><td> Reducir la cantidad de ADN pipeteado en el qPCR. </td></tr><tr><td rowspan="2"> QPCR condiciones no son óptimas. </td><td> Optimice las condiciones qPCR. </td></tr><tr><td> Reducir el número de ciclos. </td></tr><tr><td rowspan="4"> Ningún producto o producto es demasiado bajo en la reacción qPCR de la muestra de entrada. </td><td> No se pipeteó suficiente DNA en el qPCR. </td><td> Aumentar la cantidad de ADN pipeteado en el qPCR. </td></tr><tr><td rowspan="2"> QPCR condiciones no son óptimas. </td><td> Optimice las condiciones qPCR. </td></tr><tr><td> Aumentar el número de ciclos. </td></tr><tr><td> No se usó suficiente cromatina para el experimento. </td><td> Aumentar la cantidad de cromatina. </td></tr><tr><td rowspan="4"> No hay señal en el control positivo y / o panH3 ChIP. </td><td> No se usó suficiente cromatina para el experimento. </td><td> Aumentar la cantidad de cromatina. </td></tr><tr><td> La cantidad de anticuerpo es demasiado baja. </td><td> Aumentar la cantidad de anticuerpos. </td></tr><tr><td> El antiCuerpo tiene baja especificidad. </td><td> Cambiar el anticuerpo. </td></tr><tr><td> La elución es subóptima. </td><td> Asegúrese de agitar frecuentemente las muestras para mantener las perlas en solución. </td></tr></tbody></table> Tabla 5: Solución de problemas.

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Chromatin Immunoprecipitation ChIP in Mouse T-cell Lines

Este trabajo describe un protocolo para la inmunoprecipitación de la cromatina (ChIP) utilizando una línea de células T de ratón madura. Este protocolo es adecuado para investigar la distribución de marcas de histonas específicas en sitios específicos del promotor o en todo el genoma.

Inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) en líneas de células T de ratón

Signaling pathways regulate gene expression programs via the modulation of the chromatin structure at different levels, such as by post-translational ...

chromatin-immunoprecipitation-chip-in-mouse-t-cell-lines

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Genetics

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) in Mouse T-cell Lines

18.2K vistas.  University of Giessen.  Este trabajo describe un protocolo para la inmunoprecipitación de la cromatina (ChIP) utilizando una línea de células T de ratón madura. Este protocolo es adecuado para investigar la distribución de marcas de histonas específicas en sitios específicos del promotor o en todo el genoma. 

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Improved Protocol for Chromatin Immunoprecipitation from Mouse Skeletal Muscle

We describe an efficient and reproducible protocol for the preparation of chromatin from adult mouse skeletal muscle, a physically resistant tissue with a high content of structural proteins. Dissected limb muscles from adult mice are physically disrupted by mechanical homogenisation, or a combination of mincing and douncing, in a hypotonic buffer before formaldehyde fixation of the cell lysate. The fixed nuclei are purified by further cycles of mechanical homogenisation or douncing and sequential filtrations to remove cell debris. The purified nuclei can be sonicated immediately or at a later stage after freezing. The chromatin can be efficiently sonicated and is suitable for chromatin immunoprecipitation experiments, as illustrated by the profiles obtained for transcription factors, RNA polymerase II, and covalent histone modifications. The binding events detected using chromatin prepared by this protocol are predominantly those taking place in the muscle fiber nuclei despite the presence of chromatin from other fiber-associated satellite and endothelial cells. This protocol is therefore adapted to study gene regulation in the adult mouse skeletal muscle.

A novel protocol for the preparation of chromatin from adult mouse skeletal muscle adapted to the study of gene regulation in muscle fibers by chromatin immunoprecipitation is presented.

Protocolo de mejora para la inmunoprecipitación de cromatina de músculo esquelético de ratón

We describe an efficient and reproducible protocol for the preparation of chromatin from adult mouse skeletal muscle, a physically resistant tissue with a ...

Investigación

Bioquímica

Chromatin Immunoprecipitation of Murine Brown Adipose Tissue

Most cellular processes are regulated by transcriptional modulation of specific gene programs. Such modulation is achieved through the combined actions of a wide range of transcription factors (TFs) and cofactors mediating transcriptional activation or repression via changes in chromatin structure. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a useful molecular biology approach for mapping histone modifications and profiling transcription factors/cofactors binding to DNA, thus providing a snapshot of the dynamic nuclear changes occurring during different biological processes.
To study transcriptional regulation in adipose tissue, samples derived from in vitro cell cultures of immortalized or primary cell lines are often favored in ChIP assays because of the abundance of starting material and reduced biological variability. However, these models represent a limited snapshot of the actual chromatin state in living organisms. Thus, there is a critical need for optimized protocols to perform ChIP on adipose tissue samples derived from animal models.
Here we describe a protocol for efficient ChIP-seq of both histone modifications and non-histone proteins in brown adipose tissue (BAT) isolated from a mouse. The protocol is optimized for investigating genome-wide localization of proteins of interest and epigenetic markers in the BAT, which is a morphologically and physiologically distinct tissue amongst fat depots.

Here we describe a protocol for efficient chromatin immunoprecipitation (ChIP) followed by high-throughput DNA sequencing (ChIP-seq) of brown adipose tissue (BAT) isolated from a mouse. This protocol is suitable for both mapping histone modifications and investigating genome-wide localization of non-histone proteins of interest in vivo.

Inmunoprecipitación de cromatina del tejido adiposo marrón murino

Most cellular processes are regulated by transcriptional modulation of specific gene programs. Such modulation is achieved through the combined actions of ...

Genética

Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are characterized by two fundamental properties: self-renewal and multipotency that allows a stem cell to differentiate into virtually any cell type 1. The progression stem cell to differentiated cell is characterized by loss of multipotency, structural and morphological changes and the hierarchic activity of transcription factors and signaling molecules, whose activities establish and maintain cell-type specific gene expression patterns. At the molecular level, cell differentiation involves dynamic changes of the structure and composition of chromatin and the detection of those dynamic changes can provide valuable insights into the functional features of stem cells and the cell differentiation process 2,3. Chromatin is a highly compacted DNA-protein complex that forms when cells package chromosomal DNA with proteins, mainly histones 4. Stemcellness and cell differentiation has been correlated with the presence of specific arrays of regulatory proteins such as epigenetic factors, histone variants, and transcription factors 2,3,5.
 Chromatin immunoprecipitation (ChIP) provides a valuable method to monitor the presence of RNA, proteins, and protein modifications in chromatin 6,7. The comparison of chromatin from different cell types can elucidate dynamic changes in protein-chromatin associations that occur during cell differentiation.
Chromatin immunoprecipitation involves the purification of in vivo cross-linked chromatin. The isolated chromatin is reduced to smaller fragments by enzymatic digestion or mechanical force. Chromatin fragments are precipitated using specific antibodies to target proteins or protein and DNA modifications. The precipitated DNA or RNA is purified and used as a template for PCR or DNA microarray based assays. Prerequisites for a successful ChIP are high quality antibodies to the desired antigen and the availability of chromatin from control cells that do not express the target molecule. ChIP can correlate the presence of proteins, protein and RNA modifications, and RNA with specific target DNA, and depending on the choice of outread tool, detects the association of target molecules at specific target genes or in the context of an entire genome. The comparison of the distribution of proteins in the chromatin of differentiating cells can elucidate the dynamic changes of chromatin composition that coincide with the progression of cells along a cell lineage.

The differentiation of ESC coincides with cell-type specific changes in the structure and composition of chromatin. The detection of those changes provides valuable insights into the mechanisms that define stemcellness and cell differentiation. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) represents a valuable method to dissect the molecular mechanisms underlying stem cell differentiation.

Inmunoprecipitación de la cromatina de células estaminales embrionarias humanas

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are ...

Biología

Chromatin Immunoprecipitation Assay Using Micrococcal Nucleases in Mammalian Cells

To express cellular phenotypes in organisms, living cells execute gene expression accordingly, and transcriptional programs play a central role in gene expression. The cellular transcriptional machinery and its chromatin modification proteins coordinate to regulate transcription. To analyze transcriptional regulation at the molecular level, several experimental methods such as electrophoretic mobility shift, transient reporter and chromatin immunoprecipitation (ChIP) assays are available. We describe a modified ChIP assay in detail in this article because of its advantages in directly showing histone modifications and the interactions between proteins and DNA in cells. One of the key steps in a successful ChIP assay is chromatin shearing. Although sonication is commonly used for shearing chromatin, it is difficult to identify reproducible conditions. Instead of shearing chromatin by sonication, we utilized enzymatic digestion with micrococcal nuclease (MNase) to obtain more reproducible results. In this article, we provide a straightforward ChIP assay protocol using MNase.

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool for understanding the molecular mechanisms of gene regulation. However, the method involves difficulties in obtaining reproducible chromatin fragmentation by mechanical shearing. Here, we provide an improved protocol for a ChIP assay using enzymatic digestion.

Ensayo de inmunoprecipitación de cromatina utilizando nucleasas microcócticas en células de mamíferos

To express cellular phenotypes in organisms, living cells execute gene expression accordingly, and transcriptional programs play a central role in gene ...

High-Resolution Mapping of Protein-DNA Interactions in Mouse Stem Cell-Derived Neurons using Chromatin Immunoprecipitation-Exonuclease (ChIP-Exo)

Identification of specific protein-DNA interactions on the genome is important for understanding gene regulation. Chromatin immunoprecipitation coupled with high-throughput sequencing (ChIP-seq) is widely used to identify genome-wide binding locations of DNA-binding proteins. However, the ChIP-seq method is limited by its heterogeneity in length of sonicated DNA fragments and non-specific background DNA, resulting in low mapping resolution and uncertainty in DNA-binding sites. To overcome these limitations, the combination of ChIP with exonuclease digestion (ChIP-exo) utilizes 5&#8217; to 3&#8217; exonuclease digestion to trim the heterogeneously sized immunoprecipitated DNA to the protein-DNA crosslinking site. Exonuclease treatment also eliminates non-specific background DNA. The library-prepared and exonuclease-digested DNA can be sent for high-throughput sequencing. The ChIP-exo method allows for near base-pair mapping resolution with greater detection sensitivity and reduced background signal. An optimized ChIP-exo protocol for mammalian cells and next-generation sequencing is described below.

High-Resolution Mapping of Protein-DNA Interactions in Mouse Stem Cell-Derived Neurons using Chromatin Immunoprecipitation-Exonuclease ChIP-Exo

Precise determination of protein-binding locations across the genome is important for understanding gene regulation. Here we describe a&#160;genomic mapping method that treats chromatin-immunoprecipitated DNA with exonuclease digestion (ChIP-exo) followed by high-throughput sequencing. This method detects protein-DNA interactions with near base-pair mapping resolution and high signal-to-noise ratio in mammalian neurons.

Mapeo de alta resolución de interacciones proteína-ADN en neuronas derivadas de células madre del ratón utilizando inmunoprecipitación de cromatina-exonucleasa (ChIP-Exo)

Identification of specific protein-DNA interactions on the genome is important for understanding gene regulation. Chromatin immunoprecipitation coupled ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for Tissue-specific Genes using Early-stage Mouse Embryos

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This technique has been widely exploited in tissue culture cells, and to a lesser extent, in primary tissue. The application of ChIP to rodent embryonic tissue, especially at early times of development, is complicated by the limited amount of tissue and the heterogeneity of cell and tissue types in the embryo. Here we present a method to perform ChIP using a dissociated embryonic day 8.5 (E8.5) embryo. Sheared chromatin from a single E8.5 embryo can be divided into up to five aliquots, which allows the investigator sufficient material for controls and for investigation of specific protein:chromatin interactions.
We have utilized this technique to begin to document protein:chromatin interactions during the specification of tissue-specific gene expression programs. The heterogeneity of cell types in an embryo necessarily restricts the application of this technique because the result is the detection of protein:chromatin interactions without distinguishing whether the interactions occur in all, a subset of, or a single cell type(s). However, examination of tissue-specific genes during or following the onset of tissue-specific gene expression is feasible for two reasons. First, immunoprecipitation of tissue specific factors necessarily isolates chromatin from the cell type where the factor is expressed. Second, immunoprecipitation of coactivators and histones containing post-translational modifications that are associated with gene activation should only be found at genes and gene regulatory sequences in the cell type where the gene is being or has been activated. The technique should be applicable to the study of most tissue-specific gene activation events.
In the example described below, we utilized E8.5 and E9.5 mouse embryos to examine factor binding at a skeletal muscle specific gene promoter. Somites, which are the precursor tissues from which the skeletal muscles of the trunk and limbs will form, are present at E8.5-9.54,5. Myogenin is a regulatory factor required for skeletal muscle differentiation 6-9. The data demonstrate that myogenin is associated with its own promoter in E8.5 and E9.5 embryos. Because myogenin is only expressed in somites at this stage of development 6,10, the data indicate that myogenin interactions with its own promoter have already occurred in skeletal muscle precursor cells in E8.5 embryos.

We demonstrate a chromatin immunoprecipitation (ChIP) method to identify factor interactions at tissue-specific genes during or after the onset of tissue-specific gene expression in mouse embryonic tissue. This protocol should be widely applicable for the study of tissue-specific gene activation as it occurs during normal embryonic development.

Ensayo de inmunoprecipitación de la cromatina de los genes específicos de tejido utilizando etapa temprana de embriones de ratón

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This ...

Efficient Chromatin Immunoprecipitation using Limiting Amounts of Biomass

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used method for determining the interactions of different proteins with DNA in chromatin of living cells. Examples include sequence-specific DNA binding transcription factors, histones and their different modification states, enzymes such as RNA polymerases and ancillary factors, and DNA repair components. Despite its ubiquity, there is a lack of up-to-date, detailed methodologies for both bench preparation of material and for accurate analysis allowing quantitative metrics of interaction. Due to this lack of information, and also because, like any immunoprecipitation, conditions must be re-optimized for new sets of experimental conditions, the ChIP assay is susceptible to inaccurate or poorly quantitative results.
Our protocol is ultimately derived from seminal work on transcription factor:DNA interactions1,2 , but incorporates a number of improvements to sensitivity and reproducibility for difficult-to-obtain cell types. The protocol has been used successfully3,4 , both using qPCR to quantify DNA enrichment, or using a semi-quantitative variant of the below protocol.
This quantitative analysis of PCR-amplified material is performed computationally, and represents a limiting factor in the assay. Important controls and other considerations include the use of an isotype-matched antibody, as well as evaluation of a control region of genomic DNA, such as an intergenic region predicted not to be bound by the protein under study (or anticipated not to show changes under the experimental conditions). In addition, a standard curve of input material for every ChIP sample is used to derive absolute levels of enrichment in the experimental material. Use of standard curves helps to take into account differences between primer sets, regardless of how carefully they are designed, and also efficiency differences throughout the range of template concentrations for a single primer set. Our protocol is different from others that are available5-8 in that we extensively cover the later, analysis phase.

We describe a robust method for chromatin immunoprecipitation using primary T cells. The method is founded on standard approaches, but uses a specific set of conditions and reagents that improve efficiency for limited a quantities of cells. Importantly, a detailed description of the data analysis phase is presented.

Immunoprecipitation cromatina eficiente utilizando limitación de las cantidades de biomasa

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a  widely-used method for determining the interactions of different proteins with  DNA in chromatin of living ...

TChIP-Seq: Cell-Type-Specific Epigenome Profiling

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological functions have been extensively studied. Indeed, the advent of next-generation deep sequencing and chromatin immunoprecipitation (ChIP) via specific histone modification antibodies has revolutionized our view of epigenetic regulation across the genome. Conversely, tissues typically consist of diverse cell types, and their complex mixture poses analytic challenges to investigating the epigenome in a particular cell type. To address the cell type-specific chromatin state in a genome-wide manner, we recently developed tandem chromatin immunoprecipitation sequencing (tChIP-Seq), which is based on the selective purification of chromatin by tagged core histone proteins from cell types of interest, followed by ChIP-Seq. The goal of this protocol is the introduction of best practices of tChIP-Seq. This technique provides a versatile tool for tissue-specific epigenome investigation in diverse histone modifications and model organisms.

We describe a step-by-step protocol for tandem chromatin immunoprecipitation sequencing (tChIP-Seq) that enables the analysis of cell-type-specific genome-wide histone modification.

TChIP-Seq: Perfiles de celular-tipo-específico epigenoma

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological ...

Chromatin Extraction from Frozen Chimeric Liver Tissue for Chromatin Immunoprecipitation Analysis

Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation (X-ChIP) is a widely used technique to assess levels of histone marks and occupancy of transcription factors on host and/or pathogen chromatin. Chromatin preparation from tissues creates additional challenges that need to be overcome to obtain reproducible and reliable protocols comparable to those used for cell culture. Tissue disruption and fixation are critical steps to achieve efficient shearing of chromatin. Coexistence of different cell types and clusters may also require different shearing times to reach optimal fragment size and hinders shearing reproducibility. The purpose of this method is to achieve reliable and reproducible host chromatin preparations from frozen tissue (liver) suitable for both ChIP-qPCR and next generation sequencing (NGS) applications. We observed that the combination of liquid nitrogen tissue pulverization followed by homogenization leads to increased reproducibility compared to homogenization only, since it provides a suspension consisting mostly of dissociated single cells that can be efficiently sheared. Moreover, the fixation step should be performed under mild rotation to provide homogeneous crosslinking. The fixed material is then suitable for buffer-based nuclei isolation, to reduce contamination of cytoplasmic protein and pathogen DNAs and RNAs (when applicable), avoiding time-consuming centrifugation gradients. Subsequent sonication will complete nuclear lysis and shear the chromatin, producing a specific size range according to the chosen shearing conditions. The size range should fall between 100 and 300 nt for NGS applications, while it could be higher (300-700 nt) for ChIP-qPCR analysis. Such protocol adaptations can greatly improve chromatin analyses from frozen tissue specimens.

This protocol focuses on chromatin preparation from snap frozen tissues and it is suitable for Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation (X-ChIP) followed by either quantitative PCR analysis (X-ChIP-qPCR) or next generation sequencing approaches (X-ChIP-seq).

Extracción de cromatina del tejido hepático quimérico congelado para el análisis de inmunoprecipitación de la cromatina

Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation (X-ChIP) is a widely used technique to assess levels of histone marks and occupancy of transcription factors on ...

Chromatin Immunoprecipitation

Histones are proteins that help organize DNA in eukaryotic nuclei by serving as &#8220;scaffolds&#8221; around which DNA can be wrapped, forming a complex called &#8220;chromatin&#8221;. These proteins can be modified through the addition of chemical groups, and these changes affect gene expression. Researchers use a technique called chromatin immunoprecipitation (ChIP) to better understand which DNA regions associate with specific histone modifications or other gene regulatory proteins. Antibodies are used to isolate the protein of interest, and the bound DNA is extracted for analysis. Here, JoVE presents the principles behind ChIP, discussing specific histone modifications and their relationship to gene expression and DNA organization. We then review how to perform a ChIP protocol, and explore the ways scientists are currently using this technique.

Inmunoprecipitación de cromatina

Histones are proteins that help organize DNA in eukaryotic nuclei by serving as &#8220;scaffolds&#8221; around which DNA can be wrapped, forming a complex ...