Name: spatiotemporal analysis of cytokinetic events in fission yeast
Uploaded: 2017-02-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Spatiotemporal Analysis of Cytokinetic Events in Fission Yeast at JoVE.com

This work was supported by startup funds from The University of Tennessee and TN-SCORE, a multi-disciplinary research program sponsored by NSF-EPSCoR (EPS-1004083).

Numune hazırlanması 1. <ol><li> 8 nesiller için 32 ° C&#39;de YE sıvı ortamda mili kutup vücut işaretleyici Sad1 mCherry 23 ve tip II miyozin düzenleyici hafif zincir Rlc1-Domates 24 ifade fizyon maya hücreleri büyür. Not: sıcaklığa duyarlı mutantlar için, 25 ° C&#39;de hücreler büyür. YE 0.5 OD 600 orta log fazına hücreleri büyütün. Fisyon ilgili daha fazla bilgi için maya büyüme koşulları Bölünme maya laboratuar kılavuzuna 25 bakın. </li><li> % 0.6 agaroz ile YE (veya minimal) ortamı hazırlayın (Agaroz tabanlı medya agar göre daha az floresan arka plan göstermektedir). Erimiş ortam için askorbik asit, 1 mM (C vitamini) ekleyin. C vitamini, böylece foto-toksisite minimize foto-ağartma nedeniyle yayımlanan serbest radikalleri söndürür. </li><li> C cam dipli kültür çanak medya erimiş bağcıklı vitamin 4 ml - 3 dökün. Medya soğuması ve katılaşması. NOT:Kültür kabı cam kalınlığı mikroskop için uygun kapak kayma kalınlığına bağlıdır. Burada, kullanım lamel sayılı 1.5. </li><li> Yavaşça keskin bir neşter yardımıyla kültürü çanak katılaşmış medyayı yükseltmek. Medya levha ve çanak (Şekil 1) geri düşmesini slab önlemek için kültür çanak arasında bir pipet yerleştirin. </li><li> Yukarıda 1.1&#39;de tarif edildiği gibi, taze büyüyen hücreler 1 ml al. 30 saniye boyunca 300 xg&#39;de hafifçe hücreleri dönerler. süpernatant atın. Süpernatant çıkarıldıktan sonra bir tüp içinde kalan artık araçlar az miktarda hücrelerin tekrar. </li><li> Yük 2 - Medya levha ve kültür çanak cam alt kısmı arasında yeniden süspanse hücre kültürü 5 uL. Hücreler cam olmalıdır. medya ve çanak arasına yerleştirilen pipet hücre kültürü kolay yükleme sağlar. </li><li> Çok nazikçe cu orijinal konumuna geri medya levha pipet kaldırmak ve yerleştirmeklture çanak. herhangi bir hava kabarcıklarını önlemek için emin olun. Eğer nazikçe medya levhanın üstünde bir pipet arka kaydırarak hava kabarcıkları dışarı basınız gerekmez. </li><li> Hücreler mikroskopi yapılacaktır hangi sıcaklığında 30 dakika karanlıkta saatlik bir ila kültür kabı bekletin. hücreler için büyüme koşullarında değişiklik nedeniyle bu herhangi çarpmasını önlemek için önemlidir. </li></ol> 2. Görüntü Alma <ol><li> Kültür tabağına camın dış tarafında bir damla yağ yerleştirin. ters bir mikroskop kültür çanak yerleştirin. </li><li> (- 535 nm 520) dar bir dalga boyu aralığında bir GFP filtresi kullanın YE medyanın oto floresan en aza indirmek için. </li><li> Hücrelerin medial düzlem üzerinde odaklanın ve onlar çok kalabalık iyi aralıklı ve değil emin olun. Hücre döngüsünün uygun aşamasında hücrelerin görüntü alımı başlatabilirsiniz emin olun. Bu deney için, geç G2 hücreleri izleyin. </li><li> Görüntü elde etme yazılımı t Programo GFP, RFP ve hücrelerin DIC görüntüleri çekmek. <ol><li> Bu deneme için DIC için 100 ms pozlama süresi ve GFP ve RFP filtreleri için 75 ms pozlama süresi kullanın. Pozlama süresi mikroskop, çalışma kapsamında protein ve deney süresince ayarlarına bağlıdır. Verilen mikroskop ayarları için,% 50 lazer gücünü kullanın. </li><li> 3 boyutlu, Z-ölçekli görüntüleme için bir program görüntü elde etme yazılımı görüntü yakalamak için. Hücrelerin odak noktası noktası etrafında 0.4 mikron bir adım boyutu ve 3.0 mikron (toplam z yarısı) bir mesafe kullanın. Bu 6 um&#39;lik bir toplam Z mesafesi zaman noktası başına 16 Z-kare yakalama yol açar. NOT: Z-serisi görüntü elde etme iğ kutup organları yakalama sağlar. </li></ol></li><li> görüntüleri her 2 dakika sürer. Deneyin ihtiyaçlarına göre pozlama süresini değiştirin. maruz kalma süresi de ilgi ve sinyal gücü proteine ​​göre değiştirilebilir. Ancak, bu kısa noter aralıklar veya ağartmaya Pozlama süresi daha uzun bir artış verilmedi-toksisite ve dolayısıyla hücreleri sadece kısa bir süre için takip edilebilir. </li><li> DIC görüntüleri gözlenen fiziksel olarak ayrı hücrelere kadar görüntüleri Edinme veya 90 dakika sonra satın durdurmak için yazılım programı. </li></ol> 3. Görüntü Analizi <ol><li> Cytokinetic olayların zamansal analizi <ol><li> görüntü elde etme yazılımı kullanarak her zaman noktası için Z-kare projeksiyonlar yapmak. elde edilen görüntünün her dalga boyu için farklı dosyaları olun. </li><li> Bir .tiff dosyası olarak projeksiyon zaman noktası serisi ihraç ediyoruz. </li><li> ImageJ yazılımı kullanarak görüntüleri analiz edin. dalga boyu herhangi birinin resim serisi açın. </li><li> Bir hücreyi seçin çalışılacak. Araç çubuğunun satırı seçeneğiyle çift tıklayın. Bu hat genişliğini ayarlamak için başka bir pencere açılacaktır. Hücre genişliğine karşılık çizgi genişliğini ayarlayın. 50 piksel - WT hücre için bu yaklaşık 40 olduğunu. boyunca bir çizgi çizinilgili hücrenin uzun ekseni. </li><li> Analiz&gt; Araçlar&gt; ROI yöneticisi tıklayın ve eklenti tıklayın. Bu, daha sonra kullanılmak üzere ROI penceresine seçilen satır eklemek olacaktır. Bu pencereyi kapatma. </li><li> Düzelt&gt; ilgi resmin üzerine tıklayın ve Düzenle&gt; Seçimi seçin. Bu başka bir pencere açılacaktır. &quot;Tüm yığını Süreç&quot; kontrol edin. Bu yatay hücre düzeltmek olacaktır. </li><li> Görüntü tıklayın&gt;&gt; Transform 90 Derece Sağ çevirin. Bu görüntü artık dikey doğruldu edilir. </li><li> Görüntü üzerine tıklayın&gt; Yığınlar&gt; Montage olun. Bu yığını için satır ve sütun numarası atamak için bir pencere açılacak, görüntü boyutu için ölçek faktörü, montaj için ilk ve son dilim (çerçeve) ve montaj için çerçeve artış. Etiket dilimleri kontrol edin ve butonu tıklayın. </li><li> ilgi hücrenin montajı ile bir pencere gösterildiği gibi, diğer dalga boyu için görüntü serilerini açın. </li><li> ROI yöneticisi hat tanımlayıcı tıklayın. Bu seçecekİkinci resim dosyası aynı hücre. 3.1.8 - Tekrar 3.1.6 adımları. Bu ikinci görüntünün montaj açılacaktır. </li><li> iğ kutup vücut işaretleyici Sad1 mCherry ile resim üzerinde, iğ kutup vücut marker ayrılması başlangıcı için bakmak ve zaman 0 olarak o zaman noktasını işaretlemek. </li><li> zamanla resmin üzerine Rlc1-Domates sinyalini takip ve Rlc1-Domates yamalar karşı ayrı bir çizgi olarak görünür sinyal arayın. Bu zaman noktası actomyosin halka montaj / olgunlaşma safhasının başlangıcında tamamlandığını göstermektedir. </li><li> Rlc1-Domates halka boyutunun küçülmesine başladığında zamanla film boyunca Sonraki kaydırma belirlemek için. Bu halka daralma olgunlaşma aşaması / başlangıçlı sonu olarak işaretlenir. </li><li> hücre ekseni ortasında bir nokta olarak görünene kadar daralma boyunca zamanla Rlc1-Domates sinyalini takip edin. Bu septum Ingression&#39;a halka daralma / sonu sonu olarak işaretlenir. </li><li> DIC görüntüleri montaj ardından, nihai hücre belirlemekayırma. Hücre fiziksel olarak ayıran zaman zaman noktasını kaydedin. </li><li> iğ kutup vücut ayrılması için ImageJ satırı aracını kullanarak zaman içinde iki iğ kutup organları arasındaki mesafeyi ölçün. zamanla mili kutup vücudun mesafeyi çizilir. </li><li> Farklı cytokinetic olaylar her cytokinetic fazın süresini hesaplamak ve zamanla mili kutup vücut ayrılması ile karşılaştırmak için farklı zaman noktaları kaydedin. </li></ol></li><li> Cytokinetic olayların mekansal analizi <ol><li> Görünür actomyosin halkası ile bir hücre seçin. ImageJ araç çubuğunun satırı seçeneğiyle çift tıklayın. Bu hat genişliğini ayarlamak için başka bir pencere açılacaktır. (- 20 piksel 15) halka kalınlığına karşılık çizgi genişliğini ayarlayın. halka tüm kalınlığını sağlamak için özen halka boyunca bir çizgi çizin dahildir. </li><li> Analiz&gt; Araçlar&gt; ROI yöneticisi tıklayın ve eklenti tıklayın. Bu, daha sonra kullanılmak üzere ROI penceresine seçilen satır eklemek olacaktır.Bu pencereyi kapatma. </li><li> Düzelt&gt; ilgi resmin üzerine tıklayın ve Düzenle&gt; Seçimi seçin. Bu başka bir pencere açılacaktır. &quot;Tüm yığını Süreç&quot; kontrol edin. Bu yatay halka düzeltmek olacaktır. </li><li> Image kullanarak (3.1.6 itibaren) doğruldu z yığın parlak uçağın yoğunluğunu Reset&gt; Ayarla&gt; Parlaklık / Kontrast&gt; sıfırlayın. </li><li> sekmesine Stk&gt; 3D Projesi tıklayın. Bu bir iletişim kutusu açılacaktır. Parlak Point projeksiyon yöntemi ve 2 ya da 3 piksel Dilim aralığını değiştirmek. Son olarak, X veya Y ekseni dönme değişikliği ekseni (bu arzu edilen görüş açısına bağlı olarak değişecektir), katmak tıklayın ve görüntünün 3D projeksiyon oluşturmak için Tamam&#39;a tıklayın. Görüntüyü döndürmek için resmin altındaki kaydırma çubuğunu kullanın. </li><li> ImageJ kullanarak diğer dalga boyu için görüntü serisi açın. </li><li> ROI yöneticisi hat tanımlayıcı tıklayın. Bu ikinci resim dosyası aynı halka seçecektir. Tekrarlayın 4.2.4 ve 4.2.5 adımları.Bu, diğer dalga boyuna sahip görüntüde 3 boyutlu halka açılacaktır. </li><li> açık hem 3D görüntü halkaları, Kanallar Merge&gt; Renk&gt; Görüntü tıklayın. Bu bir kutu açılacaktır. İstenen renge karşılık gelen açılır menüden her görüntüyü seçin ve Tamam&#39;a tıklayın. Bu, farklı dalga boylarında görüntü hem de bir kompozit açılacaktır. </li><li> cytokinetic ring lokalizasyon açısından veya ingressing membran ile farklı belirteçlerin lokalizasyonu karşılaştırın. Rlc1-GFP cytokinetic halka için bir göstergedir. proteinler ingressing zarı lokalize Rlc1-GFP sinyal arkasında lokalize iken Proteinler ko-lokalize Rlc1-GFP ile halka lokalize. Not: ilgili protein halkası markör daha farklı bir floroforla olması gerekmektedir. </li><li> Tüm sitokinez yoluyla proteinlerin mekansal yerelleştirme karşılaştırmak için sitokinez farklı aşamalarında 3 boyutlu halkaları oluşturmak. </li></ol></li><li> Protein göre dağılımın analizicytokinetic ring Katkı <ol><li> halka proteini dağılımının varyans katsayısı ölçümü boyunca karşılaştırmak ve proteinlerin dağılımını analiz etmek. Yüksek katsayısı varyans bölümü sitenin boyunca proteinlerin eşitsiz dağılımını gösterir ve faz görüntülü veya analiz edildiği bağlı, yanlış halka montaj, olgunlaşma ya da septum oluşumu göstermektedir. </li><li> (3.2.2 itibaren) 3 boyutlu yeniden cytokinetic halkasını kullanarak, halka dörtte her kadranda görünür şekilde en az 4 parçaya bölünür görüntüyü bölün. Bunun için resmin üzerine dik çizgiler çizmek için satırı aracını kullanın. her satır için tıklayın Image sonra&gt; Yerleşimi&gt; seçimi ekleme veya kısa kesilmiş Ctrl + B kullanın. </li><li> &gt; Set ölçümü Analiz gidin. Açılan kutuda ortalama gri değeri seçin. Tamam&#39;a tıklayın. </li><li> kılavuzları bir dikdörtgen dikdörtgen aracını kullanarak her kadranı tanımlamak için çizerken yukarıda çizilen çizgiler kullanarak. </li><li> Her kadranda, tıklama ortalama yoğunluğunu ölçmek içinAnaliz üzerinde&gt; ölçün ya da kestirme Ctrl + M kullanın. </li><li> Dört çeyrek daire için ortalama gri değeri (MG 1 -MG 4) kaydediniz. </li><li> Arka plan seçimi gibi halka dışında her kadranda küçük bir alan seçin. </li><li> Dört çeyrek daire için arka plan seçimi için ortalama gri değeri (BG 1 -BG 4) ölçün. </li><li> Her kadranda (IRQ) içinde = halka Şiddeti: formülasyonu MG 1 -Ortalama (BG 4 BG 1) Aşağıdaki her bir çeyrek kullanım için arka plan çıkarma için li&gt;. Bu aşamada 4 IRQ değerleri, her kadranda için bir tane vardır. </li><li> / Ortalama (IRQ 1: IRQ 4): Sonraki aşağıdaki formülasyonlar Standart sapma kullanılarak her halka için (IRQ 4 IRQ 1) varyans katsayısını hesaplamak. her bir suş için Varyans ortalama Co-verimli hesaplamak ve diğer suşları karşılaştırın. NOT: kontrollere ind kıyasla gerginlik varyansın katsayısı istatistiksel olarak anlamlı bir artışsitokinez bu aşamada bölünme sitesi boyunca düzensiz protein dağıtım / teslimat icates. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanics+of+cytokinesis+in+eukaryotes.">Mechanics of cytokinesis in eukaryotes.</a> Curr Opin Cell Biol. 22 (1), 50-56 (2010).</li><li>Guertin, D. A., Trautmann, S., McCollum, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokinesis+in+eukaryotes.">Cytokinesis in eukaryotes.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 66 (2), 155-178 (2002).</li><li>Xu, X., Vogel, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+secreted+protein+promotes+cleavage+furrow+maturation+during+cytokinesis.">A secreted protein promotes cleavage furrow maturation during cytokinesis.</a> Curr Biol. 21 (2), 114-119 (2011).</li><li>Sagona, A. P., Stenmark, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokinesis+and+cancer.">Cytokinesis and cancer.</a> FEBS Lett. 584 (12), 2652-2661 (2010).</li><li>Fujiwara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokinesis+failure+generating+tetraploids+promotes+tumorigenesis+in+p53-null+cells.">Cytokinesis failure generating tetraploids promotes tumorigenesis in p53-null cells.</a> Nature. 437 (7061), 1043-1047 (2005).</li><li>Li, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokinesis+in+development+and+disease:+variations+on+a+common+theme.">Cytokinesis in development and disease: variations on a common theme.</a> Cell Mol Life Sci. 64 (23), 3044-3058 (2007).</li><li>Daniels, M. J., Wang, Y., Lee, M., Venkitaraman, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+cytokinesis+in+cells+deficient+in+the+breast+cancer+susceptibility+protein+BRCA2.">Abnormal cytokinesis in cells deficient in the breast cancer susceptibility protein BRCA2.</a> Science. 306 (5697), 876-879 (2004).</li><li>Storchova, Z., Pellman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+polyploidy+to+aneuploidy,+genome+instability+and+cancer.">From polyploidy to aneuploidy, genome instability and cancer.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 5 (1), 45-54 (2004).</li><li>Lee, I. J., Coffman, V. C., Wu, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contractile-ring+assembly+in+fission+yeast+cytokinesis:+Recent+advances+and+new+perspectives.">Contractile-ring assembly in fission yeast cytokinesis: Recent advances and new perspectives.</a> Cytoskeleton (Hoboken). 69 (10), 751-763 (2012).</li><li>Balasubramanian, M. K., Bi, E., Glotzer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+cytokinesis+in+budding+yeast,+fission+yeast+and+animal+cells.">Comparative analysis of cytokinesis in budding yeast, fission yeast and animal cells.</a> Curr Biol. 14 (18), R806-R818 (2004).</li><li>Proctor, S. A., Minc, N., Boudaoud, A., Chang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contributions+of+turgor+pressure,+the+contractile+ring,+and+septum+assembly+to+forces+in+cytokinesis+in+fission+yeast.">Contributions of turgor pressure, the contractile ring, and septum assembly to forces in cytokinesis in fission yeast.</a> Curr Biol. 22 (17), 1601-1608 (2012).</li><li>Munoz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+cell+wall+beta(1,3)glucan+is+required+to+couple+septation+to+actomyosin+ring+contraction.">Extracellular cell wall beta(1,3)glucan is required to couple septation to actomyosin ring contraction.</a> J Cell Biol. 203 (2), 265-282 (2013).</li><li>Wang, N., Lee, I. J., Rask, G., Wu, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+the+TRAPP-II+Complex+and+the+Exocyst+in+Membrane+Deposition+during+Fission+Yeast+Cytokinesis.">Roles of the TRAPP-II Complex and the Exocyst in Membrane Deposition during Fission Yeast Cytokinesis.</a> PLoS Biol. 14 (4), e1002437 (2016).</li><li>Liu, J., Wang, H., McCollum, D., Balasubramanian, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drc1p/Cps1p,+a+1,3-beta-glucan+synthase+subunit,+is+essential+for+division+septum+assembly+in+Schizosaccharomyces+pombe.">Drc1p/Cps1p, a 1,3-beta-glucan synthase subunit, is essential for division septum assembly in Schizosaccharomyces pombe.</a> Genetics. 153 (3), 1193-1203 (1999).</li><li>Cortes, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+(1,3)beta-D-glucan+synthase+subunit+Bgs1p+is+responsible+for+the+fission+yeast+primary+septum+formation.">The (1,3)beta-D-glucan synthase subunit Bgs1p is responsible for the fission yeast primary septum formation.</a> Mol Microbiol. 65 (1), 201-217 (2007).</li><li>Cortes, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperation+between+Paxillin-like+Protein+Pxl1+and+Glucan+Synthase+Bgs1+Is+Essential+for+Actomyosin+Ring+Stability+and+Septum+Formation+in+Fission+Yeast.">Cooperation between Paxillin-like Protein Pxl1 and Glucan Synthase Bgs1 Is Essential for Actomyosin Ring Stability and Septum Formation in Fission Yeast.</a> PLoS Genet. 11 (7), e1005358 (2015).</li><li>Cortes, J. C., Ishiguro, J., Duran, A., Ribas, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+the+(1,3)beta-D-glucan+synthase+catalytic+subunit+homologue+Bgs1p/Cps1p+from+fission+yeast+suggests+that+it+is+involved+in+septation,+polarized+growth,+mating,+spore+wall+formation+and+spore+germination.">Localization of the (1,3)beta-D-glucan synthase catalytic subunit homologue Bgs1p/Cps1p from fission yeast suggests that it is involved in septation, polarized growth, mating, spore wall formation and spore germination.</a> J Cell Sci. 115 (Pt 21), 4081-4096 (2002).</li><li>Liu, J., Tang, X., Wang, H., Oliferenko, S., Balasubramanian, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+localization+of+the+integral+membrane+protein+Cps1p+to+the+cell+division+site+is+dependent+on+the+actomyosin+ring+and+the+septation-inducing+network+in+Schizosaccharomyces+pombe.">The localization of the integral membrane protein Cps1p to the cell division site is dependent on the actomyosin ring and the septation-inducing network in Schizosaccharomyces pombe.</a> Mol Biol Cell. 13 (3), 989-1000 (2002).</li><li>Royou, A., Field, C., Sisson, J. C., Sullivan, W., Karess, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reassessing+the+role+and+dynamics+of+nonmuscle+myosin+II+during+furrow+formation+in+early+Drosophila+embryos.">Reassessing the role and dynamics of nonmuscle myosin II during furrow formation in early Drosophila embryos.</a> Mol Biol Cell. 15 (2), 838-850 (2004).</li><li>Figard, L., Xu, H., Garcia, H. G., Golding, I., Sokac, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+plasma+membrane+flattens+out+to+fuel+cell-surface+growth+during+Drosophila+cellularization.">The plasma membrane flattens out to fuel cell-surface growth during Drosophila cellularization.</a> Dev Cell. 27 (6), 648-655 (2013).</li><li>Wei, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unique+Spatiotemporal+Activation+Pattern+of+Cdc42+by+Gef1+and+Scd1+Promotes+Different+Events+during+Cytokinesis.">Unique Spatiotemporal Activation Pattern of Cdc42 by Gef1 and Scd1 Promotes Different Events during Cytokinesis.</a> Mol Biol Cell. , (2016).</li><li>Nabeshima, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+centromeres+during+metaphase-anaphase+transition+in+fission+yeast:+Dis1+is+implicated+in+force+balance+in+metaphase+bipolar+spindle.">Dynamics of centromeres during metaphase-anaphase transition in fission yeast: Dis1 is implicated in force balance in metaphase bipolar spindle.</a> Mol Biol Cell. 9 (11), 3211-3225 (1998).</li><li>Johnson, A. E., Gould, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dma1+ubiquitinates+the+SIN+scaffold,+Sid4,+to+impede+the+mitotic+localization+of+Plo1+kinase.">Dma1 ubiquitinates the SIN scaffold, Sid4, to impede the mitotic localization of Plo1 kinase.</a> EMBO J. 30 (2), 341-354 (2011).</li><li>Yonetani, A., Chang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cytokinesis+by+the+formin+cdc12p.">Regulation of cytokinesis by the formin cdc12p.</a> Curr Biol. 20 (6), 561-566 (2010).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fission Yeast: A laboratory Manual. , (2016).</li><li>Hachet, O., Simanis, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mid1p/anillin+and+the+septation+initiation+network+orchestrate+contractile+ring+assembly+for+cytokinesis.">Mid1p/anillin and the septation initiation network orchestrate contractile ring assembly for cytokinesis.</a> Genes Dev. 22 (22), 3205-3216 (2008).</li><li>Zhou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contractile+ring+coordinates+curvature-dependent+septum+assembly+during+fission+yeast+cytokinesis.">The contractile ring coordinates curvature-dependent septum assembly during fission yeast cytokinesis.</a> Mol Biol Cell. 26 (1), 78-90 (2015).</li><li>Chen, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lattice+light-sheet+microscopy:+imaging+molecules+to+embryos+at+high+spatiotemporal+resolution.">Lattice light-sheet microscopy: imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution.</a> Science. 346 (6208), 1257998 (2014).</li><li>Huang, Y. S., Karashima, T., Yamamoto, M., Hamaguchi, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular-level+investigation+of+the+structure,+transformation,+and+bioactivity+of+single+living+fission+yeast+cells+by+time-+and+space-resolved+Raman+spectroscopy.">Molecular-level investigation of the structure, transformation, and bioactivity of single living fission yeast cells by time- and space-resolved Raman spectroscopy.</a> Biochemistry. 44 (30), 10009-10019 (2005).</li><li>Huang, C. K., Ando, M., Hamaguchi, H. O., Shigeto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disentangling+dynamic+changes+of+multiple+cellular+components+during+the+yeast+cell+cycle+by+in+vivo+multivariate+Raman+imaging.">Disentangling dynamic changes of multiple cellular components during the yeast cell cycle by in vivo multivariate Raman imaging.</a> Anal Chem. 84 (13), 5661-5668 (2012).</li><li>Le Goff, X., Woollard, A., Simanis, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+cps1+gene+provides+evidence+for+a+septation+checkpoint+in+Schizosaccharomyces+pombe.">Analysis of the cps1 gene provides evidence for a septation checkpoint in Schizosaccharomyces pombe.</a> Mol Gen Genet. 262 (1), 163-172 (1999).</li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının beyan ederim.

Burada bir zamansal bir şekilde fisyon maya cytokinetic olayları incelemek için bir protokol tanımlanmıştır. Burada açıklanan protokol birbirine göre farklı cytokinetic olayların zamansal çözünürlüğü sağlar; Protein alımı veya cytokinetic faza referansla kaybı zamanlaması; sitokinez farklı aşamalarında halkanın yapısı; ve mitoz referansla sitokinez ilerlemesi. Bu protokol sayesinde hassas ve böylece farklı cytokinetic aşamalarında yer proteinlerin daha ayrıntılı bir anlayış sağlay...

Sitokinez, hücre bölünmesi son adımı, bir organizmanın uygun farklılaşması, geliştirme ve hayatta kalmak için karmaşık bir süreçtir esastır. Sitokinez genomik bütünlüğünü 1 korurken başarılı hücre ayrımı sağlamak için düzenlenen birden fazla etkinlik içerir. Sitokinez kez oluşturulan bir aktomiyosin halkası son olarak hücreyi absisyon 1, 2, 3, ardından membran genişleme ve yarıklar, ve hücre dışı matriks yeniden modellenmesi ile eş zamanlı bir daralma, maruz etkinlikleri kapsar. Cytokinetic olayların yanlış organizasyon hücre ayırma ve Ploidi kusurlarına yol açabilir ve kanser 4, 5, 6, 7, 8 gibi hastalıklara neden olabilir. etkinleştirmek temel ilkeler ocytokinetic olayların rganization iyi böylece bu hastalıkların etiyolojisinde anlayışımız içinde barikatlar yol anlaşılamamıştır. Yank mayası Schizosaccharomyces pombe (S. pombe) nedeniyle 1 ilgili proteinlerin korunmuş doğası sitokinezi incelemek için mükemmel bir model sistemidir. Fizyon maya, halka düzeneğini actomyosin sonra, halka bu 9 sıkmak olmayan bir olgunlaşma / bekleme aşamaya girer. Olgunlaşma membran furrowing ve septum Ingression&#39;a ile eş zamanlı actomyosin halka daralmasının, başlaması ile sona erer. Yılda seminal iş fisyon maya 1, 9, 10, bize actomyosin halka montaj oldukça iyi bir anlayış verdik. füzyon maya da dahil olmak üzere, bazı ökaryotlarda ise, aktomiyosin halkasının başarılı bir montaj membran yarıklar için yeterli değildir. fission maya halka daralması, tek başına veya ark oluşumu 11 iç turgor basıncının üstesinden gelmek için yeterli bir kuvvet sağlamamaktadır. Son zamanlarda modeli bu kuvvet yerine septum Ingression&#39;a 11 tarafından sağlanır belirtir. Başka bir modelde, plazma membranı uzantısı rolü oluşumu 12, 13 karık katkıda önerilmiştir. Halka konstriksiyon ve membran yarıklar Bgs1 / CPS1 ısıya duyarlı bir mutant cps1-191 primer septum oluşumu 14, 15 için büyük bir enzim meydana gelmez. Bgs1 eksik Hücreler arızalı birincil septum ve uzun süreli halka daralma 15, 16 göstermektedir. Bgs1 halka takımını 17, 18 actomyosin sonra olgunlaşma sırasında septum Ingression&#39;a için hücre bölünmesi sitesine işe alınır. Similarly Drosophila embriyolar Hücreselleştirmeden sırasında, halka daralma fisyon maya gözlenen olgunlaşma evresini benzeyen bir ölçüde yavaş başlangıç daralma oranı 19 ile bifazik olduğunu. Bifazik halka daralma yeterli membran genişleme 20 ve hücre dışı matris modifikasyonu için izin vermek için membran furrowing yavaşlatabilir. Bu halka düzeneğini actomyosin sonra, halka daralma hücre karık oluşumu için gereksinimleri tatmin etti verimli yalnızca oluşur düşündürmektedir. İyi actomyosin halka halka montaj sonrası daralma, ne de bu süreci düzenleyen moleküler olaylar için gerekli olan hangi koşullar anlaşılamamıştır. Biz son zamanlarda actomyosin halka aşağıdaki montaj küçük GTPaz Cdc42 eşsiz uzaysal aktivasyon deseni 21 uğradığını göstermiştir. Bu model Cdc42 guanidin nükleotid değişimi faktörlerin benzersiz yerelleştirme deseni (tarafından kurulmuşturCdc42 aktive gefs). GEF Gef1 monte aktomiyosin halkasına lokalize ve SCD1 furrowing membrana lokalize ve normal septum oluşumu teşvik ederken, halka daralmasının ve septum Ingression&#39;a başlamasını teşvik eder. Biz onun gefs tarafından kurulan Cdc42 aktivasyon deseni farklı cytokinetic olayların düzenlenmesinde yol açtığını bulmak. Sonunda actomyosin halka montaj aşağıdaki hücre ayrılmasına neden olayların moleküler mekanizmasını anlamak için, bir zaman ve mekan içinde farklı cytokinetic olayları takip etmek gerekiyor. fizyon maya, sitokinez ilk sonunda tip II miyozinin, formin Cdc12 ve actomyosin halka montaj için gerekli olan diğer proteinleri işe çekirdeğin etrafında habercisi düğümleri, montajını kapsamaktadır. Zaman farklı cytokinetic olaylar ve referans çerçevesi sağlamak, iğ kutup vücut belirteçleri (iğ oluşumu) ayrılması zaman 0 22 olarak kabul edilir. th montajıe aktomiyosin halkasının bir floresan etiketli aktomiyosin halkası protein yoğunluğu tip II miyosin regülatör hafif zincir Rlc1 zamanla izlenmesi ile takip edilebilir. Burada zamanla sitokinez farklı aşamalarını analiz etmek için bir mikroskopik yaklaşım açıklar.

<table><tbody><tr><td>Yeast extract media</td><td>Sunrise Science Products</td><td>YES 225</td><td>0.5% w/v yeast extract, 3% w/v glucose, 225mg/L adenine, histidine, leucine, uracil, and lysine</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>SeaKem LE agarose, Lonza</td><td>50001</td><td></td></tr><tr><td>Ascorbic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4544</td><td></td></tr><tr><td>Glass Bottomed culture dish</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td>Coverslip No. 1.5 was used. This will vary as per the microscope specifications used.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>VT-Hawk 2D array laser scanning confocal microscopy system</td><td>Visitech International, UK</td><td></td><td>with an Olympus IX-83 inverted microscope with a 100X / numerical aperture 1.49 UAPO lens (Olympus) and EM-CCD digital camera (Hamamatsu).&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td>Image analysis software</td></tr></tbody></table>

spatiotemporal analysis of cytokinetic events in fission yeast

Sitokinler, hücre bölünmesi son aşama genom bütünlüğünü korumak için önemlidir. Uygun sitokinez hücre farklılaşması ve gelişimi için önemlidir. Sitokinez iyi zaman ve mekan içinde koordine edilmiş bir dizi etkinlik gerektirir. Sitokinez halka daralmasının, membran karık oluşumu ve hücre dışı matriks yeniden izledi bölünme yerinde bir actomyosin halkasının oluşumunu kapsar. Fisyon maya, Schizosaccharomyces pombe (S. pombe) önemli bir açıklıkla sitokinez ilk olaylar ortaya koymuştur iyi çalışılmış bir model sistemidir. Ancak, biz cytokinetic olaylar spatiotemporally koordine açıkça nasıl farklı anlamıyorum. Bunu belirlemek için, bir hem zaman ve uzayda büyük ayrıntılarda farklı cytokinetic olayları analiz gerekiyor. Burada farklı cytokinetic EV incelemek için bir mikroskop yaklaşımı tanımlamakCanlı hücrelerdeki hastalar. Bu yaklaşımla farklı cytokinetic olayları zaman ve sitokinez sırasında farklı proteinlerin işe zamanını belirlemek mümkündür. Buna ek olarak, hücre bölünmesinin yerinde protein lokalizasyonu ve dağıtım karşılaştırma protokolleri açıklanmıştır. Bu füzyon mayada sitokinezi çalışma için temel bir protokoldür ve diğer maya ve mantar sistemleri için de kullanılabilir.

Halka işaretleyiciyi ifade füzyon maya hücreleri, Rlc1-GFP (yeşil, Şekil 2) ve iğ cisimciği kutup gövdesi markör Sad1 mCherry (kırmızı, Şekil 2) sitokinez sırasında görüntülenmiştir. Iğ kutup vücut marker Başlangıcı (kırmızı ok 2A, 2B Rakamlar) 0 Rlc1-GFP sinyali kutup vücut ayrımını mili referansla zaman -4 dk görünen zaman olarak kabul edilir (beyaz ok, B, 2A Şekiller). Rlc1-GFP sinyali actomyosin halk...

Watch this Scientific Journal Video about Spatiotemporal Analysis of Cytokinetic Events in Fission Yeast at JoVE.com

Spatiotemporal Analysis of Cytokinetic Events in Fission Yeast

Fisyon maya, Schizosaccharomyces pombe sitokinezi incelemek için mükemmel bir model sistemi, hücre bölünmesi son aşamasıdır. Burada canlı fisyon maya hücreleri farklı cytokinetic olayları analiz etmek için bir mikroskop yaklaşım açıklar.

Fisyon Maya Cytokinetic Olayların zamanmekansal Analizi

Cytokinesis, the final step in cell division is critical for maintaining genome integrity. Proper cytokinesis is important for cell differentiation and ...

spatiotemporal-analysis-of-cytokinetic-events-in-fission-yeast

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

7.3K Görüntüleme.  University of Tennessee.  Fisyon maya, Schizosaccharomyces pombe sitokinezi incelemek için mükemmel bir model sistemi, hücre bölünmesi son aşamasıdır. Burada canlı fisyon maya hücreleri farklı cytokinetic olayları analiz etmek için bir mikroskop yaklaşım açıklar. 

Video: Spatiotemporal Analysis of Cytokinetic Events in Fission Yeast

Measuring Replicative Life Span in the Budding Yeast

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has been used extensively to study the biology of aging, and several determinants of yeast longevity have been shown to be conserved in multicellular eukaryotes, including worms, flies, and mice 1. Due to the lack of easily quantified age-associated phenotypes, aging in yeast has been assayed almost exclusively by measuring the life span of cells in different contexts, with two different life span paradigms in common usage 2. Chronological life span refers to the length of time that a mother cell can survive in a non-dividing, quiescence-like state, and is proposed to serve as a model for aging of post-mitotic cells in multicellular eukaryotes. Replicative life span, in contrast, refers the number of daughter cells produced by a mother cell prior to senescence, and is thought to provide a model of aging in mitotically active cells. Here we present a generalized protocol for measuring the replicative life span of budding yeast mother cells. The goal of the replicative life span assay is to determine how many times each mother cell buds. The mother and daughter cells can be easily differentiated by an experienced researcher using a standard light microscope (total magnification 160X), such as the Zeiss Axioscope 40 or another comparable model. Physical separation of daughter cells from mother cells is achieved using a manual micromanipulator equipped with a fiber-optic needle. Typical laboratory yeast strains produce 20-30 daughter cells per mother and one life span experiment requires 2-3 weeks.

In this article we present a general protocol for measuring the replicative life span of yeast mother cells.

Geliştirici Maya replikatif Ömrü Ölçüm

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding ...

Biyoloji

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using fluorochromes like Green Fluorescent Protein (GFP) directly attached to the protein of interest has become increasingly popular 1. Using GFP and similar fluorochromes the subcellular localisations and movements of proteins can be detected in a fluorescent microscope. Moreover, also the subnuclear localisation of a certain region of a chromosome can be studied using this technique. GFP is fused to the Lac Repressor protein (LacR) and ectopically expressed in the cell where tandem repeats of the lacO sequence has been inserted into the region of interest on the chromosome2. The LacR-GFP will bind to the lacO repeats and that area of the genome will be visible as a green dot in the fluorescence microscope. Yeast is especially suited for this type of manipulation since homologous recombination is very efficient and thereby enables targeted integration of the lacO repeats and engineered fusion proteins with GFP 3. Here we describe a quantitative method for live cell analysis of fission yeast. Additional protocols for live cell analysis of fission yeast can be found, for example on how to make a movie of the meiotic chromosomal behaviour 4. In this particular experiment we focus on subnuclear organisation and how it is affected during gene induction. We have labelled a gene cluster, named Chr1, by the introduction of lacO binding sites in the vicinity of the genes. The gene cluster is enriched for genes that are induced early during nitrogen starvation of fission yeast 5. In the strain the nuclear membrane (NM) is labelled by the attachment of mCherry to the NM protein Cut11 giving rise to a red fluorescent signal. The Spindle Pole body (SPB) compound Sid4 is fused to Red Fluorescent Protein (Sid4-mRFP) 6. In vegetatively growing yeast cells the centromeres are always attached to the SPB that is embedded in the NM 7. The SPB is identified as a large round structure in the NM. By imaging before and 20 minutes after depletion of the nitrogen source we can determine the distance between the gene cluster (GFP) and the NM/SPB. The mean or median distances before and after nitrogen depletion are compared and we can thus quantify whether or not there is a shift in subcellular localisation of the gene cluster after nitrogen depletion.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, is a good model system to study basic cellular processes. Here we describe a method to perform quantitative live cell analysis of fission yeast. In this particular experiment we focus on organisation of the genome within the cell nucleus, but the method can also be used to study cytosolic factors.

Fisyon Maya Kantitatif Canlı Hücre Floresan mikroskopi Analizi

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos

The spindle assembly checkpoint (SAC) mechanism is an active signal, which monitors the interaction between chromosome kinetochores and spindle microtubules to prevent anaphase onset until the chromosomes are properly connected. Cells use this mechanism to prevent aneuploidy or genomic instability, and hence cancers and other human diseases like birth defects and Alzheimer's1. A number of the SAC components such as Mad1, Mad2, Bub1, BubR1, Bub3, Mps1, Zw10, Rod and Aurora B kinase have been identified and they are all kinetochore dynamic proteins2. Evidence suggests that the kinetochore is where the SAC signal is initiated. The SAC prime regulatory target is Cdc20. Cdc20 is one of the essential APC/C (Anaphase Promoting Complex or Cyclosome) activators3 and is also a kinetochore dynamic protein4-6. When activated, the SAC inhibits the activity of the APC/C to prevent the destruction of two key substrates, cyclin B and securin, thereby preventing the metaphase to anaphase transition7,8. Exactly how the SAC signal is initiated and assembled on the kinetochores and relayed onto the APC/C to inhibit its function still remains elusive.
Drosophila is an extremely tractable experimental system; a much simpler and better-understood organism compared to the human but one that shares fundamental processes in common. It is, perhaps, one of the best organisms to use for bio-imaging studies in living cells, especially for visualization of the mitotic events in space and time, as the early embryo goes through 13 rapid nuclear division cycles synchronously (8-10 minutes for each cycle at 25 &deg;C) and gradually organizes the nuclei in a single monolayer just underneath the cortex9.
Here, I present a bio-imaging method using transgenic Drosophila expressing GFP (Green Fluorescent Protein) or its variant-targeted proteins of interest and a Leica TCS SP2 confocal laser scanning microscope system to study the SAC function in flies, by showing images of GFP fusion proteins of some of the SAC components, Cdc20 and Mad2, as the example.

Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos

The kinetochore is where the SAC initiates its signal monitoring the mitotic segregation of the sister chromatids. A method is described to visualize the recruitment and turnover of one of the kinetochore proteins and its coordination with the chromosome motion in Drosophila embryos using a Leica laser scanning confocal system.

Living Görselleştirilmesi Dinamik Kinetochore Protein Davranış ve Kromozom Hareket tarafından Mitotik Checkpoint incelenmesi<em&gt; Drosophila</em&gt; Sinsityal Embriyolar

The spindle assembly checkpoint (SAC) mechanism is an active signal, which monitors the interaction between chromosome kinetochores and spindle ...

Acquiring Fluorescence Time-lapse Movies of Budding Yeast and Analyzing Single-cell Dynamics using GRAFTS

Fluorescence time-lapse microscopy has become a powerful tool in the study of many biological processes at the single-cell level. In particular, movies depicting the temporal dependence of gene expression provide insight into the dynamics of its regulation; however, there are many technical challenges to obtaining and analyzing fluorescence movies of single cells. We describe here a simple protocol using a commercially available microfluidic culture device to generate such data, and a MATLAB-based, graphical user interface (GUI) -based software package to quantify the fluorescence images. The software segments and tracks cells, enables the user to visually curate errors in the data, and automatically assigns lineage and division times. The GUI further analyzes the time series to produce whole cell traces as well as their first and second time derivatives. While the software was designed for S. cerevisiae, its modularity and versatility should allow it to serve as a platform for studying other cell types with few modifications.

We present a simple protocol to obtain fluorescence microscopy movies of growing yeast cells, and a GUI-based software package to extract single-cell time series data. The analysis includes automated lineage and division time assignment integrated with visual inspection and manual curation of tracked data.

Tomurcuklanma Maya Floresan Time-lapse Filmler Kazanılması ve GREFTLERİ kullanarak Tek hücreli Dynamics analiz

Fluorescence time-lapse microscopy has become a powerful tool in the study of many biological processes at the single-cell level. In particular, movies ...

Temporal Quantification of MAPK Induced Expression in Single Yeast Cells

The quantification of gene expression at the single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements performed at the population level. Two methods based on microscopy and flow cytometry are presented to demonstrate how such data can be acquired. The expression of a fluorescent reporter induced upon activation of the high osmolarity glycerol MAPK pathway in yeast is used as an example. The specific advantages of each method are highlighted. Flow cytometry measures a large number of cells (10,000) and provides a direct measure of the dynamics of protein expression independent of the slow maturation kinetics of the fluorescent protein. Imaging of living cells by microscopy is by contrast limited to the measurement of the matured form of the reporter in fewer cells. However, the data sets generated by this technique can be extremely rich thanks to the combinations of multiple reporters and to the spatial and temporal information obtained from individual cells. The combination of these two measurement methods can deliver new insights on the regulation of protein expression by signaling pathways.

Two complementary methods based on flow cytometry and microscopy are presented which enable the quantification, at the single cell level, of the dynamics of gene expression induced by the activation of a MAPK pathway in yeast.

Tek Maya Hücreleri MAPK İsteyerek İfade zamansal Kantitasyonu

The quantification of gene expression at the  single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements  performed at the population ...

Microscopy of Fission Yeast Sexual Lifecycle

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the mechanics of cell division and cell polarity. Furthermore, classical experiments on its sexual reproduction have yielded results pivotal to current understanding of DNA recombination and meiosis. More recent analysis of fission yeast mating has raised interesting questions on extrinsic stimuli response mechanisms, polarized cell growth and cell-cell fusion. To study these topics in detail we have developed a simple protocol for microscopy of the entire sexual lifecycle. The method described here is easily adjusted to study specific mating stages. Briefly, after being grown to exponential phase in a nitrogen-rich medium, cell cultures are shifted to a nitrogen-deprived medium for periods of time suited to the stage of the sexual lifecycle that will be explored. Cells are then mounted on custom, easily built agarose pad chambers for imaging. This approach allows cells to be monitored from the onset of mating to the final formation of spores.

We provide a reproducible basic method for the long-term microscopy of the fission yeast sexual lifecycle. With minor adjustments described, the presented protocol allows research focus on different steps of the reproductive process.

Bölünme Maya Cinsel Yaşam Döngüsü Mikroskopi

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the ...

High-resolution Imaging and Analysis of Individual Astral Microtubule Dynamics in Budding Yeast

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells regulate these processes and how genetic mutations impact regulation. The quantification of microtubule dynamics in metazoan models has a number of associated challenges, including a high microtubule density and limitations on genetic manipulations. In contrast, the budding yeast model offers advantages that overcome these challenges. This protocol describes a method to measure the dynamics of single microtubules in living yeast cells. Cells expressing fluorescently tagged tubulin are adhered to assembled slide chambers, allowing for stable time-lapse image acquisition. A detailed guide for high-speed, four-dimensional image acquisition is also provided, as well as a protocol for quantifying the properties of dynamic microtubules in confocal image stacks. This method, combined with conventional yeast genetics, provides an approach that is uniquely suited for quantitatively assessing the effects of microtubule regulators or mutations that alter the activity of tubulin subunits.

Budding yeast is an advantageous model for studying microtubule dynamics in vivo due to its powerful genetics and the simplicity of its microtubule cytoskeleton. The following protocol describes how to transform and culture yeast cells, acquire confocal microscopy images, and quantitatively analyze microtubule dynamics in living yeast cells.

Yüksek çözünürlüklü görüntüleme ve Bireysel Astral Mikrotubul Dynamics Analizi Budding Maya

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells ...

Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does not interfere with cell physiology, and requires minimal experimental handling. The low levels of technical interference enable researchers to study cells across multiple cycles of mitosis and to observe meiosis from beginning to end. Using fluorescent tags such as Green Fluorescent Protein (GFP) and Red Fluorescent Protein (RFP), researchers can analyze different factors whose functions are important for processes like transcription, DNA replication, cohesion, and segregation. Coupled with data analysis using Fiji (a free, optimized ImageJ version), live-cell imaging offers various ways of assessing protein movement, localization, stability, and timing, as well as nuclear dynamics and chromosome segregation. However, as is the case with other microscopy methods, live-cell imaging is limited by the intrinsic properties of light, which put a limit to the resolution power at high magnifications, and is also sensitive to photobleaching or phototoxicity at high wavelength frequencies. However, with some care, investigators can bypass these physical limitations by carefully choosing the right conditions, strains, and fluorescent markers to allow for the appropriate visualization of mitotic and meiotic events.

Here, we present live-cell imaging which is a non-toxic microscopy method that allows researchers to study protein behavior and nuclear dynamics in living fission yeast cells during mitosis and meiosis.

Floresans canlı hücre mikroskobu ile mitotik ve meiotic Fission Maya nükleer dinamiklerinin incelenmesi

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does ...

Live Cell Imaging to Assess the Dynamics of Metaphase Timing and Cell Fate Following Mitotic Spindle Perturbations

Live cell time-lapse imaging is an important tool in cell biology that provides insight into cellular processes that might otherwise be overlooked, misunderstood, or misinterpreted by the fixed-cell analysis. While the fixed cell imaging and analysis is robust and sufficient to observe cellular steady-state, it can be limited in defining a temporal order of events at the cellular level and is ill-equipped to assess the transient nature of dynamic processes including mitotic progression. In contrast, live cell imaging is an eloquent tool that can be used to observe cellular processes at the single-cell level over time and has the capacity to capture the dynamics of processes that would otherwise be poorly represented in fixed cell imaging. Here we describe an approach to generate cells carrying fluorescently labeled markers of chromatin and microtubules and their use in live cell imaging approaches to monitor metaphase chromosome alignment and mitotic exit. We describe imaging-based techniques to assess the dynamics of spindle formation and mitotic progression, including the identification of cells at various stages in mitosis, identification&#160;and tracking of mitotic defects, and analysis of spindle dynamics and mitotic cell fate following the treatment with mitotic inhibitors.

Here we present a protocol to assess the dynamics of spindle formation and mitotic progression. Our application of time-lapse imaging enables the user to identify cells at various stages of mitosis, track and identify mitotic defects, and analyze spindle dynamics and mitotic cell fate upon exposure to anti-mitotic drugs.

Mitotik Mil Pertürbasyonları Sonrası Metafaz Zamanlaması ve Hücre KaderiniN Dinamiği Nin Dinamiği Nin Dinamitini Değerlendirmek Için Canlı Hücre Görüntülemesi

Live cell time-lapse imaging is an important tool in cell biology that provides insight into cellular processes that might otherwise be overlooked, ...

Use of Time-Lapse Microscopy and Stage-Specific Nuclear Depletion of Proteins to Study Meiosis in S. cerevisiae

Time-lapse fluorescence microscopy has revolutionized the understanding of meiotic cell-cycle events by providing temporal and spatial data that is often not seen by imaging fixed cells. Budding yeast has proved to be an important model organism to study meiotic chromosome segregation because many meiotic genes are highly conserved. Time-lapse microscopy of meiosis in budding yeast allows the monitoring of different meiotic mutants to show how the mutation disrupts meiotic processes. However, many proteins function at multiple points in meiosis. The use of loss-of-function or meiotic null mutants can therefore disrupt an early process, blocking or disturbing the later process and making it difficult to determine the phenotypes associated with each individual role. To circumvent this challenge, this protocol describes how the proteins can be conditionally depleted from the nucleus at specific stages of meiosis while monitoring meiotic events using time-lapse microscopy. Specifically, this protocol describes how the cells are synchronized in prophase I, how the anchor away technique is used to deplete proteins from the nucleus at specific meiotic stages, and how time-lapse imaging is used to monitor meiotic chromosome segregation. As an example of the usefulness of the technique, the kinetochore protein Ctf19 was depleted from the nucleus at different time points during meiosis, and the number of chromatin masses was analyzed at the end of meiosis II. Overall, this protocol can be adapted to deplete different nuclear proteins from the nucleus while monitoring the meiotic divisions.

Use of Time-Lapse Microscopy and Stage-Specific Nuclear Depletion of Proteins to Study Meiosis in S. cerevisiae

Time-lapse microscopy is a valuable tool for studying meiosis in budding yeast. This protocol describes a method that combines cell-cycle synchronization, time-lapse microscopy, and conditional depletion of a target protein to demonstrate how to study the function of a specific protein during meiotic chromosome segregation.

S. cerevisiae'de Mayozu İncelemek için Hızlandırılmış Mikroskopi ve Proteinlerin Aşamaya Özgü Nükleer Tükenmesinin Kullanılması

Time-lapse fluorescence microscopy has revolutionized the understanding of meiotic cell-cycle events by providing temporal and spatial data that is often ...