This work was supported by startup funds from The University of Tennessee and TN-SCORE, a multi-disciplinary research program sponsored by NSF-EPSCoR (EPS-1004083).

サンプルの調製<ol><li> 8世代のために32℃でYE液体培地で24スピンドルポール本体マーカーSAD1-mCherryを23とII型ミオシン調節軽鎖RLC1-トマトを発現している分裂酵母細胞を成長させます。 注：温度感受性変異体について、25℃で細胞を増殖させます。 YEで0.5のOD 600に対数期中期に細胞を増殖させます。分裂酵母の成長条件の詳細については分裂酵母の研究室マニュアル25を参照してください。 </li><li> 0.6％アガロースでYE（または最小限の）メディアを準備します（アガロースベースのメディアは、寒天に比べて少ない蛍光バックグラウンドを示します）。溶融した培地に、アスコルビン酸（ビタミンC）、1mMのを加えます。ビタミンCは、このように、光毒性を最小限に抑え、光退色に起因して放出されるフリーラジカルをクエンチします。 </li><li> Cは、ガラス底培養皿上に溶融メディアを混入ビタミン4mLの - 3を注ぎます。メディアを冷却しようと固めます。 注記：培養皿中のガラスの厚さは、顕微鏡に適したカバースリップの厚さに依存します。ここで、カバースリップ号1.5を使用します。 </li><li>静かに鋭いメスの助けを借りて、培養皿から固化メディアを上げます。メディアスラブとディッシュ（ 図1）に戻って落下からスラブを防止するために、培養皿の間にピペットチップを置きます。 </li><li>上記1.1で説明したように新鮮に増殖する細胞の1ミリリットルを取ります。 30秒間300×gで細胞を穏やかにスピン。上清を捨てます。上清を廃棄した後、チューブ内に残っている残留メディア少量の細胞を再懸濁。 </li><li>ロード2 - メディアスラブと培養皿のガラス底部との間の再懸濁細胞培養の5μL。細胞をガラスにする必要があります。メディアと皿の間に配置されたピペットチップは、細胞培養の簡単な取り付けを可能にします。 </li><li>非常に静かにピペットチップを取り外し、背面のcuの元の位置でメディアスラブを配置lture一品。気泡を避けるようにしてください。必要であれば軽くメディアスラブの上にピペットチップの背面をスライドさせることにより気泡を押し出します。 </li><li>細胞が顕微鏡検査が実行される温度で暗所で1時間に30分間培養皿に座ってみましょう。これは、細胞の増殖条件の変化に起因する任意の衝撃を防止することが重要です。 </li></ol> 2.画像​​取得<ol><li>培養皿上のガラスの外側に油を一滴を置きます。倒立顕微鏡上で培養皿を置きます。 </li><li> （ - 535 nmの520）YEメディアの自家蛍光を最小限に抑えるために狭い波長範囲でGFPフィルターを使用します。 </li><li>細胞の内側面に焦点を当て、彼らはあまりにも混雑十分に離間とされていないことを確認。細胞周期の適当な段階で細胞の画像取得を開始することを確認します。この実験では、後期G2からの細胞に従ってください。 </li><li> 画像取得ソフトウェアTをプログラムO GFP、RFPおよび細胞のDIC画像を取ります。 <ol><li>この実験では、GFPおよびRFPフィルター用DICと75ミリ秒の露光時間を100ミリ秒の露光時間を使用します。露光時間は、顕微鏡、研究対象のタンパク質および実験期間の設定に依存します。指定された顕微鏡の設定については、50％のレーザー出力を使用しています。 </li><li> 3次元、Zスケールイメージングのためのプログラム、画像取得ソフトウェアで画像をキャプチャします。 0.4μmのステップサイズとセルの中央のフォーカスポイントの周囲3.0ミクロン（合計Zの半分）の距離を使用してください。これは、6ミクロンの合計Z距離と時間点あたり16 Z-フレームのキャプチャにつながります。 注：Zシリーズの画像取得は、紡錘体極体の取り込みを可能にします。 </li></ol></li><li>画像ごとに2分してください。実験の要件に応じて露光時間を変更します。露光時間はまた、目的と信号強度のタンパク質に応じて変更することができます。しかし、その短い点に注意してくださいえー間隔または漂白のために長い露光時間の増加、光毒性、したがって細胞は短時間しか続けることができます。 </li><li> DIC画像によって観察されるように、物理的に別々のセルまでの画像を取得、または90分後に取得を停止するためのソフトウェアをプログラムします。 </li></ol> 3.画像解析<ol><li> 細胞質分裂のイベントの時間的解析 <ol><li>画像取得ソフトウェアを使用して、各時点のためのZ-フレームの予測を行います。取得した画像の波長毎に異なるファイルを作成します。 </li><li>この投影時点シリーズは.TIFFファイルとしてエクスポートします。 </li><li> ImageJソフトウェアを使用して画像を分析します。波長のいずれかのための画像シリーズを開きます。 </li><li>研究対象のセルを選択します。ツールバーのラインオプションをダブルクリックします。これは、線の幅を調整する別のウィンドウを開きます。セルの幅に対応して線幅を調整します。 50ピクセル - WT細胞では、これは約40です。沿って線を引きます目的の細胞の長軸。 </li><li>分析&gt;ツール&gt; ROIマネージャをクリックし、[追加]をクリックします。これは後で使用するためにROIウィンドウに選択した行を追加します。このウィンドウを閉じないでください。 </li><li>まっすぐ&gt;興味の画像をクリックして、[編集]&gt; [選択]を選択します。これは、別のウィンドウが開きます。 「プロセススタック全体」を確認してください。これは、水平方向にセルをまっすぐにします。 </li><li>画像をクリックしてください&gt;&gt;トランスフォーム90度右回転させます。この画像は、現在縦にまっすぐにされています。 </li><li>画像をクリックしてください&gt;スタック&gt;はモンタージュを作成します。これは、スタックの行と列の数、モンタージュやモンタージュのためのフレーム増分用の画像サイズ、最初と最後のスライス（フレーム）のためのスケールファクタを割り当てるためのウィンドウを開きます。ラベルのスライスを確認し、エンターキーを押します。 </li><li>目的の細胞のモンタージュを持つウィンドウが表示されているように、他の波長のための画像シリーズを開きます。 </li><li> ROIマネージャの回線識別子をクリックします。これが選択されます第二の画像ファイル上の同じセル。 3.1.8 - を繰り返して、3.1.6を繰り返します。これは、第2の画像のモンタージュを開きます。 </li><li>紡錘体極本体マーカーSAD1-mCherryを持つ画像に、紡錘体極体マーカーの分離の発症を探し、時間0としてその時点をマーク。 </li><li>時間をかけて画像上RLC1-トマト信号に従い、RLC1-トマトのパッチとは対照的に明確な線として現れる信号を探します。この時点ではアクトミオシンリングアセンブリ/成熟段階の開始の完了をマークします。 </li><li> RLC1-トマトリングのサイズが減少し始める時に次を決定するために時間をかけて映画をスクロールします。これは、リングくびれの成熟期/発症の最後としてマークされています。 </li><li>それは、セル軸の中央にドットとして表示されるまで、くびれを通して時間をかけてRLC1-トマト信号に従ってください。これは、セプタム侵入のリングくびれ/最後の最後としてマークされています。 </li><li> DIC画像のモンタージュに続いて、最後のセルを決定分離。セルが物理的に分離した時点を記録します。 </li><li>紡錘体極体の分離のためのImageJでラインツールを使用して、時間をかけて2紡錘体極体間の距離を測定します。時間をかけて紡錘体極体内の距離をプロットします。 </li><li>各細胞質分裂の相の期間を計算し、時間をかけて紡錘体極体の分離と比較するための別の細胞質分裂のイベントに対して異なる時点を記録します。 </li></ol></li><li> 細胞質分裂のイベントの空間分析 <ol><li>可視アクトミオシンリングを有するセルを選択します。 ImageJのツールバーのラインオプションをダブルクリックします。これは、線の幅を調整する別のウィンドウを開きます。 （ - 20ピクセル15）リングの厚さに対応して線幅を調整します。リングの全体の厚さが含まれていることを確認するために世話をしてリングに沿って線を引きます。 </li><li>分析&gt;ツール&gt; ROIマネージャをクリックし、[追加]をクリックします。これは後で使用するためにROIウィンドウに選択した行を追加します。このウィンドウを閉じないでください。 </li><li>まっすぐ&gt;興味の画像をクリックして、[編集]&gt; [選択]を選択します。これは、別のウィンドウが開きます。 「プロセススタック全体」を確認してください。これは、水平方向にリングをまっすぐにします。 </li><li>リセット&gt;&gt;明るさ/コントラストを調整&gt;画像を使用して（3.1.6から）まっすぐにzスタックに明るい面の強度をリセットします。 </li><li>タブ•コンテキスト&gt; 3Dプロジェクトをクリックします。これは、ダイアログボックスを開きます。ブライポイントへの投影法とスライス間隔は2または3ピクセルに変更します。最後に、XまたはY軸に回転の変化軸（これは所望の視野角に応じて変化します）、補間クリックして、画像の3D投影を生成するために、[OK]をクリックします。画像を回転する画像の下のスクロールバーを使用します。 </li><li> ImageJのを使用して他の波長のための画像シリーズを開きます。 </li><li> ROIマネージャの回線識別子をクリックします。これは、第2の画像ファイルに同じリングを選択します。繰り返しは、4.2.4と4.2.5を繰り返します。これは、他の波長の画像に3次元のリングを開きます。 </li><li>オープン両方の3D画像リングで、チャンネルをマージ&gt;色&gt;画像をクリックしてください。これは、ボックスを開きます。希望する対応する色のドロップダウンメニューから各画像を選択し、[OK]をクリックします。これは、異なる波長で画像の両方の複合体を開きます。 </li><li>細胞質分裂のリングまたは着信する膜に局在に関して異なるマーカーの局在を比較します。 RLC1-GFPは細胞質分裂のリングのためのマーカーです。 RLC1-GFPシグナルの後ろにローカライズするタンパク質が着信する膜に局在しながらタンパク質RLC1-GFPとの共局在化し、リングに局在します。 注：目的のタンパク質は、リングマーカとは異なるフルオロフォアであることが必要です。 </li><li>すべての細胞質分裂を介してタンパク質の空間的局在を比較するために、細胞質分裂のさまざまな段階で3次元のリングを生成します。 </li></ol></li><li> タンパク質distriの分析細胞質分裂のリングで献<ol><li>リングは、タンパク質分布の分散の共効率を測定沿って比較し、タンパク質の分布を分析します。高い共同効率的な分散のは分裂部位に沿ってタンパク質の偏在を示し、撮像されたか分析する段階に応じて、不適切なリングアセンブリ、成熟または隔膜形成を示唆しています。 </li><li> （3.2.2）から3次元再構成細胞質分裂のリングを使用して、リングの四半期は、各象限に現れるように、少なくとも4象限に画像を分割します。このために、画像上の垂直線を描画するラインツールを使用します。各ラインの画像をクリックした後&gt;オーバーレイ&gt;選択を追加するか、ショートカットのCtrl + Bを使用します。 </li><li> &gt;セットの測定を分析するために移動します。開くボックスに平均グレー値を選択します。 [OK]をクリックします。 </li><li>ガイドは、長方形ツールを使用して、各象限を定義する矩形を描くように上方に描かれた線を使用。 </li><li>各象限の平均強度を測定するために、クリック上の分析&gt;ショートカットはCtrl + Mを測定し、または使用しています。 </li><li>すべての4つの象限（MG 1 -MG 4）についての平均グレー値を記録します。 </li><li>背景の選択として、リング外の各象限の小さな領域を選択します。 </li><li>すべての4つの象限（BG 1 -BG 4）の背景を選択するための平均グレー値を測定します。 </li><li>各象限（IRQ）中=リングの強度：定式MG 1・平均（BG 4 BG 1）以下の各象限使用するためのバックグラウンド減算についてはLI&gt;。この段階では4 IRQ値、各象限のための1つがあります。 </li><li> /平均（IRQ 1：IRQ 4）：次に、以下の式-標準偏差（IRQ 4 IRQ 1）を使用して、各リングのための変動係数を計算します。各菌株のための分散の共同効率的な平均を計算し、他の株と比較します。 注：歪みの分散の共同効率的で統計的に有意な増加は、indは対照と比較して細胞質分裂の段階での分裂部位に沿って不均一なタンパク質分布/配信をicates。 </li></ol></li></ol>

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著者には、競合する金融利益を宣言しません。

ここでは、一時的な方法で、分裂酵母における細胞質分裂のイベントを研究するためのプロトコルを記述しています。ここで説明するプロトコルは、互いを基準とした異なる細胞質分裂のイベントの時間分解能を提供します。細胞質分裂の位相を基準としたタンパク質の動員または損失のタイミング。細胞質分裂の異なる段階を通じてリングの構造;有糸分裂を参照して、細胞質分裂の進行。...

細胞質分裂、細胞分裂の最後のステップは、適切な分化、開発、および生物の生存に不可欠複雑なプロセスです。細胞質分裂は、ゲノムの完全性1を維持しながら、成功した細胞分離を確実にするために編成されている複数のイベントが含まれます。細胞質分裂は、一旦組み立てアクトミオシンリングは、最終的に細胞器官脱離1、2、3、続いて膜の拡大とfurrowing、および細胞外細胞マトリックスリモデリング、と同時であるくびれを受けるイベントを伴います。細胞質分裂のイベントの不適切な組織は、細胞分離および倍数性の欠陥につながることができ、そして癌4、5、6、7、8のような疾患を引き起こす可能性があります。 Oを有効にする基本原則細胞質分裂のイベントのrganizationがよく、したがって、これらの疾患の病因の我々の理解に障害物につながる、理解されていません。 分裂酵母シゾサッカロミセス・ポンベ （S.ポンベ）が原因で1関与するタンパク質の保存された性質のために細胞質分裂を研究するための優れたモデルシステムです。分裂酵母では、リングアセンブリをアクトミオシンた後、リングは、9を収縮しない成熟/ドウェル段階に入ります。成熟は、膜furrowingとセプタム侵入と同時にアクトミオシンリング収縮の開始に終了します。年間の独創的な研究は、分裂酵母1、9、10に私たちのアクトミオシンリングアセンブリのかなり良い理解を与えています。分裂酵母を含むいくつかの真核生物では、アクトミオシンリングの成功のアセンブリは、膜furrowingのために十分ではありません。 Fでission酵母、単独のリング収縮は、溝形成の11のための内部膨圧を克服するのに十分な力を提供していません。最近のモデルは、この力は、代わりに隔壁侵入11によって提供されることを示しています。別のモデルでは、原形質膜の延長の役割が形成12,13の畝間に寄与することが示唆されています。リング狭窄および膜furrowingはBgs1 / CPS1の温度感受性変異体cps1-191、一次中隔形成14、15の主要な酵素では発生しません。 Bgs1を欠く細胞は、欠陥の一次中隔と延長リングくびれ15、16を示しています 。 Bgs1は、リング組立体17,18のアクトミオシン後成熟の間に隔壁進入のための細胞分裂部位に補充されます。 Similarlyは、 ショウジョウバエの胚における細胞化の際に、リング収縮は、分裂酵母で観察された成熟期に似た、かなり遅い初期収縮率19二相性です。二相性リング収縮は、十分な膜膨張20と細胞外マトリックスの修正を可能にするために、膜furrowingが遅くなる場合があります。このリングアセンブリアクトミオシン後、リング狭窄は、細胞は、溝形成のための要件を満たした効率的にのみ発生することを示唆しています。これは、アクトミオシンリングリング組立後の収縮、また、このプロセスを制御する分子事象のために必要とされるどのような条件のよく理解されていません。我々は最近、アクトミオシンリングアセンブリ以下の低分子量GTPaseのCdc42はユニークな時空間活動パターン21を受けることが示されています。このパターンは、（Cdc42のグアニジンヌクレオチド交換因子の独特の局在パターンによって確立されますCdc42のを活性化させるのGEF）。 GEF Gef1は、組み立てられたアクトミオシンリングに局在し、SCD1がfurrowing膜に局在化し、通常の隔壁形成を促進しながら、リングのくびれとセプタム侵入の発症を促進します。私たちは、そのGEFにによって確立されたCdc42の活性化パターンは明確な細胞質分裂のイベントの規制につながることがわかります。 最終的にはアクトミオシンリングアセンブリ以下の細胞分離につながる事象の分子機構を理解するためには、時間と空間の明確な細胞質分裂のイベントに従ってくださいする必要があります。分裂酵母では、細胞質分裂は、まず最終的には、II型ミオシン、formin Cdc12、およびアクトミオシンリングアセンブリのために必要な他のタンパク質を動員する、核の周りの前駆体ノードの組み立てを伴います。時間に明確な細胞質分裂のイベントや参照のフレームを提供し、紡錘体極体マーカー（紡錘体形成）の分離は、時間0 22として考えられています。目の組立電子のアクトミオシンリングは、時間の経過とともに蛍光II型ミオシン調節軽鎖RLC1としてアクトミオシンリングタンパク質をタグ付けの強度をモニターすることによって追跡することができます。ここでは、時間をかけて細胞質分裂のさまざまな段階を分析するために微細なアプローチについて説明します。

<table><tbody><tr><td>Yeast extract media</td><td>Sunrise Science Products</td><td>YES 225</td><td>0.5% w/v yeast extract, 3% w/v glucose, 225mg/L adenine, histidine, leucine, uracil, and lysine</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>SeaKem LE agarose, Lonza</td><td>50001</td><td></td></tr><tr><td>Ascorbic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4544</td><td></td></tr><tr><td>Glass Bottomed culture dish</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td>Coverslip No. 1.5 was used. This will vary as per the microscope specifications used.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>VT-Hawk 2D array laser scanning confocal microscopy system</td><td>Visitech International, UK</td><td></td><td>with an Olympus IX-83 inverted microscope with a 100X / numerical aperture 1.49 UAPO lens (Olympus) and EM-CCD digital camera (Hamamatsu).&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td>Image analysis software</td></tr></tbody></table>

spatiotemporal analysis of cytokinetic events in fission yeast

細胞質分裂、細胞分裂の最後のステップは、ゲノムの完全性を維持するために重要です。適切な細胞質分裂は、細胞分化と発展のために重要です。細胞質分裂がよく、時間と空間にコーディネートされた一連のイベントを伴います。細胞質分裂は、リング収縮、膜の溝の形成と細胞外マトリックスリモデリングに続く分割サイトでのアクトミオシン環の形成を伴います。分裂酵母、 シゾサッカロミセス・ポンベ （S.ポンベ）は 、実質的な明快さと細胞質分裂の最初のイベントを明らかにした十分に研究モデルシステムです。しかし、我々は、細胞質分裂のイベントが時空間的に調整されている方法の異なる明確に理解していません。これを決定するためには、両方の時間と空間で素晴らしい詳細で異なる細胞質分裂のイベントを分析する必要があります。ここでは、異なる細胞質分裂のEVを調べるために顕微鏡のアプローチを説明します生きた細胞内でエント。このアプローチでは、異なる細胞質分裂のイベントの時間および細胞質分裂中に異なるタンパク質の動員の時間を決定することが可能です。また、我々は、細胞分裂の部位でのタンパク質の局在化、および分布を比較するためのプロトコルを説明します。これは、分裂酵母において細胞質分裂を研究するための基本的なプロトコルであり、また、他の酵母および真菌システムのために使用することができます。

リングマーカーを発現する分裂酵母細胞は、RLC1-GFP（緑色、 図2）および紡錘体極本体マーカーSAD1-mCherryを（赤、 図2）は、細胞質分裂の際に画像化しました。紡錘体極体マーカーの発現（白矢印、 図2A、Bを図）は時刻0 RLC1-GFPシグナルとして考えられている時に表示されます-4極体の分離スピンドルを基準とした分（赤い矢印は、...

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Spatiotemporal Analysis of Cytokinetic Events in Fission Yeast

分裂酵母は、 分裂酵母は、細胞質分裂を研究するための優れたモデル系、細胞分裂の最終段階です。ここでは、ライブ分裂酵母細胞内の異なる細胞質分裂のイベントを分析するために、顕微鏡のアプローチを説明します。

分裂酵母における細胞質分裂のイベントの時空間解析

Cytokinesis, the final step in cell division is critical for maintaining genome integrity. Proper cytokinesis is important for cell differentiation and ...

spatiotemporal-analysis-of-cytokinetic-events-in-fission-yeast

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

7.3K ビュー.  University of Tennessee. 分裂酵母は、 分裂酵母は、細胞質分裂を研究するための優れたモデル系、細胞分裂の最終段階です。ここでは、ライブ分裂酵母細胞内の異なる細胞質分裂のイベントを分析するために、顕微鏡のアプローチを説明します。 

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Measuring Replicative Life Span in the Budding Yeast

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has been used extensively to study the biology of aging, and several determinants of yeast longevity have been shown to be conserved in multicellular eukaryotes, including worms, flies, and mice 1. Due to the lack of easily quantified age-associated phenotypes, aging in yeast has been assayed almost exclusively by measuring the life span of cells in different contexts, with two different life span paradigms in common usage 2. Chronological life span refers to the length of time that a mother cell can survive in a non-dividing, quiescence-like state, and is proposed to serve as a model for aging of post-mitotic cells in multicellular eukaryotes. Replicative life span, in contrast, refers the number of daughter cells produced by a mother cell prior to senescence, and is thought to provide a model of aging in mitotically active cells. Here we present a generalized protocol for measuring the replicative life span of budding yeast mother cells. The goal of the replicative life span assay is to determine how many times each mother cell buds. The mother and daughter cells can be easily differentiated by an experienced researcher using a standard light microscope (total magnification 160X), such as the Zeiss Axioscope 40 or another comparable model. Physical separation of daughter cells from mother cells is achieved using a manual micromanipulator equipped with a fiber-optic needle. Typical laboratory yeast strains produce 20-30 daughter cells per mother and one life span experiment requires 2-3 weeks.

In this article we present a general protocol for measuring the replicative life span of yeast mother cells.

出芽酵母の複製寿命の測定

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding ...

生物学

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using fluorochromes like Green Fluorescent Protein (GFP) directly attached to the protein of interest has become increasingly popular 1. Using GFP and similar fluorochromes the subcellular localisations and movements of proteins can be detected in a fluorescent microscope. Moreover, also the subnuclear localisation of a certain region of a chromosome can be studied using this technique. GFP is fused to the Lac Repressor protein (LacR) and ectopically expressed in the cell where tandem repeats of the lacO sequence has been inserted into the region of interest on the chromosome2. The LacR-GFP will bind to the lacO repeats and that area of the genome will be visible as a green dot in the fluorescence microscope. Yeast is especially suited for this type of manipulation since homologous recombination is very efficient and thereby enables targeted integration of the lacO repeats and engineered fusion proteins with GFP 3. Here we describe a quantitative method for live cell analysis of fission yeast. Additional protocols for live cell analysis of fission yeast can be found, for example on how to make a movie of the meiotic chromosomal behaviour 4. In this particular experiment we focus on subnuclear organisation and how it is affected during gene induction. We have labelled a gene cluster, named Chr1, by the introduction of lacO binding sites in the vicinity of the genes. The gene cluster is enriched for genes that are induced early during nitrogen starvation of fission yeast 5. In the strain the nuclear membrane (NM) is labelled by the attachment of mCherry to the NM protein Cut11 giving rise to a red fluorescent signal. The Spindle Pole body (SPB) compound Sid4 is fused to Red Fluorescent Protein (Sid4-mRFP) 6. In vegetatively growing yeast cells the centromeres are always attached to the SPB that is embedded in the NM 7. The SPB is identified as a large round structure in the NM. By imaging before and 20 minutes after depletion of the nitrogen source we can determine the distance between the gene cluster (GFP) and the NM/SPB. The mean or median distances before and after nitrogen depletion are compared and we can thus quantify whether or not there is a shift in subcellular localisation of the gene cluster after nitrogen depletion.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, is a good model system to study basic cellular processes. Here we describe a method to perform quantitative live cell analysis of fission yeast. In this particular experiment we focus on organisation of the genome within the cell nucleus, but the method can also be used to study cytosolic factors.

分裂酵母の定量的なライブセル蛍光-顕微鏡解析

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos

The spindle assembly checkpoint (SAC) mechanism is an active signal, which monitors the interaction between chromosome kinetochores and spindle microtubules to prevent anaphase onset until the chromosomes are properly connected. Cells use this mechanism to prevent aneuploidy or genomic instability, and hence cancers and other human diseases like birth defects and Alzheimer's1. A number of the SAC components such as Mad1, Mad2, Bub1, BubR1, Bub3, Mps1, Zw10, Rod and Aurora B kinase have been identified and they are all kinetochore dynamic proteins2. Evidence suggests that the kinetochore is where the SAC signal is initiated. The SAC prime regulatory target is Cdc20. Cdc20 is one of the essential APC/C (Anaphase Promoting Complex or Cyclosome) activators3 and is also a kinetochore dynamic protein4-6. When activated, the SAC inhibits the activity of the APC/C to prevent the destruction of two key substrates, cyclin B and securin, thereby preventing the metaphase to anaphase transition7,8. Exactly how the SAC signal is initiated and assembled on the kinetochores and relayed onto the APC/C to inhibit its function still remains elusive.
Drosophila is an extremely tractable experimental system; a much simpler and better-understood organism compared to the human but one that shares fundamental processes in common. It is, perhaps, one of the best organisms to use for bio-imaging studies in living cells, especially for visualization of the mitotic events in space and time, as the early embryo goes through 13 rapid nuclear division cycles synchronously (8-10 minutes for each cycle at 25 &deg;C) and gradually organizes the nuclei in a single monolayer just underneath the cortex9.
Here, I present a bio-imaging method using transgenic Drosophila expressing GFP (Green Fluorescent Protein) or its variant-targeted proteins of interest and a Leica TCS SP2 confocal laser scanning microscope system to study the SAC function in flies, by showing images of GFP fusion proteins of some of the SAC components, Cdc20 and Mad2, as the example.

Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos

The kinetochore is where the SAC initiates its signal monitoring the mitotic segregation of the sister chromatids. A method is described to visualize the recruitment and turnover of one of the kinetochore proteins and its coordination with the chromosome motion in Drosophila embryos using a Leica laser scanning confocal system.

リビングでの動的動原体タンパク質の挙動と染色体の動きを図解して有糸分裂チェックポイントを勉強<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;合胞体胚

The spindle assembly checkpoint (SAC) mechanism is an active signal, which monitors the interaction between chromosome kinetochores and spindle ...

Acquiring Fluorescence Time-lapse Movies of Budding Yeast and Analyzing Single-cell Dynamics using GRAFTS

Fluorescence time-lapse microscopy has become a powerful tool in the study of many biological processes at the single-cell level. In particular, movies depicting the temporal dependence of gene expression provide insight into the dynamics of its regulation; however, there are many technical challenges to obtaining and analyzing fluorescence movies of single cells. We describe here a simple protocol using a commercially available microfluidic culture device to generate such data, and a MATLAB-based, graphical user interface (GUI) -based software package to quantify the fluorescence images. The software segments and tracks cells, enables the user to visually curate errors in the data, and automatically assigns lineage and division times. The GUI further analyzes the time series to produce whole cell traces as well as their first and second time derivatives. While the software was designed for S. cerevisiae, its modularity and versatility should allow it to serve as a platform for studying other cell types with few modifications.

We present a simple protocol to obtain fluorescence microscopy movies of growing yeast cells, and a GUI-based software package to extract single-cell time series data. The analysis includes automated lineage and division time assignment integrated with visual inspection and manual curation of tracked data.

出芽酵母の蛍光タイムラプス作品を取得し、移植片を使用したシングルセルダイナミクスの解析

Fluorescence time-lapse microscopy has become a powerful tool in the study of many biological processes at the single-cell level. In particular, movies ...

Temporal Quantification of MAPK Induced Expression in Single Yeast Cells

The quantification of gene expression at the single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements performed at the population level. Two methods based on microscopy and flow cytometry are presented to demonstrate how such data can be acquired. The expression of a fluorescent reporter induced upon activation of the high osmolarity glycerol MAPK pathway in yeast is used as an example. The specific advantages of each method are highlighted. Flow cytometry measures a large number of cells (10,000) and provides a direct measure of the dynamics of protein expression independent of the slow maturation kinetics of the fluorescent protein. Imaging of living cells by microscopy is by contrast limited to the measurement of the matured form of the reporter in fewer cells. However, the data sets generated by this technique can be extremely rich thanks to the combinations of multiple reporters and to the spatial and temporal information obtained from individual cells. The combination of these two measurement methods can deliver new insights on the regulation of protein expression by signaling pathways.

Two complementary methods based on flow cytometry and microscopy are presented which enable the quantification, at the single cell level, of the dynamics of gene expression induced by the activation of a MAPK pathway in yeast.

シングル酵母細胞中のMAPK誘導発現の時間的な定量

The quantification of gene expression at the  single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements  performed at the population ...

Microscopy of Fission Yeast Sexual Lifecycle

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the mechanics of cell division and cell polarity. Furthermore, classical experiments on its sexual reproduction have yielded results pivotal to current understanding of DNA recombination and meiosis. More recent analysis of fission yeast mating has raised interesting questions on extrinsic stimuli response mechanisms, polarized cell growth and cell-cell fusion. To study these topics in detail we have developed a simple protocol for microscopy of the entire sexual lifecycle. The method described here is easily adjusted to study specific mating stages. Briefly, after being grown to exponential phase in a nitrogen-rich medium, cell cultures are shifted to a nitrogen-deprived medium for periods of time suited to the stage of the sexual lifecycle that will be explored. Cells are then mounted on custom, easily built agarose pad chambers for imaging. This approach allows cells to be monitored from the onset of mating to the final formation of spores.

We provide a reproducible basic method for the long-term microscopy of the fission yeast sexual lifecycle. With minor adjustments described, the presented protocol allows research focus on different steps of the reproductive process.

分裂酵母セクシャルライフサイクルの顕微鏡観察

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the ...

High-resolution Imaging and Analysis of Individual Astral Microtubule Dynamics in Budding Yeast

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells regulate these processes and how genetic mutations impact regulation. The quantification of microtubule dynamics in metazoan models has a number of associated challenges, including a high microtubule density and limitations on genetic manipulations. In contrast, the budding yeast model offers advantages that overcome these challenges. This protocol describes a method to measure the dynamics of single microtubules in living yeast cells. Cells expressing fluorescently tagged tubulin are adhered to assembled slide chambers, allowing for stable time-lapse image acquisition. A detailed guide for high-speed, four-dimensional image acquisition is also provided, as well as a protocol for quantifying the properties of dynamic microtubules in confocal image stacks. This method, combined with conventional yeast genetics, provides an approach that is uniquely suited for quantitatively assessing the effects of microtubule regulators or mutations that alter the activity of tubulin subunits.

Budding yeast is an advantageous model for studying microtubule dynamics in vivo due to its powerful genetics and the simplicity of its microtubule cytoskeleton. The following protocol describes how to transform and culture yeast cells, acquire confocal microscopy images, and quantitatively analyze microtubule dynamics in living yeast cells.

出芽酵母における高解像度画像と個人アストラル微小管動態の解析

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells ...

Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does not interfere with cell physiology, and requires minimal experimental handling. The low levels of technical interference enable researchers to study cells across multiple cycles of mitosis and to observe meiosis from beginning to end. Using fluorescent tags such as Green Fluorescent Protein (GFP) and Red Fluorescent Protein (RFP), researchers can analyze different factors whose functions are important for processes like transcription, DNA replication, cohesion, and segregation. Coupled with data analysis using Fiji (a free, optimized ImageJ version), live-cell imaging offers various ways of assessing protein movement, localization, stability, and timing, as well as nuclear dynamics and chromosome segregation. However, as is the case with other microscopy methods, live-cell imaging is limited by the intrinsic properties of light, which put a limit to the resolution power at high magnifications, and is also sensitive to photobleaching or phototoxicity at high wavelength frequencies. However, with some care, investigators can bypass these physical limitations by carefully choosing the right conditions, strains, and fluorescent markers to allow for the appropriate visualization of mitotic and meiotic events.

Here, we present live-cell imaging which is a non-toxic microscopy method that allows researchers to study protein behavior and nuclear dynamics in living fission yeast cells during mitosis and meiosis.

蛍光生細胞顕微鏡によるミトティック・マイオシス酵母核ダイナミクスの検討

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does ...

Live Cell Imaging to Assess the Dynamics of Metaphase Timing and Cell Fate Following Mitotic Spindle Perturbations

Live cell time-lapse imaging is an important tool in cell biology that provides insight into cellular processes that might otherwise be overlooked, misunderstood, or misinterpreted by the fixed-cell analysis. While the fixed cell imaging and analysis is robust and sufficient to observe cellular steady-state, it can be limited in defining a temporal order of events at the cellular level and is ill-equipped to assess the transient nature of dynamic processes including mitotic progression. In contrast, live cell imaging is an eloquent tool that can be used to observe cellular processes at the single-cell level over time and has the capacity to capture the dynamics of processes that would otherwise be poorly represented in fixed cell imaging. Here we describe an approach to generate cells carrying fluorescently labeled markers of chromatin and microtubules and their use in live cell imaging approaches to monitor metaphase chromosome alignment and mitotic exit. We describe imaging-based techniques to assess the dynamics of spindle formation and mitotic progression, including the identification of cells at various stages in mitosis, identification&#160;and tracking of mitotic defects, and analysis of spindle dynamics and mitotic cell fate following the treatment with mitotic inhibitors.

Here we present a protocol to assess the dynamics of spindle formation and mitotic progression. Our application of time-lapse imaging enables the user to identify cells at various stages of mitosis, track and identify mitotic defects, and analyze spindle dynamics and mitotic cell fate upon exposure to anti-mitotic drugs.

水動紡錘摂動後のメタフェイズタイミングと細胞運命のダイナミクスを評価するライブ細胞イメージング

Live cell time-lapse imaging is an important tool in cell biology that provides insight into cellular processes that might otherwise be overlooked, ...

Use of Time-Lapse Microscopy and Stage-Specific Nuclear Depletion of Proteins to Study Meiosis in S. cerevisiae

Time-lapse fluorescence microscopy has revolutionized the understanding of meiotic cell-cycle events by providing temporal and spatial data that is often not seen by imaging fixed cells. Budding yeast has proved to be an important model organism to study meiotic chromosome segregation because many meiotic genes are highly conserved. Time-lapse microscopy of meiosis in budding yeast allows the monitoring of different meiotic mutants to show how the mutation disrupts meiotic processes. However, many proteins function at multiple points in meiosis. The use of loss-of-function or meiotic null mutants can therefore disrupt an early process, blocking or disturbing the later process and making it difficult to determine the phenotypes associated with each individual role. To circumvent this challenge, this protocol describes how the proteins can be conditionally depleted from the nucleus at specific stages of meiosis while monitoring meiotic events using time-lapse microscopy. Specifically, this protocol describes how the cells are synchronized in prophase I, how the anchor away technique is used to deplete proteins from the nucleus at specific meiotic stages, and how time-lapse imaging is used to monitor meiotic chromosome segregation. As an example of the usefulness of the technique, the kinetochore protein Ctf19 was depleted from the nucleus at different time points during meiosis, and the number of chromatin masses was analyzed at the end of meiosis II. Overall, this protocol can be adapted to deplete different nuclear proteins from the nucleus while monitoring the meiotic divisions.

Use of Time-Lapse Microscopy and Stage-Specific Nuclear Depletion of Proteins to Study Meiosis in S. cerevisiae

Time-lapse microscopy is a valuable tool for studying meiosis in budding yeast. This protocol describes a method that combines cell-cycle synchronization, time-lapse microscopy, and conditional depletion of a target protein to demonstrate how to study the function of a specific protein during meiotic chromosome segregation.

S. cerevisiaeの減数分裂を研究するためのタイムラプス顕微鏡とタンパク質のステージ特異的核枯渇の使用

Time-lapse fluorescence microscopy has revolutionized the understanding of meiotic cell-cycle events by providing temporal and spatial data that is often ...