This work was supported by startup funds from The University of Tennessee and TN-SCORE, a multi-disciplinary research program sponsored by NSF-EPSCoR (EPS-1004083).

1. הכנת המדגם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדל תאים שמרים ביקוע להביע את הסמן בגוף מוט ציר Sad1-mCherry 23 שרשרת אור רגולטוריות מסוג II שרירן 24 Rlc1-עגבניות בתקשורת נוזלת YE ב 32 מעלות צלזיוס למשך 8 דורות. הערה: לקבלת מוטנטים רגישים לטמפרטורה, לגדל תאים של 25 מעלות צלזיוס. לגדל תאים לשלב יומן האמצע כדי OD 600 של 0.5 YE. למידע נוסף על תנאי גידול שמרים ביקוע לעיין במדריך מעבדה שמרים ביקוע 25. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן YE (או מינימאלית) תקשורת עם 0.6% agarose (מבוסס Agarose תקשורת להראות רקע פלורסנט פחות בהשוואה אגר). לתקשורת המומסת להוסיף 1 מ&quot;מ של חומצה אסקורבית (ויטמין C). ויטמין C מרווית רדיקלים חופשיים המשתחררים עקב צילום לבן, ובכך לצמצם רעילות צילום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים 3 - 4 מ&quot;ל של ויטמין C שילב נמס התקשורת על צלחת תרבות תחתית זכוכית. תן מגניב מדיה לחזק. הערה:עובי הזכוכית בצלחת התרבות תלוי בעובי להחליק הכיסוי מתאים המיקרוסקופ. הנה, מס coverslip השימוש 1.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להעלות התקשורת הקרושה מצלחת התרבות בעזרת אזמל חד. מניח קצה פיפטה בין לוח התקשורת ואת מנת התרבות למנוע הלוח מהנפילה בחזרה לתוך הצלחת (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח 1 מ&quot;ל של תאים טרי גדל כמתואר 1.1 לעיל. ספין התאים בעדינות XG ב 300 במשך 30 s. בטל supernatant. Resuspend התאים כמות קטנה של התקשורת שיורית שנשאר בצינור לאחר השלכת supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען 2 - 5 μL של תרבית תאים מושעה בין לוח התקשורת ואת תחתית הזכוכית של מנת התרבות. התאים צריכים להיות על הזכוכית. קצה פיפטה ממוקם בין התקשורת לבין הצלחת מאפשר טעינה קלה של תרבית התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מאוד בעדינות להסיר את קצה פיפטה ומקום לוח התקשורת בחזרה למקומו המקורי על המ&quot;קצלחת lture. הקפד למנוע בועות אוויר. אם יהיה בכך צורך ללחוץ את בועות אוויר בעדינות על ידי הזזה האחורי של קצה פיפטה על גבי לוח התקשורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו התאים לשבת בצלחת התרבות למשך 30 דקות עד שעה אחת בחושך בטמפרטורה שבה מיקרוסקופיה תבוצע. זה חשוב כדי למנוע זעזועים עקב שינוי בתנאי הגידול של התאים. </li></ol> 2. Image Acquisition <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח טיפת שמן על הצד החיצוני של הזכוכית על צלחת התרבות. מניחים את צלחת תרבות על מיקרוסקופ הפוכה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למזער קרינה אוטומטית של תקשורת YE להשתמש במסנן GFP עם טווח אורכי גל צר (520 - 535 ננומטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגש על המטוס המדיאלי של התאים ולהבטיח כי הם מרווחים היטב ולא צפופים מדי. הקפד להתחיל רכישת תמונה של התאים בשלב המתאים של מחזור התא. לצורך ניסוי זה, בצע את התאים מפני G2 מאוחר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתכנת את t תוכנת רכישת התמונהo לקחת GFP, RFP ותמונות DIC של התאים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצורך ניסוי זה לנצל את זמן חשיפת 100 ms עבור דסק&quot;ש 75 ms זמן חשיפה למסנני GFP ו RFP. זמן החשיפה תלוי בהגדרות של המיקרוסקופ, החלבון נחקר ואת תקופת הניסוי. לקבלת הגדרות מיקרוסקופ הנתונה, להשתמש כוח ליזר 50%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי ללכוד תמונות ב 3 מימדים, תוכנית התוכנה רכישת התמונה עבור הדמיה בקנה מידה Z. השתמש גודל צעד של 0.4 מיקרומטר ו במרחק של 3.0 מיקרומטר (מחצית z סה&quot;כ) סביב נקודת המיקוד המרכזית של התאים. זה מוביל את לכידתו של 16 Z-מסגרות לכל נקודת זמן, תוך שמירת מרחק Z סך של 6 מיקרומטר. הערה: רכישת תמונת Z-series מאפשרת ללכוד של גופי מוט הציר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח תמונות כל 2 דקות. שנה את זמן החשיפה בהתאם לדרישות של הניסוי. זמן החשיפה ניתן גם לשנות בהתאם את החלבון של עניין עוצמת אות. עם זאת, יש לציין כי קצראה במרווחים או חשיפה ארוכה יותר זמן עלייה רעיל צילום בשל הלבנה ומכאן תאים ניתן בעקבות רק לזמן קצר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש תמונות עד התא פיזי הנפרד כפי שנצפה על ידי תמונות דסק&quot;ש, או לתכנת את התוכנה כדי לעצור רכישה לאחר 90 דקות. </li></ol> ניתוח תמונה 3. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח זמני של אירועי cytokinetic <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השימוש בתוכנת רכישת תמונה עושה תחזיות של המסגרות-Z עבור כל נקודת זמן. הפוך קבצים שונים עבור כל אורך גל של תמונה הנרכשת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייצא היטל זה סדרות עתיות נקודות כקובץ .tiff. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את התמונות באמצעות תוכנת ImageJ. פתח את סדרת תמונה עבור כל אחד של אורכי גל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר תא להיחקר. לחץ לחיצה כפולה על אפשרות הקו של סרגל כלים. פעולה זו תפתח חלון נוסף כדי להתאים את רוחב קו. לשנות את עובי הקו להתכתב לרוחב התא. עבור תא WT מדובר 40 - 50 פיקסלים. צייר קו לאורךציר זמן של התא של עניין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקש על לנתח&gt; כלים&gt; מנהל ROI ולחץ על הרחבה. זה יוסיף את הקו הנבחר אל חלון ROI לשימוש מאוחר יותר. אל תסגור חלון זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על התמונה של עניין ובחר ערוך&gt; בחירה&gt; יישר. פעולה זו תפתח חלון נוסף. בדוק &quot;תהליך הערימה כולה&quot;. זה יישר את התא באופן אופקי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על תמונה&gt; Transform&gt; סובב 90 מעלות ימינה. תמונה זו כעת יישר אנכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על תמונה&gt; סטאקס&gt; הפוך Montage. פעולה זו תפתח חלון להקצות את מספר שורות ועמודות עבור מחסנית, הגורם בקנה מידה בהתאם לגודל התמונה, את הפרוסה הראשונה והאחרונה (מסגרת) עבור מונטאז והתוספת מסגרת עבור מונטאז. בדוק פרוסות תווית, והקש על Enter. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כחלון עם מונטאז &#39;של תא העניין מוצג, פתח את סדרת התמונה עבור אחרים הגל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקישו על מזהה קו על מנהל ROI. זה יבחרבאותו התא על קובץ התמונה השני. חזור על שלבי 3.1.6 - 3.1.8. פעולה זו תפתח מונטאז &#39;של התמונה השנייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על התמונה עם סמן גוף מוט ציר Sad1-mCherry, לחפש הופעת פרידה של הסמן בגוף מוט ציר ולסמן כי נקודת הזמן ככל שזמן 0. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את האות Rlc1-עגבניות על התמונה לאורך זמן ולחפש את האות שמופיעה כקו מובהק בניגוד כתמי Rlc1-עגבניות. זמן-נקודה זו מסמנת השלמת הרכבת טבעת actomyosin / תחילת שלב הבשלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגלילה הבאה דרך הסרט לאורך זמן כדי לקבוע מתי טבעת Rlc1-העגבניות מתחילה ירידה בגודל. זה מסומן כמו הסוף של התבגרות שלב / תחילת התכווצות טבעת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את האות Rlc1-עגבניות לאורך זמן לאורך התכווצות עד להופעתה כנקודה באמצע ציר התא. זה מסומן כמו סוף טבעת התכווצות / סוף ingression מחץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות מונטאז &#39;של תמונות DIC, לקבוע את התא הסופיהַפרָדָה. רשום את נקודת הזמן כאשר התא מפריד פיזי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור הפרדת גוף מוט ציר למדוד את המרחק בין שני גופי מוט הציר לאורך זמן באמצעות כלי שורת ImageJ. מגרש את המרחק בגוף מוט ציר לאורך זמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רשום את זמן נקודות השונות לאירועי cytokinetic השונים לחישוב משך כל שלב cytokinetic ולהשוות עם פרדת גוף מוט ציר לאורך זמן. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח מרחבים של אירועי cytokinetic <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר תא עם טבעת actomyosin גלויה. לחץ לחיצה כפולה על אפשרות הקו של סרגל כלי ImageJ. פעולה זו תפתח חלון נוסף כדי להתאים את רוחב קו. לשנות את עובי הקו כדי מתאים עובי הטבעת (15 - 20 פיקסלים). צייר קו לאורך הטבעת מקפידה להבטיח את כל העובי של הטבעת כלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקש על לנתח&gt; כלים&gt; מנהל ROI ולחץ על הרחבה. זה יוסיף את הקו הנבחר אל חלון ROI לשימוש מאוחר יותר.אל תסגור חלון זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על התמונה של עניין ובחר ערוך&gt; בחירה&gt; יישר. פעולה זו תפתח חלון נוסף. בדוק &quot;תהליך הערימה כולה&quot;. זה יישר את הטבעת אופקית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפס את עוצמת המטוס הבהיר ביותר Z- מחסנית יישר (מ 3.1.6) באמצעות תמונה&gt; התאם&gt; בהירות / ניגודיות&gt; איפוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקש על הכרטיסייה STK&gt; פרויקט 3D. פעולה זו תפתח תיבת דו-שיח. שנה את שיטת ההקרנה כדי צבע הבהיר ואת המרווח הפרוס 2 או 3 פיקסלים. לבסוף, שינוי ציר הסיבוב כדי X או ציר Y (זה ישתנה בהתאם לזווית הצפייה הרצויה), לחץ לשרבב ולחץ על אישור כדי ליצור השלכת 3D של התמונה. השתמש בפס הגלילה מתחת לתמונה כדי לסובב את התמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את סדרת תמונה עבור אחרים גל באמצעות ImageJ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקישו על מזהה קו על מנהל ROI. זה יבחר את אותה טבעת על קובץ התמונה השנייה. חזור על שלבים 4.2.4 ו 4.2.5.פעולה זו תפתח טבעת 3 ממדים בתמונה עם אחרים הגל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם טבעות תמונת 3D של חלל פתוח, לחץ על תמונה&gt; צבע&gt; Merge ערוצים. פעולה זו תפתח תיבה. בחר כל תמונה מתוך התפריט הנפתח עבור הצבע המתאים הרצוי ולחץ על אישור. פעולה זו תפתח מרוכבים הן של תמונות באורכי גל שונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השווה את הלוקליזציה של סמנים שונים לגבי לוקליזציה בטבעת cytokinetic או קרום ingressing. Rlc1-GFP הוא סמן את הטבעת cytokinetic. חלבונים שיתוף לוקליזציה עם Rlc1-GFP למקם את הזירה, בעוד חלבונים לוקליזציה מאחורי האות Rlc1-GFP למקם את הממברנה ingressing. הערה: החלבון של עניין צריך להיות של fluorophore שונה מזו של סמן הטבעת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור 3 טבעות ממדיות במהלך שלבים שונים של cytokinesis להשוות הלוקליזציה המרחבי של החלבונים כל דרך cytokinesis. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח של distri חלבוןbution בטבעת cytokinetic <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להשוות ולנתח הפצה של חלבונים לאורך הטבעת למדוד את השיתוף היעיל של שונות של חלוקת חלבון. עמית יעיל גבוה מהשונות מציין חלוקה לא שווה של חלבונים לאורך באתר החלוק ומציע טבעת הרכבה פסולה, התבגרות או היווצרות מחץ, תלוי באיזה שלב הוא צלם או מנותח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות 3 טבעת cytokinetic משוחזרת ממדי (מ 3.2.2), לחלק את התמונה לתוך 4 רביעים לפחות כך רבע הטבעת מופיע בכל רבע. לשם כך השתמש בכלי הקו לצייר קווים ניצבים על התמונה. לאחר כל תמונה בלחיצת קו&gt; שכבה &lt;הוספת בחירה או להשתמש ב Ctrl + קיצור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור אל לנתח&gt; מדידת גדר. בחר ערך אפור ממוצע בתיבה שנפתחת. לחץ על אישור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות הקווים נמשכים מעל כמדריכים לצייר מלבן להגדיר בכל רבע השימוש באפשרות המלבנת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למדוד את עוצמת הממוצע של כל רביע, לחץעל נתח&gt; מדוד או להשתמש לגזור קצר Ctrl + M. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רשום את הערך האפור הממוצע עבור כל ארבעת הרביעים (MG 1 -MG 4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר אזור קטן בכל רבע מחוץ לזירה כמו בחירה ברקע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד ערך אפור ממוצע לבחירת רקע עבור כל ארבעת הרביעים (BG 1 -BG 4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> li&gt; עבור חיסור רקע עבור כל שימוש ברבע הבאות הניסוח MG 1 -Average (BG 1: BG 4) = אינטנסיביות של הטבעת בכל רבע (IRQ). בשלב זה יש 4 ערכים IRQ, אחד לכל ברבע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הבא לחשב את המקדם שונה עבור כל טבעת באמצעות סטיית התקן את הניסוח הבא (IRQ 1: IRQ 4) / ממוצע (IRQ 1: IRQ 4). חישוב ממוצע שיתוף היעיל של וריאנס עבור כל זן ולהשוות לצלילים האחרים. הערה: עלייה משמעותית סטטיסטית שיתוף יעיל של מהשונות זן בהשוואה לקבוצת ביקורת INDicates הספקות הפצה / חלבון אחידה לאורך באתר החטיבה באותו שלב של cytokinesis. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanics+of+cytokinesis+in+eukaryotes.">Mechanics of cytokinesis in eukaryotes.</a> Curr Opin Cell Biol. 22 (1), 50-56 (2010).</li><li>Guertin, D. A., Trautmann, S., McCollum, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokinesis+in+eukaryotes.">Cytokinesis in eukaryotes.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 66 (2), 155-178 (2002).</li><li>Xu, X., Vogel, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+secreted+protein+promotes+cleavage+furrow+maturation+during+cytokinesis.">A secreted protein promotes cleavage furrow maturation during cytokinesis.</a> Curr Biol. 21 (2), 114-119 (2011).</li><li>Sagona, A. P., Stenmark, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokinesis+and+cancer.">Cytokinesis and cancer.</a> FEBS Lett. 584 (12), 2652-2661 (2010).</li><li>Fujiwara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokinesis+failure+generating+tetraploids+promotes+tumorigenesis+in+p53-null+cells.">Cytokinesis failure generating tetraploids promotes tumorigenesis in p53-null cells.</a> Nature. 437 (7061), 1043-1047 (2005).</li><li>Li, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokinesis+in+development+and+disease:+variations+on+a+common+theme.">Cytokinesis in development and disease: variations on a common theme.</a> Cell Mol Life Sci. 64 (23), 3044-3058 (2007).</li><li>Daniels, M. J., Wang, Y., Lee, M., Venkitaraman, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+cytokinesis+in+cells+deficient+in+the+breast+cancer+susceptibility+protein+BRCA2.">Abnormal cytokinesis in cells deficient in the breast cancer susceptibility protein BRCA2.</a> Science. 306 (5697), 876-879 (2004).</li><li>Storchova, Z., Pellman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+polyploidy+to+aneuploidy,+genome+instability+and+cancer.">From polyploidy to aneuploidy, genome instability and cancer.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 5 (1), 45-54 (2004).</li><li>Lee, I. J., Coffman, V. C., Wu, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contractile-ring+assembly+in+fission+yeast+cytokinesis:+Recent+advances+and+new+perspectives.">Contractile-ring assembly in fission yeast cytokinesis: Recent advances and new perspectives.</a> Cytoskeleton (Hoboken). 69 (10), 751-763 (2012).</li><li>Balasubramanian, M. K., Bi, E., Glotzer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+cytokinesis+in+budding+yeast,+fission+yeast+and+animal+cells.">Comparative analysis of cytokinesis in budding yeast, fission yeast and animal cells.</a> Curr Biol. 14 (18), R806-R818 (2004).</li><li>Proctor, S. A., Minc, N., Boudaoud, A., Chang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contributions+of+turgor+pressure,+the+contractile+ring,+and+septum+assembly+to+forces+in+cytokinesis+in+fission+yeast.">Contributions of turgor pressure, the contractile ring, and septum assembly to forces in cytokinesis in fission yeast.</a> Curr Biol. 22 (17), 1601-1608 (2012).</li><li>Munoz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+cell+wall+beta(1,3)glucan+is+required+to+couple+septation+to+actomyosin+ring+contraction.">Extracellular cell wall beta(1,3)glucan is required to couple septation to actomyosin ring contraction.</a> J Cell Biol. 203 (2), 265-282 (2013).</li><li>Wang, N., Lee, I. J., Rask, G., Wu, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+the+TRAPP-II+Complex+and+the+Exocyst+in+Membrane+Deposition+during+Fission+Yeast+Cytokinesis.">Roles of the TRAPP-II Complex and the Exocyst in Membrane Deposition during Fission Yeast Cytokinesis.</a> PLoS Biol. 14 (4), e1002437 (2016).</li><li>Liu, J., Wang, H., McCollum, D., Balasubramanian, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drc1p/Cps1p,+a+1,3-beta-glucan+synthase+subunit,+is+essential+for+division+septum+assembly+in+Schizosaccharomyces+pombe.">Drc1p/Cps1p, a 1,3-beta-glucan synthase subunit, is essential for division septum assembly in Schizosaccharomyces pombe.</a> Genetics. 153 (3), 1193-1203 (1999).</li><li>Cortes, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+(1,3)beta-D-glucan+synthase+subunit+Bgs1p+is+responsible+for+the+fission+yeast+primary+septum+formation.">The (1,3)beta-D-glucan synthase subunit Bgs1p is responsible for the fission yeast primary septum formation.</a> Mol Microbiol. 65 (1), 201-217 (2007).</li><li>Cortes, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperation+between+Paxillin-like+Protein+Pxl1+and+Glucan+Synthase+Bgs1+Is+Essential+for+Actomyosin+Ring+Stability+and+Septum+Formation+in+Fission+Yeast.">Cooperation between Paxillin-like Protein Pxl1 and Glucan Synthase Bgs1 Is Essential for Actomyosin Ring Stability and Septum Formation in Fission Yeast.</a> PLoS Genet. 11 (7), e1005358 (2015).</li><li>Cortes, J. C., Ishiguro, J., Duran, A., Ribas, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+the+(1,3)beta-D-glucan+synthase+catalytic+subunit+homologue+Bgs1p/Cps1p+from+fission+yeast+suggests+that+it+is+involved+in+septation,+polarized+growth,+mating,+spore+wall+formation+and+spore+germination.">Localization of the (1,3)beta-D-glucan synthase catalytic subunit homologue Bgs1p/Cps1p from fission yeast suggests that it is involved in septation, polarized growth, mating, spore wall formation and spore germination.</a> J Cell Sci. 115 (Pt 21), 4081-4096 (2002).</li><li>Liu, J., Tang, X., Wang, H., Oliferenko, S., Balasubramanian, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+localization+of+the+integral+membrane+protein+Cps1p+to+the+cell+division+site+is+dependent+on+the+actomyosin+ring+and+the+septation-inducing+network+in+Schizosaccharomyces+pombe.">The localization of the integral membrane protein Cps1p to the cell division site is dependent on the actomyosin ring and the septation-inducing network in Schizosaccharomyces pombe.</a> Mol Biol Cell. 13 (3), 989-1000 (2002).</li><li>Royou, A., Field, C., Sisson, J. C., Sullivan, W., Karess, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reassessing+the+role+and+dynamics+of+nonmuscle+myosin+II+during+furrow+formation+in+early+Drosophila+embryos.">Reassessing the role and dynamics of nonmuscle myosin II during furrow formation in early Drosophila embryos.</a> Mol Biol Cell. 15 (2), 838-850 (2004).</li><li>Figard, L., Xu, H., Garcia, H. G., Golding, I., Sokac, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+plasma+membrane+flattens+out+to+fuel+cell-surface+growth+during+Drosophila+cellularization.">The plasma membrane flattens out to fuel cell-surface growth during Drosophila cellularization.</a> Dev Cell. 27 (6), 648-655 (2013).</li><li>Wei, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unique+Spatiotemporal+Activation+Pattern+of+Cdc42+by+Gef1+and+Scd1+Promotes+Different+Events+during+Cytokinesis.">Unique Spatiotemporal Activation Pattern of Cdc42 by Gef1 and Scd1 Promotes Different Events during Cytokinesis.</a> Mol Biol Cell. , (2016).</li><li>Nabeshima, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+centromeres+during+metaphase-anaphase+transition+in+fission+yeast:+Dis1+is+implicated+in+force+balance+in+metaphase+bipolar+spindle.">Dynamics of centromeres during metaphase-anaphase transition in fission yeast: Dis1 is implicated in force balance in metaphase bipolar spindle.</a> Mol Biol Cell. 9 (11), 3211-3225 (1998).</li><li>Johnson, A. E., Gould, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dma1+ubiquitinates+the+SIN+scaffold,+Sid4,+to+impede+the+mitotic+localization+of+Plo1+kinase.">Dma1 ubiquitinates the SIN scaffold, Sid4, to impede the mitotic localization of Plo1 kinase.</a> EMBO J. 30 (2), 341-354 (2011).</li><li>Yonetani, A., Chang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cytokinesis+by+the+formin+cdc12p.">Regulation of cytokinesis by the formin cdc12p.</a> Curr Biol. 20 (6), 561-566 (2010).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fission Yeast: A laboratory Manual. , (2016).</li><li>Hachet, O., Simanis, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mid1p/anillin+and+the+septation+initiation+network+orchestrate+contractile+ring+assembly+for+cytokinesis.">Mid1p/anillin and the septation initiation network orchestrate contractile ring assembly for cytokinesis.</a> Genes Dev. 22 (22), 3205-3216 (2008).</li><li>Zhou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contractile+ring+coordinates+curvature-dependent+septum+assembly+during+fission+yeast+cytokinesis.">The contractile ring coordinates curvature-dependent septum assembly during fission yeast cytokinesis.</a> Mol Biol Cell. 26 (1), 78-90 (2015).</li><li>Chen, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lattice+light-sheet+microscopy:+imaging+molecules+to+embryos+at+high+spatiotemporal+resolution.">Lattice light-sheet microscopy: imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution.</a> Science. 346 (6208), 1257998 (2014).</li><li>Huang, Y. S., Karashima, T., Yamamoto, M., Hamaguchi, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular-level+investigation+of+the+structure,+transformation,+and+bioactivity+of+single+living+fission+yeast+cells+by+time-+and+space-resolved+Raman+spectroscopy.">Molecular-level investigation of the structure, transformation, and bioactivity of single living fission yeast cells by time- and space-resolved Raman spectroscopy.</a> Biochemistry. 44 (30), 10009-10019 (2005).</li><li>Huang, C. K., Ando, M., Hamaguchi, H. O., Shigeto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disentangling+dynamic+changes+of+multiple+cellular+components+during+the+yeast+cell+cycle+by+in+vivo+multivariate+Raman+imaging.">Disentangling dynamic changes of multiple cellular components during the yeast cell cycle by in vivo multivariate Raman imaging.</a> Anal Chem. 84 (13), 5661-5668 (2012).</li><li>Le Goff, X., Woollard, A., Simanis, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+cps1+gene+provides+evidence+for+a+septation+checkpoint+in+Schizosaccharomyces+pombe.">Analysis of the cps1 gene provides evidence for a septation checkpoint in Schizosaccharomyces pombe.</a> Mol Gen Genet. 262 (1), 163-172 (1999).</li></ol>

המחברים מצהירים שום אינטרסים כלכליים מתחרים.

כאן יש לנו תיאר פרוטוקול ללמוד אירועים cytokinetic בשמרים ביקוע באופן זמני. הפרוטוקול המתואר כאן מספק פתרון זמני של אירועי cytokinetic שונים תוך התייחסות לזה; עיתוי גיוס חלבון או הפסד תוך התייחסות לשלב cytokinetic; מבנה הטבעת לאורך השלבים השונים של cytokinesis; וכן את התקדמות cytokinesis בהתיי?...

Cytokinesis, השלב האחרון חלוקת תא, הוא חיוני תהליך מורכב לבידול נכון, פיתוח, והישרדות של אורגניזם. Cytokinesis כרוך אירועים מרובים, מבעוד מועד, להבטיח הפרדת תא מוצלחת תוך שמירה על שלמות הגנומי 1. Cytokinesis כרוך אירועים שבו טבעת actomyosin פעם התאספה עוברת מועקה, שהוא בו זמנית עם התרחבות קרום וחורש, שיפוץ מטריצה הסלולר תאי, ולבסוף ואחריו תא כריתה 1, 2, 3. ארגון נכון של אירועי cytokinetic יכול להוביל למומי הפרדת ploidy תא, ועלול לגרום למחלות כמו הסרטן 4, 5, 6, 7, 8. עקרונות היסוד המאפשרים organization של אירועים cytokinetic אינם מובנים היטב, ובכך מובילה מחסומים בהבנתנו את האטיולוגיה של מחלות אלו. שמר החלוקה שמרים ביקוע (pombe ס) הוא מערכת מודל מצוינת ללמוד cytokinesis בשל האופי המשומר של חלבוני המעורבים 1. בשמרי ביקוע, לאחר actomyosin הרכבת טבעת, הטבעת נכנסת לשלב התבגרות / להתעכב שם זה לא להצר 9. הבשלה מסתיימת חניכה של מועקת טבעת actomyosin, במקביל תִלוּם הממברנה ingression מחץ. זרעי עבודה לאורך השנים נתנה לנו הבנה טובה למדי של טבעת הרכבת actomyosin ב ביקוע שמרים 1, 9, 10. אאוקריוטים מסוימים, כולל שמרים ביקוע, הרכבה מוצלחת של טבעת actomyosin אינו מספיק עבור תִלוּם הממברנה. ב fשמרים ission, כיווץ טבעת לבדו אינו מספק כוח מספיק כדי להתגבר על לחץ טורגור פנימי תלם היווצרות 11. הדגם אחרון עולה כי כוח זה מסופק במקום על ידי ingression מחץ 11. במודל אחר, את התפקיד של רחבת קרום הפלזמה הוצע לתרום תלם היווצרות 12, 13. התכווצות טבעת וחורשת קרום אינם מתרחשים cps1-191 מוטציה רגיש הטמפרטורה Bgs1 / CPS1, האנזים העיקרי להיווצרות מחצה העיקרי 14, 15. תאים חסרי Bgs1 להראות מחצה העיקרי פגום התכווצות טבעת ממושכת 15, 16. Bgs1 מגויסת לאתר חלוקת התא עבור ingression מחצה במהלך ההבשלה לאחר actomyosin טבעת הרכבה 17, 18. Similarly, במהלך cellularization בעוברים תסיסנית, כיווץ טבעת הוא biphasic עם שיעור התכווצות ראשוני איטי באופן משמעותי 19, שמזכיר את שלב ההבשלה שנצפה שמרי ביקוע. התכווצות טבעת Biphasic עשויה להאט תִלוּם הממברנה כדי לאפשר התרחבות קרום מספיק 20 ושינוי של מטריקס. הדבר מצביע על כך לאחר actomyosin טבעת הרכבה, כיווץ טבעת מתרחש ביעילות רק כאשר התא עמד בדרישות להיווצרות קמט. זה אינו מובן היטב מה תנאים נדרשים לתעוקת actomyosin טבעת לאחר הרכבת טבעת, ולא האירועים המולקולריים לווסת את התהליך הזה. הראינו לאחרונה כי בעקבות טבעת actomyosin ההרכבה Cdc42 GTPase הקטן עובר דפוס הפעלת spatiotemporal ייחודי 21. דפוס זה היא הוקמה על ידי דפוס הלוקליזציה הייחודי של גורמי חליפי נוקלאוטיד guanidine Cdc42 (GEFs) המפעילים Cdc42. GEF Gef1 localizes לזירת actomyosin התאספה ומקדמת הופעת התכווצות טבעת ingression מחץ, בעוד Scd1 localizes הקרום המקמט ומקדם היווצרות מחצה נורמלית. אנו מוצאים כי דפוס הפעלת Cdc42 שהקים GEFs שלה להוביל הסדרת אירועי cytokinetic ברורים. כדי להבין את המנגנון המולקולרי של אירועים שבסופו של דבר להוביל לפרידת התא הבא טבעת הרכבת actomyosin, צריך לעקוב אחר אירועי cytokinetic ברורים בזמן ובמרחב. בשמרים ביקוע, cytokinesis הראשון כולל את הרכבה של בלוטות מבשר סביב הגרעין, אשר בסופו של דבר לגייס את שרירן סוג II, formin Cdc12, וחלבונים אחרים הדרושים להרכבה טבעת actomyosin. לעת אירועי cytokinetic הברורים ולספק מסגרת ההתייחסות, הפרדת סמני גוף מוט ציר (היווצרות ציר) נחשב זמן 0 22. ההרכבה של הטבעת דואר actomyosin יכול להיות מלווה ניטור לאורך זמן עוצמת חלבון טבעת fluorescently מתויג actomyosin כגון שרשרת אור רגולטוריות מסוג II שרירן Rlc1. כאן אנו מתארים גישה מיקרוסקופית לנתח בשלבים שונים של cytokinesis לאורך זמן.

<table><tbody><tr><td>Yeast extract media</td><td>Sunrise Science Products</td><td>YES 225</td><td>0.5% w/v yeast extract, 3% w/v glucose, 225mg/L adenine, histidine, leucine, uracil, and lysine</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>SeaKem LE agarose, Lonza</td><td>50001</td><td></td></tr><tr><td>Ascorbic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4544</td><td></td></tr><tr><td>Glass Bottomed culture dish</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td>Coverslip No. 1.5 was used. This will vary as per the microscope specifications used.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>VT-Hawk 2D array laser scanning confocal microscopy system</td><td>Visitech International, UK</td><td></td><td>with an Olympus IX-83 inverted microscope with a 100X / numerical aperture 1.49 UAPO lens (Olympus) and EM-CCD digital camera (Hamamatsu).&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td>Image analysis software</td></tr></tbody></table>

spatiotemporal analysis of cytokinetic events in fission yeast

Cytokinesis, השלב האחרון חלוקת תא הוא קריטי לשמירה על שלמות הגנום. cytokinesis נכונה חשובה התמיינות תאים ופיתוח. Cytokinesis כולל סדרה של אירועים שמאורגנים היטב בזמן ובמרחב. Cytokinesis כרוך ההיווצרות של טבעת actomyosin באתר החלוק, ואחריו התכווצות טבעת, היווצרות תלם הממברנה שיפוץ מטריצה ​​חוץ-תאי. שמרי הביקוע, שמר החלוקה (pombe ס) הוא מערכת מודל למדה היטב כי חשפה בבהירות ניכרת האירועים הראשוניים cytokinesis. עם זאת, אנחנו לא מבינים בבירור עד כמה שונים אירועי cytokinetic מתואמים spatiotemporally. כדי לבדוק זאת, יש צורך לנתח את אירועי cytokinetic השונים בפרטים גדולים בזמן והן במרחב. כאן אנו מתארים גישת מיקרוסקופיה לבחון ev השונה cytokineticהמציג בתאים חיים. עם גישה זו אפשר לתזמן אירועים cytokinetic שונים לקבוע את מועד הגיוס של חלבונים שונים במהלך cytokinesis. בנוסף, אנו מתארים פרוטוקולים להשוות לוקליזציה חלבון, והפצה באתר של חלוקת התא. זהו פרוטוקול בסיסי ללמוד cytokinesis בשמרי ביקוע ויכולים לשמש גם עבור שמרים אחרים ומערכות פטרייתי.

תאי שמרים ביקוע להביע את הסמן טבעת, Rlc1-GFP (ירוק, איור 2), סמן הגוף מוט ציר Sad1-mCherry (אדום, איור 2) הם צילמו במהלך cytokinesis. הופעת סמן גוף מוט ציר (חץ לבן, דמויות 2A, B) נחשב זמן 0. אות Rlc1-GFP מופיעה דקות זמן -4 בהתייחס ציר הפרדת גוף מוט (חץ אד?...

Watch this Scientific Journal Video about Spatiotemporal Analysis of Cytokinetic Events in Fission Yeast at JoVE.com

Spatiotemporal Analysis of Cytokinetic Events in Fission Yeast

שמרי הביקוע, שמר החלוקה היא מערכת מודל מצוינת ללמוד cytokinesis, השלב הסופי חלוקת תא. כאן אנו מתארים גישה מיקרוסקופ לנתח אירועים cytokinetic שונים בתאי שמרים ביקוע חי.

ניתוח Spatiotemporal של אירועים Cytokinetic שמרים ביקוע

Cytokinesis, the final step in cell division is critical for maintaining genome integrity. Proper cytokinesis is important for cell differentiation and ...

spatiotemporal-analysis-of-cytokinetic-events-in-fission-yeast

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

7.3K Views.  University of Tennessee.  שמרי הביקוע, שמר החלוקה היא מערכת מודל מצוינת ללמוד cytokinesis, השלב הסופי חלוקת תא. כאן אנו מתארים גישה מיקרוסקופ לנתח אירועים cytokinetic שונים בתאי שמרים ביקוע חי. 

Video: Spatiotemporal Analysis of Cytokinetic Events in Fission Yeast

Measuring Replicative Life Span in the Budding Yeast

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has been used extensively to study the biology of aging, and several determinants of yeast longevity have been shown to be conserved in multicellular eukaryotes, including worms, flies, and mice 1. Due to the lack of easily quantified age-associated phenotypes, aging in yeast has been assayed almost exclusively by measuring the life span of cells in different contexts, with two different life span paradigms in common usage 2. Chronological life span refers to the length of time that a mother cell can survive in a non-dividing, quiescence-like state, and is proposed to serve as a model for aging of post-mitotic cells in multicellular eukaryotes. Replicative life span, in contrast, refers the number of daughter cells produced by a mother cell prior to senescence, and is thought to provide a model of aging in mitotically active cells. Here we present a generalized protocol for measuring the replicative life span of budding yeast mother cells. The goal of the replicative life span assay is to determine how many times each mother cell buds. The mother and daughter cells can be easily differentiated by an experienced researcher using a standard light microscope (total magnification 160X), such as the Zeiss Axioscope 40 or another comparable model. Physical separation of daughter cells from mother cells is achieved using a manual micromanipulator equipped with a fiber-optic needle. Typical laboratory yeast strains produce 20-30 daughter cells per mother and one life span experiment requires 2-3 weeks.

In this article we present a general protocol for measuring the replicative life span of yeast mother cells.

מדידת תוחלת החיים בשמרים replicative הנצה

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using fluorochromes like Green Fluorescent Protein (GFP) directly attached to the protein of interest has become increasingly popular 1. Using GFP and similar fluorochromes the subcellular localisations and movements of proteins can be detected in a fluorescent microscope. Moreover, also the subnuclear localisation of a certain region of a chromosome can be studied using this technique. GFP is fused to the Lac Repressor protein (LacR) and ectopically expressed in the cell where tandem repeats of the lacO sequence has been inserted into the region of interest on the chromosome2. The LacR-GFP will bind to the lacO repeats and that area of the genome will be visible as a green dot in the fluorescence microscope. Yeast is especially suited for this type of manipulation since homologous recombination is very efficient and thereby enables targeted integration of the lacO repeats and engineered fusion proteins with GFP 3. Here we describe a quantitative method for live cell analysis of fission yeast. Additional protocols for live cell analysis of fission yeast can be found, for example on how to make a movie of the meiotic chromosomal behaviour 4. In this particular experiment we focus on subnuclear organisation and how it is affected during gene induction. We have labelled a gene cluster, named Chr1, by the introduction of lacO binding sites in the vicinity of the genes. The gene cluster is enriched for genes that are induced early during nitrogen starvation of fission yeast 5. In the strain the nuclear membrane (NM) is labelled by the attachment of mCherry to the NM protein Cut11 giving rise to a red fluorescent signal. The Spindle Pole body (SPB) compound Sid4 is fused to Red Fluorescent Protein (Sid4-mRFP) 6. In vegetatively growing yeast cells the centromeres are always attached to the SPB that is embedded in the NM 7. The SPB is identified as a large round structure in the NM. By imaging before and 20 minutes after depletion of the nitrogen source we can determine the distance between the gene cluster (GFP) and the NM/SPB. The mean or median distances before and after nitrogen depletion are compared and we can thus quantify whether or not there is a shift in subcellular localisation of the gene cluster after nitrogen depletion.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, is a good model system to study basic cellular processes. Here we describe a method to perform quantitative live cell analysis of fission yeast. In this particular experiment we focus on organisation of the genome within the cell nucleus, but the method can also be used to study cytosolic factors.

כמותי תא חי פלואורסצנטי, מיקרוסקופ ניתוח של שמרים ביקוע

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos

The spindle assembly checkpoint (SAC) mechanism is an active signal, which monitors the interaction between chromosome kinetochores and spindle microtubules to prevent anaphase onset until the chromosomes are properly connected. Cells use this mechanism to prevent aneuploidy or genomic instability, and hence cancers and other human diseases like birth defects and Alzheimer's1. A number of the SAC components such as Mad1, Mad2, Bub1, BubR1, Bub3, Mps1, Zw10, Rod and Aurora B kinase have been identified and they are all kinetochore dynamic proteins2. Evidence suggests that the kinetochore is where the SAC signal is initiated. The SAC prime regulatory target is Cdc20. Cdc20 is one of the essential APC/C (Anaphase Promoting Complex or Cyclosome) activators3 and is also a kinetochore dynamic protein4-6. When activated, the SAC inhibits the activity of the APC/C to prevent the destruction of two key substrates, cyclin B and securin, thereby preventing the metaphase to anaphase transition7,8. Exactly how the SAC signal is initiated and assembled on the kinetochores and relayed onto the APC/C to inhibit its function still remains elusive.
Drosophila is an extremely tractable experimental system; a much simpler and better-understood organism compared to the human but one that shares fundamental processes in common. It is, perhaps, one of the best organisms to use for bio-imaging studies in living cells, especially for visualization of the mitotic events in space and time, as the early embryo goes through 13 rapid nuclear division cycles synchronously (8-10 minutes for each cycle at 25 &deg;C) and gradually organizes the nuclei in a single monolayer just underneath the cortex9.
Here, I present a bio-imaging method using transgenic Drosophila expressing GFP (Green Fluorescent Protein) or its variant-targeted proteins of interest and a Leica TCS SP2 confocal laser scanning microscope system to study the SAC function in flies, by showing images of GFP fusion proteins of some of the SAC components, Cdc20 and Mad2, as the example.

Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos

The kinetochore is where the SAC initiates its signal monitoring the mitotic segregation of the sister chromatids. A method is described to visualize the recruitment and turnover of one of the kinetochore proteins and its coordination with the chromosome motion in Drosophila embryos using a Leica laser scanning confocal system.

לימוד מחסום mitotic ידי הממחישות התנהגות חלבון דינמי Kinetochore ו Motion כרומוזום חיים<em&gt; תסיסנית</em&gt; עוברים סינסיציאלי

The spindle assembly checkpoint (SAC) mechanism is an active signal, which monitors the interaction between chromosome kinetochores and spindle ...

Acquiring Fluorescence Time-lapse Movies of Budding Yeast and Analyzing Single-cell Dynamics using GRAFTS

Fluorescence time-lapse microscopy has become a powerful tool in the study of many biological processes at the single-cell level. In particular, movies depicting the temporal dependence of gene expression provide insight into the dynamics of its regulation; however, there are many technical challenges to obtaining and analyzing fluorescence movies of single cells. We describe here a simple protocol using a commercially available microfluidic culture device to generate such data, and a MATLAB-based, graphical user interface (GUI) -based software package to quantify the fluorescence images. The software segments and tracks cells, enables the user to visually curate errors in the data, and automatically assigns lineage and division times. The GUI further analyzes the time series to produce whole cell traces as well as their first and second time derivatives. While the software was designed for S. cerevisiae, its modularity and versatility should allow it to serve as a platform for studying other cell types with few modifications.

We present a simple protocol to obtain fluorescence microscopy movies of growing yeast cells, and a GUI-based software package to extract single-cell time series data. The analysis includes automated lineage and division time assignment integrated with visual inspection and manual curation of tracked data.

רכישת זמן לשגות סרטים הקרינה של שמרים להנץ וניתוח Dynamics תא בודד באמצעות שתלי

Fluorescence time-lapse microscopy has become a powerful tool in the study of many biological processes at the single-cell level. In particular, movies ...

Temporal Quantification of MAPK Induced Expression in Single Yeast Cells

The quantification of gene expression at the single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements performed at the population level. Two methods based on microscopy and flow cytometry are presented to demonstrate how such data can be acquired. The expression of a fluorescent reporter induced upon activation of the high osmolarity glycerol MAPK pathway in yeast is used as an example. The specific advantages of each method are highlighted. Flow cytometry measures a large number of cells (10,000) and provides a direct measure of the dynamics of protein expression independent of the slow maturation kinetics of the fluorescent protein. Imaging of living cells by microscopy is by contrast limited to the measurement of the matured form of the reporter in fewer cells. However, the data sets generated by this technique can be extremely rich thanks to the combinations of multiple reporters and to the spatial and temporal information obtained from individual cells. The combination of these two measurement methods can deliver new insights on the regulation of protein expression by signaling pathways.

Two complementary methods based on flow cytometry and microscopy are presented which enable the quantification, at the single cell level, of the dynamics of gene expression induced by the activation of a MAPK pathway in yeast.

כימות זמניות של ביטוי MAPK מושרה בתאי שמרים יחיד

The quantification of gene expression at the  single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements  performed at the population ...

Microscopy of Fission Yeast Sexual Lifecycle

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the mechanics of cell division and cell polarity. Furthermore, classical experiments on its sexual reproduction have yielded results pivotal to current understanding of DNA recombination and meiosis. More recent analysis of fission yeast mating has raised interesting questions on extrinsic stimuli response mechanisms, polarized cell growth and cell-cell fusion. To study these topics in detail we have developed a simple protocol for microscopy of the entire sexual lifecycle. The method described here is easily adjusted to study specific mating stages. Briefly, after being grown to exponential phase in a nitrogen-rich medium, cell cultures are shifted to a nitrogen-deprived medium for periods of time suited to the stage of the sexual lifecycle that will be explored. Cells are then mounted on custom, easily built agarose pad chambers for imaging. This approach allows cells to be monitored from the onset of mating to the final formation of spores.

We provide a reproducible basic method for the long-term microscopy of the fission yeast sexual lifecycle. With minor adjustments described, the presented protocol allows research focus on different steps of the reproductive process.

מיקרוסקופי של שמרי ביקוע Lifecycle המיני

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the ...

High-resolution Imaging and Analysis of Individual Astral Microtubule Dynamics in Budding Yeast

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells regulate these processes and how genetic mutations impact regulation. The quantification of microtubule dynamics in metazoan models has a number of associated challenges, including a high microtubule density and limitations on genetic manipulations. In contrast, the budding yeast model offers advantages that overcome these challenges. This protocol describes a method to measure the dynamics of single microtubules in living yeast cells. Cells expressing fluorescently tagged tubulin are adhered to assembled slide chambers, allowing for stable time-lapse image acquisition. A detailed guide for high-speed, four-dimensional image acquisition is also provided, as well as a protocol for quantifying the properties of dynamic microtubules in confocal image stacks. This method, combined with conventional yeast genetics, provides an approach that is uniquely suited for quantitatively assessing the effects of microtubule regulators or mutations that alter the activity of tubulin subunits.

Budding yeast is an advantageous model for studying microtubule dynamics in vivo due to its powerful genetics and the simplicity of its microtubule cytoskeleton. The following protocol describes how to transform and culture yeast cells, acquire confocal microscopy images, and quantitatively analyze microtubule dynamics in living yeast cells.

הדמיה ברזולוציה גבוהה וניתוח של Dynamics microtubule אסטרל הבודד שמרים ניצנים

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells ...

Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does not interfere with cell physiology, and requires minimal experimental handling. The low levels of technical interference enable researchers to study cells across multiple cycles of mitosis and to observe meiosis from beginning to end. Using fluorescent tags such as Green Fluorescent Protein (GFP) and Red Fluorescent Protein (RFP), researchers can analyze different factors whose functions are important for processes like transcription, DNA replication, cohesion, and segregation. Coupled with data analysis using Fiji (a free, optimized ImageJ version), live-cell imaging offers various ways of assessing protein movement, localization, stability, and timing, as well as nuclear dynamics and chromosome segregation. However, as is the case with other microscopy methods, live-cell imaging is limited by the intrinsic properties of light, which put a limit to the resolution power at high magnifications, and is also sensitive to photobleaching or phototoxicity at high wavelength frequencies. However, with some care, investigators can bypass these physical limitations by carefully choosing the right conditions, strains, and fluorescent markers to allow for the appropriate visualization of mitotic and meiotic events.

Here, we present live-cell imaging which is a non-toxic microscopy method that allows researchers to study protein behavior and nuclear dynamics in living fission yeast cells during mitosis and meiosis.

בחינת Mitotic ומיוטיק ביקוע הדינמיקה הגרעינית על ידי הזריחה לחיות-מיקרוסקופ התא

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does ...

Live Cell Imaging to Assess the Dynamics of Metaphase Timing and Cell Fate Following Mitotic Spindle Perturbations

Live cell time-lapse imaging is an important tool in cell biology that provides insight into cellular processes that might otherwise be overlooked, misunderstood, or misinterpreted by the fixed-cell analysis. While the fixed cell imaging and analysis is robust and sufficient to observe cellular steady-state, it can be limited in defining a temporal order of events at the cellular level and is ill-equipped to assess the transient nature of dynamic processes including mitotic progression. In contrast, live cell imaging is an eloquent tool that can be used to observe cellular processes at the single-cell level over time and has the capacity to capture the dynamics of processes that would otherwise be poorly represented in fixed cell imaging. Here we describe an approach to generate cells carrying fluorescently labeled markers of chromatin and microtubules and their use in live cell imaging approaches to monitor metaphase chromosome alignment and mitotic exit. We describe imaging-based techniques to assess the dynamics of spindle formation and mitotic progression, including the identification of cells at various stages in mitosis, identification&#160;and tracking of mitotic defects, and analysis of spindle dynamics and mitotic cell fate following the treatment with mitotic inhibitors.

Here we present a protocol to assess the dynamics of spindle formation and mitotic progression. Our application of time-lapse imaging enables the user to identify cells at various stages of mitosis, track and identify mitotic defects, and analyze spindle dynamics and mitotic cell fate upon exposure to anti-mitotic drugs.

הדמיה של תא חי כדי להעריך את הדינמיקה של תזמון מטאמפאזה ואת הגורל התאים בעקבות Mitotic צירים רטבאליות

Live cell time-lapse imaging is an important tool in cell biology that provides insight into cellular processes that might otherwise be overlooked, ...

Use of Time-Lapse Microscopy and Stage-Specific Nuclear Depletion of Proteins to Study Meiosis in S. cerevisiae

Time-lapse fluorescence microscopy has revolutionized the understanding of meiotic cell-cycle events by providing temporal and spatial data that is often not seen by imaging fixed cells. Budding yeast has proved to be an important model organism to study meiotic chromosome segregation because many meiotic genes are highly conserved. Time-lapse microscopy of meiosis in budding yeast allows the monitoring of different meiotic mutants to show how the mutation disrupts meiotic processes. However, many proteins function at multiple points in meiosis. The use of loss-of-function or meiotic null mutants can therefore disrupt an early process, blocking or disturbing the later process and making it difficult to determine the phenotypes associated with each individual role. To circumvent this challenge, this protocol describes how the proteins can be conditionally depleted from the nucleus at specific stages of meiosis while monitoring meiotic events using time-lapse microscopy. Specifically, this protocol describes how the cells are synchronized in prophase I, how the anchor away technique is used to deplete proteins from the nucleus at specific meiotic stages, and how time-lapse imaging is used to monitor meiotic chromosome segregation. As an example of the usefulness of the technique, the kinetochore protein Ctf19 was depleted from the nucleus at different time points during meiosis, and the number of chromatin masses was analyzed at the end of meiosis II. Overall, this protocol can be adapted to deplete different nuclear proteins from the nucleus while monitoring the meiotic divisions.

Use of Time-Lapse Microscopy and Stage-Specific Nuclear Depletion of Proteins to Study Meiosis in S. cerevisiae

Time-lapse microscopy is a valuable tool for studying meiosis in budding yeast. This protocol describes a method that combines cell-cycle synchronization, time-lapse microscopy, and conditional depletion of a target protein to demonstrate how to study the function of a specific protein during meiotic chromosome segregation.

שימוש במיקרוסקופיה של קיטועי זמן ודלדול גרעיני ספציפי לשלב של חלבונים כדי לחקור מיוזה ב- S. cerevisiae

Time-lapse fluorescence microscopy has revolutionized the understanding of meiotic cell-cycle events by providing temporal and spatial data that is often ...