Name: spatiotemporal analysis of cytokinetic events in fission yeast
Uploaded: 2017-02-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Spatiotemporal Analysis of Cytokinetic Events in Fission Yeast at JoVE.com

This work was supported by startup funds from The University of Tennessee and TN-SCORE, a multi-disciplinary research program sponsored by NSF-EPSCoR (EPS-1004083).

1. Herstellung der Probe <ol><li> Wachsen Spalthefe - Zellen, die die Spindel Polkörper Marker SAd1-mCherry 23 und Typ - II - Myosin regulatorische leichte Kette RLC1-Tomate 24 in YE flüssigen Medien bei 32 ° C für 8 Generationen. HINWEIS: Bei temperaturempfindlichen Mutanten wachsen Zellen bei 25 ° C. Wachsen Zellen bis zur mittleren logarithmischen Phase bis zu einer OD 600 von 0,5 in YE. Weitere Informationen über die Spaltung beziehen Hefe Wachstumsbedingungen der Spalthefe Laborhandbuch 25. </li><li> Bereitet (oder minimal) Medien mit 0,6% Agarose (Agarose basierte Medien zeigen weniger fluoreszierenden Hintergrund im Vergleich zu Agar). Um das geschmolzene Medien hinzufügen 1 mM Ascorbinsäure (Vitamin C). Das Vitamin C quencht freie Radikale, die durch Photobleaching freigesetzt werden, wodurch Phototoxizität zu minimieren. </li><li> Gießen Sie 3 bis 4 ml der Vitamin-C-Medien geschmolzen geschnürt auf einen Glasboden Kulturschale. Lassen Sie die Medien kühl und zu verfestigen. Beachten Sie dasDicke des Glases in der Kulturschale, hängt von der Deckglasdicke geeignet für das Mikroskop. Hier Gebrauch Deck Nr 1.5. </li><li> erhöhen Sie vorsichtig die verfestigte Medien aus der Kulturschale mit Hilfe eines scharfen Skalpell. Legen Sie eine Pipettenspitze zwischen dem Medienplatte und der Kulturschale die Platte zu verhindern , fallen zurück in die Schale (Abbildung 1). </li><li> Nehmen Sie 1 ml frisch wachsenden Zellen, wie in 1.1 oben beschrieben. Drehen Sie die Zellen vorsichtig bei 300 g für 30 s. Überstand verwerfen. Resuspendieren der Zellen in der geringen Menge an Rest Medien, das nach dem Verwerfen des Überstandes in der Röhre verbleibt. </li><li> Last von 2 bis 5 &amp; mgr; l der resuspendierten Zellkultur zwischen dem Medienplatte und den Glasboden der Kulturschale. Die Zellen sollten auf dem Glas sein. Die Pipettenspitze zwischen den Medien gegeben und die Schale ermöglicht eine einfache Beladung der Zellkultur. </li><li> Sehr sanft die Pipettenspitze entfernen und die Medienplatte wieder in seine ursprüngliche Position auf dem culture Gericht. Achten Sie darauf, alle Luftblasen zu vermeiden. Wenn die Notwendigkeit, die Luftblasen durch Verschieben der Rückseite einer Pipettenspitze auf der Oberseite der Medienplatte herausdrücken sanft werden. </li><li> Lassen sich die Zellen bei der Temperatur für 30 min bis eine Stunde in der Dunkelheit in der Kulturschale sitzen, an der Mikroskopie durchgeführt wird. Dies ist wichtig, jeden Schlag zu vermeiden aufgrund der Wachstumsbedingungen für die Zellen zu ändern. </li></ol> 2. Image Acquisition <ol><li> Einen Tropfen von Öl auf der Außenseite des Glases auf der Kulturschale. Legen Sie die Kulturschale auf einem inversen Mikroskop. </li><li> (- 535 nm 520) Autofluoreszenz von YE Medien verwenden, um eine GFP-Filter mit einem schmalen Wellenlängenbereich zu minimieren. </li><li> Konzentrieren Sie sich auf der medialen Ebene der Zellen und sicherzustellen, dass sie gut verteilt sind und nicht zu voll. Stellen Sie sicher, Bildaufnahme der Zellen in der geeigneten Phase des Zellzyklus zu starten. Für dieses Experiment folgen Zellen vom späten G2. </li><li> Programmieren Sie die Bildaufnahme - Software to nehmen GFP, RFP und DIC Bilder der Zellen. <ol><li> Für dieses Experiment wurden 100 ms Belichtungszeit für die DIC verwenden und 75 ms Belichtungszeit für GFP und RFP-Filter. Die Belichtungszeit hängt von den Einstellungen des Mikroskops, das Protein untersucht und der Dauer des Experiments. Für den gegebenen Mikroskopeinstellungen, verwenden 50% der Laserleistung. </li><li> So erfassen Bilder in 3 Dimensionen, Programm der Bilderfassungssoftware für Z-Skala Bildgebung. Verwenden Sie einen Schrittgröße von 0,4 um und einem Abstand von 3,0 um (die Hälfte der gesamten z) um den zentralen Fokuspunkt der Zellen. Dies führt zur Erfassung von 16 Z-Frames pro Zeitpunkt mit insgesamt Z-Abstand von 6 um. HINWEIS: Z-Serie Bildaufnahme ermöglicht die Erfassung der Spindel Polkörper. </li></ol></li><li> Nehmen Sie Bilder alle 2 min. Verändern der Belichtungszeit entsprechend den Anforderungen des Experiments. Die Belichtungszeit kann auch nach dem interessierenden Protein und der Signalstärke verändert werden. Beachten Sie jedoch, dass die kurzeer Intervallen oder längere Belichtungszeit Erhöhung Phototoxizität aufgrund Bleichen und daher können die Zellen nur für eine kurze Zeit verfolgt werden. </li><li> Erwerben Sie Bilder bis in die Zellen physikalisch getrennt, wie durch die DIC Bilder beobachtet, oder die Software programmieren, um Erwerb nach 90 min zu stoppen. </li></ol> 3. Bildanalyse <ol><li> Zeitliche Analyse der zytokinetischen Ereignisse <ol><li> Mit Hilfe der Bildaufnahme-Software machen Projektionen der Z-Frames für jeden Zeitpunkt. Machen Sie verschiedene Dateien für jede Wellenlänge des Bildes erfasst. </li><li> Exportieren Sie diese Projektion Zeitpunkt Serie als Tiff-Datei. </li><li> Analysieren Sie die Bilder ImageJ-Software. Öffnen der Bilderserie für jede eine der Wellenlängen. </li><li> Wählen Sie eine Zelle untersucht werden. Klicken Sie doppelt auf die Zeile Option der Symbolleiste. Dies wird ein weiteres Fenster öffnen, um Linienbreite anpassen. Stellen Sie die Linienbreite zur Zellenbreite entspricht. Für eine WT-Zelle ist dies etwa 40 - 50 Pixel. Zeichnen Sie eine Linie entlang derlangen Achse der Zelle von Interesse. </li><li> Klicken Sie auf Analysieren&gt; Tools&gt; ROI-Manager und klicken Sie auf Hinzufügen. Dadurch wird die ausgewählte Zeile in die ROI-Fenster für den Einsatz später hinzufügen. Sie dieses Fenster nicht schließen. </li><li> Klicken Sie auf das Bild von Interesse und wählen Sie Bearbeiten&gt; Auswahl&gt; Begradigen. Dies wird ein weiteres Fenster öffnen. Check &quot;gesamte Stapel verarbeiten&quot;. Dadurch wird die Zelle horizontal auszurichten. </li><li> Klicken Sie auf Bild&gt; Transformieren&gt; Drehen um 90 Grad nach rechts. Dieses Bild ist nun vertikal gestreckt. </li><li> Klicken Sie auf Bild&gt; Stacks&gt; Make Montage. Dadurch wird ein Fenster geöffnet, um die Anzahl der Zeilen und Spalten für den Stapel, der Skalierungsfaktor für die Bildgröße, die erste und die letzte Scheibe (Rahmen) für die Montage und der Rahmen Schrittweite für die Montage zuordnen. Überprüfen Etikett Scheiben und drücken Sie die Eingabetaste. </li><li> Als ein Fenster mit einer Montage der Zelle von Interesse gezeigt wird, öffnen Sie die Bildserien für die andere Wellenlänge. </li><li> Klicken Sie auf die Zeilennummer auf ROI-Manager. Dies wird wählendie gleiche Zelle auf der zweiten Bilddatei. Wiederholen Sie die Schritte 3.1.6 - 3.1.8. Dies wird eine Montage des zweiten Bildes öffnen. </li><li> Auf dem Bild mit dem Körper Marker Spindelpoltrennung SAd1-mCherry, suchen Sie nach Beginn der Trennung der Spindel Polkörper Marker und diesem Zeitpunkt als Zeitpunkt 0 zu markieren. </li><li> Folgen Sie dem RLC1-Tomato-Signal auf das Bild im Laufe der Zeit und suchen Sie nach dem Signal, das als eigenständige Linie erscheint im Gegensatz zu Patches von RLC1-Tomaten. Diese Zeitpunkt markiert Abschluss Actomyosinaktivität Ringanordnung / Beginn der Reifephase. </li><li> Weiter blättern durch den Film über die Zeit zu bestimmen, wann der RLC1-Tomate Ring in der Größe zu sinken beginnt. Dies wird als das Ende der Reifungsphase / Einsetzen der Ringverengung gekennzeichnet. </li><li> Folgen der RLC1-Tomato-Signal über die Zeit im ganzen Einschnürung bis es als ein Punkt in der Mitte der Zellenachse erscheint. Dies wird als das Ende der Ringverengung / Ende Septum ingression markiert. </li><li> Nach der Montage der DIC Bilder, bestimmen die endgültige ZellTrennung. Notieren Sie sich den Zeitpunkt, wenn die Zelle physikalisch trennt. </li><li> Für Spindel Polkörper Trennung messen Sie den Abstand zwischen den beiden Spindel Polkörper im Laufe der Zeit das Linienwerkzeug in ImageJ. Zeichnen Sie die Strecke in Spindel Polkörper über die Zeit. </li><li> Notieren Sie die verschiedenen Zeitpunkte für die verschiedenen zytokinetischen Ereignisse die Dauer der einzelnen zytokinetischen Phase zu berechnen und zu vergleichen mit Spindel Polkörper Trennung über die Zeit. </li></ol></li><li> Räumliche Analyse von zytokinetischen Veranstaltungen <ol><li> Wählen Sie eine Zelle mit einem sichtbaren Aktomyosin Ring. Klicken Sie doppelt auf die Zeilenoption von ImageJ Symbolleiste. Dies wird ein weiteres Fenster öffnen, um Linienbreite anpassen. Stellen Sie die Linienbreite auf die Ringdicke zu entsprechen (15 bis 20 Punkte). Zeichnen Sie eine Linie entlang des Rings kümmert sich die gesamte Dicke des Rings, um sicherzustellen, ist im Preis inbegriffen. </li><li> Klicken Sie auf Analysieren&gt; Tools&gt; ROI-Manager und klicken Sie auf Hinzufügen. Dadurch wird die ausgewählte Zeile in die ROI-Fenster für den Einsatz später hinzufügen.Sie dieses Fenster nicht schließen. </li><li> Klicken Sie auf das Bild von Interesse und wählen Sie Bearbeiten&gt; Auswahl&gt; Begradigen. Dies wird ein weiteres Fenster öffnen. Check &quot;gesamte Stapel verarbeiten&quot;. Dadurch wird der Ring horizontal auszurichten. </li><li> Setzen Sie die Intensität der hellsten Ebene in der gestreckten Z-Stapel (von 3.1.6) Bild mit&gt; Anpassen&gt; Helligkeit / Kontrast&gt; Zurücksetzen. </li><li> Klicken Sie auf die Registerkarte Stk&gt; 3D-Projekt. Dadurch wird ein Dialogfeld geöffnet. Ändern Sie den Projektionsverfahren auf hellste Punkt und dem Slice-Abstand auf 2 oder 3 Pixel. Schließlich ändern Drehachse X oder Y-Achse (dies hängt von der gewünschten Betrachtungswinkel ändern, je nachdem), klicken Sie interpolieren und OK klicken, um eine 3D-Projektion des Bildes zu erzeugen. Verwenden Sie die Bildlaufleiste unter dem Bild, um das Bild zu drehen. </li><li> Öffnen Sie das Bild Serie für die andere Wellenlänge mit ImageJ. </li><li> Klicken Sie auf die Zeilennummer auf ROI-Manager. Dies wird den gleichen Ring auf dem zweiten Bild-Datei auswählen. Wiederholen Sie die Schritte 4.2.4 und 4.2.5.Dies wird mit der anderen Wellenlänge, die eine 3-dimensionale Ring im Bild zu öffnen. </li><li> Mit den beiden 3D-Bild Ringe öffnen, klicken Sie auf das Bild&gt; Farbe&gt; Kanäle zusammenführen. Dies wird eine Box zu öffnen. Wählen Sie jedes Bild aus dem Dropdown-Menü für die entsprechende Farbe gewünscht und klicken Sie auf OK. Es öffnet sich ein Verbund aus den beiden Bildern bei unterschiedlichen Wellenlängen. </li><li> Vergleichen Sie die Lokalisierung von verschiedenen Markern in Bezug auf die Lokalisierung am zytokinetischen Ring oder eindringende Membran. RLC1-GFP ist ein Marker für die zytokinetischen Ring. Proteine ​​co-lokalisierenden mit RLC1-GFP in den Ring zu lokalisieren während Proteine ​​hinter RLC1-GFP-Signal zu lokalisieren, um die eindringenden Membran zu lokalisieren. HINWEIS: Das Protein von Interesse muss von einem anderen Fluorophor zu sein, als die des Ringmarkierung. </li><li> Generieren 3-dimensionale Ringe während verschiedener Stadien der Zellteilung die räumliche Lokalisierung der Proteine ​​alle durch cytokinesis zu vergleichen. </li></ol></li><li> Analyse von Protein distriteilung bei zytokinetischen Ring <ol><li> Zu vergleichen und zu analysieren Verteilung von Proteinen entlang des Rings der Koeffizient der Varianz der Proteinverteilung messen. Ein hoher Koeffizient der Varianz zeigt eine ungleichmäßige Verteilung von Proteinen entlang der Teilungsstelle und schlägt vor unsachgemäßen Ringanordnung, Reifung oder Septum Bildung, je nachdem, welche Phasen abgebildet oder analysiert wird. </li><li> Unter Verwendung von 3 dimensionalen rekonstruierten zytokinetischen Ring (ab 3.2.2), teilen sich das Bild in mindestens vier Quadranten, so dass ein Viertel des Rings in jedem Quadranten erscheint. Dazu das Linienwerkzeug verwenden, um senkrechte Linien auf dem Bild zeichnen. Nach jedem Klick Bildzeile&gt; Overlay&gt; Auswahl hinzufügen oder Abkürzung Strg + B verwenden. </li><li> Zum Analysieren&gt; Set-Messung. Wählen mittleren Grauwert in dem Feld, das sich öffnet. OK klicken. </li><li> Mit den gezogenen Linien oben als Führer zeichnen ein Rechteck jedem Quadranten mit dem Rechteck-Werkzeug zu definieren. </li><li> Zur Messung der mittleren Intensität jedes Quadranten, klickenAnalysieren Sie auf&gt; Messen oder die Abkürzung Strg + M verwenden. </li><li> Notieren Sie den mittleren Grauwert für alle vier Quadranten (MG 1 -MG 4). </li><li> Wählen Sie einen kleinen Bereich in jedem Quadranten außerhalb des Rings als Hintergrund Auswahl. </li><li> Messen mittleren Grauwert für die Hintergrundauswahl für alle vier Quadranten (BG 1 -BG 4). </li><li> li&gt; Für Untergrundsubtraktion für jeden Quadranten verwenden Sie die folgende Formel- MG 1 -Average (BG 1: BG 4) = Intensität des Rings in jedem Quadranten (IRQ). In diesem Stadium gibt es 4 IRQ-Werte, einen für jeden Quadranten. </li><li> Als nächstes berechnen die folgende Formel- Standardabweichung (IRQ 1: IRQ 4) unter Verwendung der Variationskoeffizient für jeden Ring / Normal (IRQ 1: IRQ 4). Berechnen durchschnittliche Co effiziente Varianz für jeden Stamm und vergleichen, um zu den anderen Stämmen. ANMERKUNG: Eine statistisch signifikante Zunahme der Koeffizient der Varianz in einem Stamm im Vergleich zu Kontrollen indicates uneben Proteinverteilung / Lieferung entlang der Teilungsebene in diesem Stadium der Zellteilung. </li></ol></li></ol>

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K., Ando, M., Hamaguchi, H. O., Shigeto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disentangling+dynamic+changes+of+multiple+cellular+components+during+the+yeast+cell+cycle+by+in+vivo+multivariate+Raman+imaging.">Disentangling dynamic changes of multiple cellular components during the yeast cell cycle by in vivo multivariate Raman imaging.</a> Anal Chem. 84 (13), 5661-5668 (2012).</li><li>Le Goff, X., Woollard, A., Simanis, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+cps1+gene+provides+evidence+for+a+septation+checkpoint+in+Schizosaccharomyces+pombe.">Analysis of the cps1 gene provides evidence for a septation checkpoint in Schizosaccharomyces pombe.</a> Mol Gen Genet. 262 (1), 163-172 (1999).</li></ol>

Die Autoren erklären, keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Hier haben wir ein Protokoll zu studieren zytokinetischen Ereignisse in Spalthefe in einer zeitlichen Weise beschrieben. Das hier beschriebene Protokoll liefert zeitliche Auflösung verschiedener zytokinetischen Ereignisse mit Bezug zueinander; Timing der Protein Rekrutierung oder Verlust in Bezug auf zytokinetischen Phase; Struktur des Rings in den verschiedenen Phasen der Zytokinese; und das Fortschreiten der Zytokinese mit Bezug auf die Mitose. Bei diesem Protokoll ist es möglich, die zytokinetischen Phase genau zu ...

Cytokinesis, der letzte Schritt bei der Zellteilung, ist ein komplexer Prozess essentiell für die Differenzierung, die Entwicklung und das Überleben eines Organismus. Cytokinesis umfasst mehrere Veranstaltungen , die organisiert werden erfolgreiche Zelltrennung zu gewährleisten , während genomische Integrität beibehalten 1. Cytokinesis beinhaltet Veranstaltungen , bei denen ein Aktomyosin Ring einmal Einschnürung montiert erfährt, die mit Membranausdehnungs und Runzeln gleichzeitig ist, und die extrazelluläre zelluläre Matrix Umbau, gefolgt schließlich von Zelle abscission 1, 2, 3. Eine falsche Organisation von zytokinetischen Ereignisse können zu Zellseparation und Ploidie Defekten führen und können Krankheiten wie Krebs 4 verursachen, 5, 6, 7, 8. Die grundlegenden Prinzipien, die ermöglichen organisation von zytokinetischen Ereignisse sind nicht gut verstanden, was zu Straßensperren in unserem Verständnis der Ätiologie dieser Krankheiten führt. Die Spalthefe Schizosaccharomyces pombe (S. pombe) ist ein ausgezeichnetes Modellsystem cytokinesis aufgrund der konservierten Natur der beteiligten Proteine 1 studieren. In Spalthefe, nachdem Aktomyosin Ringanordnung tritt der Ring eine Reifung / Ruhephase , wo es nicht 9 nicht einengen. Ausreifung endet mit Beginn Actomyosinaktivität Schnürring, gleichzeitig mit Membran Runzeln und Septum ingression. Seminal Arbeit im Laufe der Jahre haben wir 1, ein ziemlich gutes Verständnis Actomyosinaktivität Ringanordnung in Spaltung 9, 10 Hefe gegeben. In einigen Eukaryonten, einschließlich Spalthefe, erfolgreiche Montage des Aktomyosin Ring ist für die Membran Runzeln nicht ausreichend. in fission Hefe, allein Schnürring ist jedoch nicht ausreichend Druckkraft interne turgor zu überwinden für Furche Bildung 11. Ein aktuelles Modell zeigt , dass diese Kraft anstelle von Septum ingression 11 vorgesehen ist. In einem anderen Modell hat sich die Rolle der Plasmamembran Erweiterung vorgeschlagen Bildung 12, 13 zu furchen beizutragen. Ring Verengung und Membran Runzeln treten nicht in Bgs1 / Cps1 temperaturempfindliche Mutante cps1-191, das Hauptenzym für die primäre Septenbildung 14, 15. Die Zellen Bgs1 zeigen defekte primäre Septum und verlängerte Ringverengung 15, fehlt 16. Bgs1 für Septum ingression während der Reifung zur Zellteilung Ort rekrutiert nach Aktomyosin Ringanordnung 17, 18. Similarly, während Zellularisierung in Drosophila - Embryos ist Schnürring zweiphasige mit einer deutlich langsamer initialer Einschnürung Rate 19, die Reifephase ähnelt in Spalthefe beobachtet. Biphasische Schnürring verlangsamen Membran Runzeln für eine ausreichende Membranausdehnungs 20 und Modifikation von extrazellulären Matrix zu ermöglichen. Dies deutet darauf hin, dass nach Aktomyosin Ringanordnung tritt Schnürring effizient nur dann, wenn die Zelle die Anforderungen für die Furche Bildung erfüllt hat. Es ist nicht gut verstanden, welche Bedingungen für Aktomyosin Schnürring nach Ringanordnung erforderlich sind, noch die molekularen Ereignisse, die diesen Prozess regulieren. Wir haben kürzlich gezeigt , dass Montage folgende Aktomyosin Ring die kleine GTPase Cdc42 ein einzigartiges Muster Raum - Zeit - Aktivierung unterzogen 21. Dieses Muster wird durch die einzigartige Lokalisierungsmuster der Austauschfaktoren Cdc42 Guanidin Nukleotid etabliert (GEFs), die Cdc42 aktivieren. Die GEF Gef1 lokalisiert an den Aktomyosin Ring montiert und fördert Einsetzen der Ringverengung und Septum ingression, während scd1 auf die furch Membran lokalisiert und fördert die normale Septenbildung. Wir finden, dass das Muster Cdc42 Aktivierung durch seine GEFs der Regulierung verschiedener zytokinetischen Ereignisse führen etabliert. Um den molekularen Mechanismus der Ereignisse zu verstehen, die schließlich folgende Aktomyosin Ringanordnung zur Trennung von Zellen führen, muss man die unterschiedlichen zytokinetischen Ereignisse in Zeit und Raum zu folgen. In Spalthefe beinhaltet Zytokinese zunächst die Montage von Vorläuferknoten um den Kern, die schließlich den Typ II Myosin rekrutieren, die formin CDC12 und anderen erforderlichen Proteine ​​zur Actomyosin Ringanordnung. Um Zeit einen Bezugsrahmen, ist die deutliche zytokinetischen Ereignisse und liefern die Trennung von Spindel Polkörper Marker (Spindelbildung) als Zeitpunkt 0 22 betrachtet. Die Montage von the Aktomyosin Ring kann durch die Überwachung im Laufe der Zeit die Intensität eines fluoreszierend markierten Aktomyosin Ring Protein wie der Typ-II-Myosin regulatorische leichte Kette RLC1 folgen. Hier haben wir einen mikroskopischen Ansatz beschreiben zu verschiedenen Stadien der Zellteilung im Laufe der Zeit zu analysieren.

<table><tbody><tr><td>Yeast extract media</td><td>Sunrise Science Products</td><td>YES 225</td><td>0.5% w/v yeast extract, 3% w/v glucose, 225mg/L adenine, histidine, leucine, uracil, and lysine</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>SeaKem LE agarose, Lonza</td><td>50001</td><td></td></tr><tr><td>Ascorbic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4544</td><td></td></tr><tr><td>Glass Bottomed culture dish</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td>Coverslip No. 1.5 was used. This will vary as per the microscope specifications used.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>VT-Hawk 2D array laser scanning confocal microscopy system</td><td>Visitech International, UK</td><td></td><td>with an Olympus IX-83 inverted microscope with a 100X / numerical aperture 1.49 UAPO lens (Olympus) and EM-CCD digital camera (Hamamatsu).&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td>Image analysis software</td></tr></tbody></table>

spatiotemporal analysis of cytokinetic events in fission yeast

Zytokinese, der letzte Schritt in der Zellteilung ist entscheidend für die Aufrechterhaltung der Integrität Genoms. Proper Zytokinese ist wichtig für die Zelldifferenzierung und Entwicklung. Cytokinesis beinhaltet eine Reihe von Ereignissen, die in Zeit und Raum gut aufeinander abgestimmt sind. Cytokinesis beinhaltet die Bildung eines Aktomyosin Ring an der Teilungsebene, gefolgt von Ringverengung, Membran Furche Bildung und extrazellulären Matrixumbau. Die Spalthefe Schizosaccharomyces pombe (S. pombe) ist ein gut untersuchtes Modellsystem , das mit erheblichen Klarheit die ersten Ereignisse in cytokinesis offenbart hat. Allerdings verstehen wir nicht klar, wie verschiedene zytokinetischen Ereignisse räumlich-zeitlich aufeinander abgestimmt sind. Um dies zu bestimmen, muss man die verschiedenen zytokinetischen Ereignisse in großen Details sowohl zeitlich als auch räumlich zu analysieren. Hier haben wir einen Mikroskopie-Ansatz beschreiben verschiedene zytokinetischen ev zu untersuchenents in lebenden Zellen. Mit diesem Ansatz ist es möglich, verschiedene zytokinetischen Ereignisse und bestimmen den Zeitpunkt der Rekrutierung von verschiedenen Proteinen während der Zellteilung zu Zeit. Darüber hinaus beschreiben wir Protokolle Proteinlokalisierung und Verteilung an der Stelle der Zellteilung zu vergleichen. Dies ist ein einfaches Protokoll Zytokinese in Spalthefe zu studieren, und kann auch für andere Hefen und Pilzsystemen verwendet werden.

Spalthefezellen den Ring Marker, RLC1-GFP (grün, Abbildung 2) und Spindel Polkörper Marker SAd1-mCherry (rot, Abbildung 2) exprimieren , wurden während der Zytokinese abgebildet. Einsetzen der Spindel - Pol - Körper - Marker (weißer Pfeil, Figuren 2A, B) mit der Zeit betrachtet wird 0. RLC1-GFP - Signal zum Zeitpunkt -4 min mit Bezug erscheint Polkörper Trennung der Spindel (roter Pfeil, 2A, 2B). RLC1-GFP - Signal bildet einen kont...

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Spatiotemporal Analysis of Cytokinetic Events in Fission Yeast

Die Spalthefe Schizosaccharomyces pombe ist ein ausgezeichnetes Modellsystem cytokinesis studieren, die letzte Stufe in der Zellteilung. Hier haben wir einen Mikroskopie-Ansatz beschreiben verschiedene zytokinetischen Ereignisse in Live-Spalthefezellen analysieren.

Räumlich-zeitliche Analyse von zytokinetischen Events in Spalthefe

Cytokinesis, the final step in cell division is critical for maintaining genome integrity. Proper cytokinesis is important for cell differentiation and ...

spatiotemporal-analysis-of-cytokinetic-events-in-fission-yeast

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

7.3K Aufrufe.  University of Tennessee.  Die Spalthefe Schizosaccharomyces pombe ist ein ausgezeichnetes Modellsystem cytokinesis studieren, die letzte Stufe in der Zellteilung. Hier haben wir einen Mikroskopie-Ansatz beschreiben verschiedene zytokinetischen Ereignisse in Live-Spalthefezellen analysieren. 

Serie: Spatiotemporal Analysis of Cytokinetic Events in Fission Yeast

Measuring Replicative Life Span in the Budding Yeast

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has been used extensively to study the biology of aging, and several determinants of yeast longevity have been shown to be conserved in multicellular eukaryotes, including worms, flies, and mice 1. Due to the lack of easily quantified age-associated phenotypes, aging in yeast has been assayed almost exclusively by measuring the life span of cells in different contexts, with two different life span paradigms in common usage 2. Chronological life span refers to the length of time that a mother cell can survive in a non-dividing, quiescence-like state, and is proposed to serve as a model for aging of post-mitotic cells in multicellular eukaryotes. Replicative life span, in contrast, refers the number of daughter cells produced by a mother cell prior to senescence, and is thought to provide a model of aging in mitotically active cells. Here we present a generalized protocol for measuring the replicative life span of budding yeast mother cells. The goal of the replicative life span assay is to determine how many times each mother cell buds. The mother and daughter cells can be easily differentiated by an experienced researcher using a standard light microscope (total magnification 160X), such as the Zeiss Axioscope 40 or another comparable model. Physical separation of daughter cells from mother cells is achieved using a manual micromanipulator equipped with a fiber-optic needle. Typical laboratory yeast strains produce 20-30 daughter cells per mother and one life span experiment requires 2-3 weeks.

In this article we present a general protocol for measuring the replicative life span of yeast mother cells.

Mess-replikative Lebensspanne in der Hefe

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding ...

Forschung

Biologie

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using fluorochromes like Green Fluorescent Protein (GFP) directly attached to the protein of interest has become increasingly popular 1. Using GFP and similar fluorochromes the subcellular localisations and movements of proteins can be detected in a fluorescent microscope. Moreover, also the subnuclear localisation of a certain region of a chromosome can be studied using this technique. GFP is fused to the Lac Repressor protein (LacR) and ectopically expressed in the cell where tandem repeats of the lacO sequence has been inserted into the region of interest on the chromosome2. The LacR-GFP will bind to the lacO repeats and that area of the genome will be visible as a green dot in the fluorescence microscope. Yeast is especially suited for this type of manipulation since homologous recombination is very efficient and thereby enables targeted integration of the lacO repeats and engineered fusion proteins with GFP 3. Here we describe a quantitative method for live cell analysis of fission yeast. Additional protocols for live cell analysis of fission yeast can be found, for example on how to make a movie of the meiotic chromosomal behaviour 4. In this particular experiment we focus on subnuclear organisation and how it is affected during gene induction. We have labelled a gene cluster, named Chr1, by the introduction of lacO binding sites in the vicinity of the genes. The gene cluster is enriched for genes that are induced early during nitrogen starvation of fission yeast 5. In the strain the nuclear membrane (NM) is labelled by the attachment of mCherry to the NM protein Cut11 giving rise to a red fluorescent signal. The Spindle Pole body (SPB) compound Sid4 is fused to Red Fluorescent Protein (Sid4-mRFP) 6. In vegetatively growing yeast cells the centromeres are always attached to the SPB that is embedded in the NM 7. The SPB is identified as a large round structure in the NM. By imaging before and 20 minutes after depletion of the nitrogen source we can determine the distance between the gene cluster (GFP) and the NM/SPB. The mean or median distances before and after nitrogen depletion are compared and we can thus quantify whether or not there is a shift in subcellular localisation of the gene cluster after nitrogen depletion.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, is a good model system to study basic cellular processes. Here we describe a method to perform quantitative live cell analysis of fission yeast. In this particular experiment we focus on organisation of the genome within the cell nucleus, but the method can also be used to study cytosolic factors.

Quantitative Live Cell Fluoreszenz-Mikroskopie Analyse von Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos

The spindle assembly checkpoint (SAC) mechanism is an active signal, which monitors the interaction between chromosome kinetochores and spindle microtubules to prevent anaphase onset until the chromosomes are properly connected. Cells use this mechanism to prevent aneuploidy or genomic instability, and hence cancers and other human diseases like birth defects and Alzheimer's1. A number of the SAC components such as Mad1, Mad2, Bub1, BubR1, Bub3, Mps1, Zw10, Rod and Aurora B kinase have been identified and they are all kinetochore dynamic proteins2. Evidence suggests that the kinetochore is where the SAC signal is initiated. The SAC prime regulatory target is Cdc20. Cdc20 is one of the essential APC/C (Anaphase Promoting Complex or Cyclosome) activators3 and is also a kinetochore dynamic protein4-6. When activated, the SAC inhibits the activity of the APC/C to prevent the destruction of two key substrates, cyclin B and securin, thereby preventing the metaphase to anaphase transition7,8. Exactly how the SAC signal is initiated and assembled on the kinetochores and relayed onto the APC/C to inhibit its function still remains elusive.
Drosophila is an extremely tractable experimental system; a much simpler and better-understood organism compared to the human but one that shares fundamental processes in common. It is, perhaps, one of the best organisms to use for bio-imaging studies in living cells, especially for visualization of the mitotic events in space and time, as the early embryo goes through 13 rapid nuclear division cycles synchronously (8-10 minutes for each cycle at 25 &deg;C) and gradually organizes the nuclei in a single monolayer just underneath the cortex9.
Here, I present a bio-imaging method using transgenic Drosophila expressing GFP (Green Fluorescent Protein) or its variant-targeted proteins of interest and a Leica TCS SP2 confocal laser scanning microscope system to study the SAC function in flies, by showing images of GFP fusion proteins of some of the SAC components, Cdc20 and Mad2, as the example.

Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos

The kinetochore is where the SAC initiates its signal monitoring the mitotic segregation of the sister chromatids. A method is described to visualize the recruitment and turnover of one of the kinetochore proteins and its coordination with the chromosome motion in Drosophila embryos using a Leica laser scanning confocal system.

Studieren mitotischen Checkpoint durch Veranschaulichung Dynamische Kinetochor Protein Verhalten und Chromosome Motion in Lebens-<em&gt; Drosophila</em&gt; Syncytial Embryonen

The spindle assembly checkpoint (SAC) mechanism is an active signal, which monitors the interaction between chromosome kinetochores and spindle ...

Acquiring Fluorescence Time-lapse Movies of Budding Yeast and Analyzing Single-cell Dynamics using GRAFTS

Fluorescence time-lapse microscopy has become a powerful tool in the study of many biological processes at the single-cell level. In particular, movies depicting the temporal dependence of gene expression provide insight into the dynamics of its regulation; however, there are many technical challenges to obtaining and analyzing fluorescence movies of single cells. We describe here a simple protocol using a commercially available microfluidic culture device to generate such data, and a MATLAB-based, graphical user interface (GUI) -based software package to quantify the fluorescence images. The software segments and tracks cells, enables the user to visually curate errors in the data, and automatically assigns lineage and division times. The GUI further analyzes the time series to produce whole cell traces as well as their first and second time derivatives. While the software was designed for S. cerevisiae, its modularity and versatility should allow it to serve as a platform for studying other cell types with few modifications.

We present a simple protocol to obtain fluorescence microscopy movies of growing yeast cells, and a GUI-based software package to extract single-cell time series data. The analysis includes automated lineage and division time assignment integrated with visual inspection and manual curation of tracked data.

Acquiring Fluoreszenz Zeitraffer-Filme von Bäckerhefe und Analysieren von Einzel-Zell-Dynamics mit Transplantaten

Fluorescence time-lapse microscopy has become a powerful tool in the study of many biological processes at the single-cell level. In particular, movies ...

Temporal Quantification of MAPK Induced Expression in Single Yeast Cells

The quantification of gene expression at the single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements performed at the population level. Two methods based on microscopy and flow cytometry are presented to demonstrate how such data can be acquired. The expression of a fluorescent reporter induced upon activation of the high osmolarity glycerol MAPK pathway in yeast is used as an example. The specific advantages of each method are highlighted. Flow cytometry measures a large number of cells (10,000) and provides a direct measure of the dynamics of protein expression independent of the slow maturation kinetics of the fluorescent protein. Imaging of living cells by microscopy is by contrast limited to the measurement of the matured form of the reporter in fewer cells. However, the data sets generated by this technique can be extremely rich thanks to the combinations of multiple reporters and to the spatial and temporal information obtained from individual cells. The combination of these two measurement methods can deliver new insights on the regulation of protein expression by signaling pathways.

Two complementary methods based on flow cytometry and microscopy are presented which enable the quantification, at the single cell level, of the dynamics of gene expression induced by the activation of a MAPK pathway in yeast.

Zeitliche Quantifizierung der MAPK induzierte Expression in Einzel-Hefezellen

The quantification of gene expression at the  single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements  performed at the population ...

Microscopy of Fission Yeast Sexual Lifecycle

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the mechanics of cell division and cell polarity. Furthermore, classical experiments on its sexual reproduction have yielded results pivotal to current understanding of DNA recombination and meiosis. More recent analysis of fission yeast mating has raised interesting questions on extrinsic stimuli response mechanisms, polarized cell growth and cell-cell fusion. To study these topics in detail we have developed a simple protocol for microscopy of the entire sexual lifecycle. The method described here is easily adjusted to study specific mating stages. Briefly, after being grown to exponential phase in a nitrogen-rich medium, cell cultures are shifted to a nitrogen-deprived medium for periods of time suited to the stage of the sexual lifecycle that will be explored. Cells are then mounted on custom, easily built agarose pad chambers for imaging. This approach allows cells to be monitored from the onset of mating to the final formation of spores.

We provide a reproducible basic method for the long-term microscopy of the fission yeast sexual lifecycle. With minor adjustments described, the presented protocol allows research focus on different steps of the reproductive process.

Mikroskopie von Fission Yeast Sexual Lifecycle

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the ...

High-resolution Imaging and Analysis of Individual Astral Microtubule Dynamics in Budding Yeast

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells regulate these processes and how genetic mutations impact regulation. The quantification of microtubule dynamics in metazoan models has a number of associated challenges, including a high microtubule density and limitations on genetic manipulations. In contrast, the budding yeast model offers advantages that overcome these challenges. This protocol describes a method to measure the dynamics of single microtubules in living yeast cells. Cells expressing fluorescently tagged tubulin are adhered to assembled slide chambers, allowing for stable time-lapse image acquisition. A detailed guide for high-speed, four-dimensional image acquisition is also provided, as well as a protocol for quantifying the properties of dynamic microtubules in confocal image stacks. This method, combined with conventional yeast genetics, provides an approach that is uniquely suited for quantitatively assessing the effects of microtubule regulators or mutations that alter the activity of tubulin subunits.

Budding yeast is an advantageous model for studying microtubule dynamics in vivo due to its powerful genetics and the simplicity of its microtubule cytoskeleton. The following protocol describes how to transform and culture yeast cells, acquire confocal microscopy images, and quantitatively analyze microtubule dynamics in living yeast cells.

Hochauflösende Bildgebung und Analyse einzelner Astral Dynamik der Mikrotubuli in Bäckerhefe

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells ...

Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does not interfere with cell physiology, and requires minimal experimental handling. The low levels of technical interference enable researchers to study cells across multiple cycles of mitosis and to observe meiosis from beginning to end. Using fluorescent tags such as Green Fluorescent Protein (GFP) and Red Fluorescent Protein (RFP), researchers can analyze different factors whose functions are important for processes like transcription, DNA replication, cohesion, and segregation. Coupled with data analysis using Fiji (a free, optimized ImageJ version), live-cell imaging offers various ways of assessing protein movement, localization, stability, and timing, as well as nuclear dynamics and chromosome segregation. However, as is the case with other microscopy methods, live-cell imaging is limited by the intrinsic properties of light, which put a limit to the resolution power at high magnifications, and is also sensitive to photobleaching or phototoxicity at high wavelength frequencies. However, with some care, investigators can bypass these physical limitations by carefully choosing the right conditions, strains, and fluorescent markers to allow for the appropriate visualization of mitotic and meiotic events.

Here, we present live-cell imaging which is a non-toxic microscopy method that allows researchers to study protein behavior and nuclear dynamics in living fission yeast cells during mitosis and meiosis.

Untersuchung der Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics durch Fluoreszenz-Livezellmikroskopie

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does ...

Live Cell Imaging to Assess the Dynamics of Metaphase Timing and Cell Fate Following Mitotic Spindle Perturbations

Live cell time-lapse imaging is an important tool in cell biology that provides insight into cellular processes that might otherwise be overlooked, misunderstood, or misinterpreted by the fixed-cell analysis. While the fixed cell imaging and analysis is robust and sufficient to observe cellular steady-state, it can be limited in defining a temporal order of events at the cellular level and is ill-equipped to assess the transient nature of dynamic processes including mitotic progression. In contrast, live cell imaging is an eloquent tool that can be used to observe cellular processes at the single-cell level over time and has the capacity to capture the dynamics of processes that would otherwise be poorly represented in fixed cell imaging. Here we describe an approach to generate cells carrying fluorescently labeled markers of chromatin and microtubules and their use in live cell imaging approaches to monitor metaphase chromosome alignment and mitotic exit. We describe imaging-based techniques to assess the dynamics of spindle formation and mitotic progression, including the identification of cells at various stages in mitosis, identification&#160;and tracking of mitotic defects, and analysis of spindle dynamics and mitotic cell fate following the treatment with mitotic inhibitors.

Here we present a protocol to assess the dynamics of spindle formation and mitotic progression. Our application of time-lapse imaging enables the user to identify cells at various stages of mitosis, track and identify mitotic defects, and analyze spindle dynamics and mitotic cell fate upon exposure to anti-mitotic drugs.

Live Cell Imaging zur Bewertung der Dynamik von Metaphasen-Timing und Zellschicksal nach mitotischen Spindelstörungen

Live cell time-lapse imaging is an important tool in cell biology that provides insight into cellular processes that might otherwise be overlooked, ...

Use of Time-Lapse Microscopy and Stage-Specific Nuclear Depletion of Proteins to Study Meiosis in S. cerevisiae

Time-lapse fluorescence microscopy has revolutionized the understanding of meiotic cell-cycle events by providing temporal and spatial data that is often not seen by imaging fixed cells. Budding yeast has proved to be an important model organism to study meiotic chromosome segregation because many meiotic genes are highly conserved. Time-lapse microscopy of meiosis in budding yeast allows the monitoring of different meiotic mutants to show how the mutation disrupts meiotic processes. However, many proteins function at multiple points in meiosis. The use of loss-of-function or meiotic null mutants can therefore disrupt an early process, blocking or disturbing the later process and making it difficult to determine the phenotypes associated with each individual role. To circumvent this challenge, this protocol describes how the proteins can be conditionally depleted from the nucleus at specific stages of meiosis while monitoring meiotic events using time-lapse microscopy. Specifically, this protocol describes how the cells are synchronized in prophase I, how the anchor away technique is used to deplete proteins from the nucleus at specific meiotic stages, and how time-lapse imaging is used to monitor meiotic chromosome segregation. As an example of the usefulness of the technique, the kinetochore protein Ctf19 was depleted from the nucleus at different time points during meiosis, and the number of chromatin masses was analyzed at the end of meiosis II. Overall, this protocol can be adapted to deplete different nuclear proteins from the nucleus while monitoring the meiotic divisions.

Use of Time-Lapse Microscopy and Stage-Specific Nuclear Depletion of Proteins to Study Meiosis in S. cerevisiae

Time-lapse microscopy is a valuable tool for studying meiosis in budding yeast. This protocol describes a method that combines cell-cycle synchronization, time-lapse microscopy, and conditional depletion of a target protein to demonstrate how to study the function of a specific protein during meiotic chromosome segregation.

Einsatz von Zeitraffer-Mikroskopie und stadienspezifischer Kerndepletion von Proteinen zur Untersuchung der Meiose bei S. cerevisiae

Time-lapse fluorescence microscopy has revolutionized the understanding of meiotic cell-cycle events by providing temporal and spatial data that is often ...