この作品は、STの「感覚処理の細胞機構」（プロジェクトC04）共同研究センター889を介してドイツ学術協会の助成金によってサポートされていました。我々は、技術支援のために、ドイツ霊長類センター、博士カタリーナDebowskiとアンナMagerhansの幹細胞単位でシーナプルーマー、レオノーレBurchardt、ディルクPrüsse、クラウスハイジックと、技術および動物関連のサポートのためのラルフBrockhausenと私たちの協力者に感謝します濾過プロセス。

動物のケアと全ての実験手順は、動物の世話を支配するドイツの法律に従って行われ、ブラウンシュヴァイク、ニーダーザクセン州、ドイツの地方政府によって承認されました。 注意：実験は、インビボで実施されるように、可能な限り最高の衛生基準を維持することが重要です。可能な限り、無菌状態の下で働きます。 1.インジェクション/レコーディングシステムの準備<ol><li>注射器でマイクロピペットを接続するチューブを滅菌します。実験のセットアップ噴射ポンプや電気生理学的記録システムとの間で可能なチューブの最短の長さを使用してください。 </li><li>クリーニングワイヤーを用いた記録システムの案内管を清掃してください。数回の滅菌シリコンオイルでそれらを浸し、個々のガイドチューブを介してそれらを養います。 </li><li>記録システムの一ガイドチューブ内に石英ガラスマイクロピペットを挿入します。 図1Aを参照してください。 </li><li>にマイクロピペットを固定した後記録システム、マイクロピペットの金属ピンに滅菌チューブを取り付けます。世話をする;マイクロピペットは、システム内に固定されているが、チューブを装着する際には、簡単に破ることができます。ピンとチューブに等しい圧力を適用するために2つの滅菌ピンセットを使用してください。 </li><li>チューブとマイクロピペットとの間の接合部をシールするために、液体のスーパー接着剤を使用してください。接着剤は液体でマイクロピペットを充填する前に硬化させるために少なくとも3時間を待ちます。 </li><li>マイクロピペットの挿入前または後に記録システムの他の位置に微小電極（白金タングステンを絶縁例えば 、石英ガラス）を挿入します。 </li></ol> 2.物質の準備<ol><li>オートクレーブまたは他の信頼性のある手順を使用して、注射液の後に貯蔵1.5 mlマイクロチューブを滅菌します。 </li><li> 0.1モル溶液5mlを調製するために、対応する物質スコポラミン塩酸塩を秤量。滅菌生理食塩水（0.9％NaCl）中に溶解します。 </li><li>無菌状態の私の下で、フードヒューム十分大きな孔径シリンジフィルターを用いて溶液を濾過、 例えば 、0.2μmでナ。 </li><li>ヒュームフードの下で、一定分量ソリューション単一の実験のための十分なボリューム、 例えばに、スコポラミン、滅菌1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブ内の500μlの。光から物質を保護するために、暗いチューブを使用します。代わりに、アルミホイルで管を包みます。スコポラミンのために、4℃で14日間までのソリューションを保存します。 </li></ol>インジェクション/記録システムの3毎日の準備注：記録系に装着されたとき、電極とマイクロピペットは、記録間の酵素溶液（Tergazyme、脱イオン水で1％溶液）に格納されています。次の手順は、すべての記録の前に実行する必要があります。 <ol><li>注入されるべき物質のチューブを収集します。冷蔵場合、それはRTに到達させます。 </li><li>酵素溶液から注入/記録システムを取り外し、電極をすすぎます酵素溶液を完全にきれいに脱イオン水でマイクロピペット。 </li><li>視覚的にマイクロピペットとチューブとの間にシールを確認するために、記録システムのフロントカバーを取り外します。 </li><li>円滑な移動のためのシステムを潤滑するために、ガイドチューブギャップ（ 図1A参照 ）、電極およびマイクロピペットの先端に滅菌シリコンオイルを適用します。 </li><li>彼らは無傷であることを確認するために顕微鏡を用いて電極およびマイクロピペットの先端を確認してください。彼らは、同じ長さのガイドチューブの外に延びるように顕微鏡下電極とマイクロピペットの位置を合わせます。すぐに、彼らはもはや表示されているように、停止、案内管にそれらを駆動します。これは、電極位置はゼロとして定義されます。ソフトウェアで0に電極およびマイクロピペットの深さを設定します。 </li><li>滅菌生理食塩水、滅菌注射器を記入し、チューブの壁を貫通しないように注意しながら、チューブに針を挿入します。 VISUためのガイドチューブからマイクロピペットを駆動します物質フローのアル制御。 </li><li>全く空気がないことを確実にするチューブやマイクロピペットを介して、フラッシュ少なくとも2ミリリットルの滅菌生理食塩水を注射器またはチューブ内に残っています。シリンジのプランジャーにあまりプレッシャーをかけないでください。チューブとマイクロピペットとの間の接合部が密閉されていることを確認してください。漏れが表示されている場合は、再接着接合（ステップ1.5を参照）、記録を延期。 </li><li>噴射すべきソリューションで新しい無菌注射器を記入し、生理食塩水の注射器のバレルと交換、 すなわち 、チューブ内の生理食塩水で満たされた注射器の針を保ちます。全く空気がシステムに転送されないことを確認します。これは、最高の生理食塩水で満たされたバレルを除去した後、生理食塩水で針ハブを充填することによって達成されます。 </li><li>完全にチューブから生理食塩水を除去するために、注入される溶液250μlのシステムをフラッシュします。 </li><li>モータ制御ソフトウェアを使用して、guidetubestoに少なくとも-500マイクロメートルの深さを電極とマイクロピペットを撤回。 </li><li&gt;は、その固定された相対的な位置を維持するために、案内管の底部にガイドチューブリング（ 図1A）を下げます。 </li><li>それはサルの記録室に触れる特にエタノールによるシステムの基地を、清掃してください。 </li><li>フロントカバーを交換し、ネジを締めて記録システムを閉じます。 </li></ol>噴射システムの4バリデーション注：同社はシステムを校正するが、実験のセットアップ（チューブ、シリンジなど）に使用される材料で排出されたボリュームを検証することをお勧めします。 <ol><li>案内管の外に延長電極とマイクロピペットを保ち、ステップ3で説明したように、システムを準備します。少なくとも7000マイクロメートルの深さが原因でマイクロピペットおよび電極の外面に沿って付着して測定体積の損失を回避することをお勧めします。 </li><li>それは実験中で使用される位置に記録システムを配置し、syrinを置きますマイクロインジェクションポンプにGE。ゴムバンドと調節可能なグリップを使用して所定の位置に注射器を修正しました（ 図1A参照）。それは、シリンジのプランジャの後ろにしっかり固定されるまで、ポンプの可動部をスライドさせます。 </li><li> 例えば 、ソフトウェア制御のモータユニットを使用して、正確に測定するのに十分に大きな容積を取り出す。1000 NL。マイクロピペットの表面に沿って毛管作用の影響を回避するために、総容積を排出する単一の工程を使用することが好ましいです。非常に低い速度（1 NL /秒）も、検証手順の間にこの効果につながることができます。 </li><li>マイクロピペットの下に置かれた容器内の全体積を収集し、または慎重にマイクロピペットの先端から直接排出されたドロップを収集します。ピペットを用いて排出されたボリュームを見積もりや精密スケールで計量することによって。 </li><li>測定値を確認するための手順を数回繰り返します。 </li></ol> 5.急性レコーディング<ol><li> XY位置を設定します。記録システム。これは、案内管が慢性的に移植記録チャンバー内の硬膜に到達した時点を定義します。ガイドチューブが完全に（ガイドチューブのz位置0）に退避していることを確認します。 </li><li>所定の位置に記録システムを持参し、マイクロインジェクションポンプにシリンジを配置します。ゴムバンドと調節可能なグリップを使用して所定の位置に注射器を修正しました（ 図1A参照）。それは、シリンジのプランジャの後ろにしっかり固定されるまで、ポンプの可動部をスライドさせます。物質の降下が案内管の先端に表示されている場合は、慎重に滅菌綿棒を使用して、それを削除してください。 </li><li>実験室の手順に従って（例えば、ガイドラインのための18を参照）を記録するために動物を準備します。 </li><li>しっかりとサルの記録室に記録システムをマウントします。 </li><li>ゆっくり硬膜に達するまで手動で、モータの共同使用して電極を駆動、記録室へ案内管を下げますntrolソフトウェア。 </li><li>それは、マイクロピペットのインピーダンスを測定することができないように、第1の電極を駆動し、異なる深さで定期的にインピーダンスを確認してください。硬膜の貫通を正常電極を損傷することなく実行された後、マイクロピペットを進めます。 </li><li>関心対象の脳領域が発見されると予想されるターゲット電極の深さに電極とマイクロピペットを駆動します。記録された信号において良好な信号対雑音比によって証明されるように、単一のユニットの活動を記録するのに十分に近づくまでゆっくり電極を進めます。重要なことは、電極とマイクロピペットとの間の最小距離を確保するために、同じ深さで記録電極とマイクロピペットを配置。 <ol><li>可能な場合は、全体の記録のために、この深さで電極およびマイクロピペットを保ちます。記録されたセルの信号品質を維持するための唯一の方法は、電極を移動させることである場合は、次に、電極とマイクロピペットを駆動します同時にそれらの間の距離を維持します。 </li></ol></li></ol> 6.空間的注意タスク<ol><li>画面上の一連の試験は、本2つの移動のドットパターンでは、1が一緒に動物が各試行19全体に小さな穴のある必要があり、中央に提示固定点で、記録されたニューロンとそれの他の外の受容野内に位置します、 20。 注：サルが他のドットパターンのいずれかの方向変化を無視して頭出しのドットパターン（対象イベント）における方向変化に対応するように訓練され、裁判19の全てが正常に完了するための液体の滴で報われています、 20。感覚制御条件としては、サルは両方の移動ドットパターンを（タスクのより詳細な説明については、 図2を参照）無視して注視点の輝度変化を報告しなければなりません。 </li></ol> 7.薬理学的操作記録しながら、 <p&gt;注：猿がタスクを実行している間、ブロック単位の方法で物質を注入します。三つの連続ブロックが定義されています：コントロールを、ベースラインとして機能します。物質が排出され、その間に注入。そして、リカバリは、その間に細胞がベースラインに注入リターンで標的に。 <ol><li>注入ブロックの間に、一定の間隔で物質の事前定義された量を注入例えば 、2 NL 2 NL / sの速度で毎分。この例では、スコポラミン塩酸塩を使用しています。注入プロセスは、さまざまなオプションを提供するソフトウェアを使用して制御されます。例えば、録画ソフトウェアのクロックに応じて毎分注入量を定義するためにステップ関数を使用し、注入ボタンを押してください。 注：注射ブロックの正確な期間は物質であり、依存実験、 例えば 、スコポラミンの使用のために2 nlの注射毎分10分（合計20 NL）のために。電極およびマイクロピペットドゥリを進行しないことが好ましいです注入ブロックをngの。 </li><li>電極およびマイクロピペットの深さだけでなく、排出される物質の量、時間と物質が注入されている間の裁判に注意してください。 </li><li>何の物質が注入されていないに回復ブロック、と注入ブロックに従ってください。回復ブロックの持続時間は、物質固有のものであり、事前の試験​​に定義される必要があります。回復ブロックの終わりまで選択された単一のユニットの記録品質を監視し、維持します。 </li><li>限り、サルの記録品質とモチベーションが許す限りのための3つのブロックを繰り返します。 </li></ol> 8.ポスト録画手順<ol><li>データ記録した後、案内管に電極およびマイクロピペットを撤回し、手動でガイドチューブを後退させます。サルの記録室から記録システムを削除してください。噴射ポンプから注射器を解放し、クリーニングのために準備領域にシステムを転送します。 </li><li>動物を扱います（記録チャンバー18の洗浄を含む）研究室の標準的な手順に従って、住宅施設にそれを返します。 </li><li>過酸化水素（3％）で案内管の外側を洗浄した後、脱イオン水で。案内管のうち駆動電極とマイクロピペットは、過酸化水素、その後、脱イオン水ですすいでください。 </li><li>チューブに針を維持し、滅菌生理食塩水で満たされた注射器のバレルと注射器のバレルを交換します。チューブおよび生理食塩水1〜2 mlのマイクロピペットをフラッシュします。フラッシュした後、バレルを除去し、空気でそれを埋めます。針にバレルを再挿入し、軽くを通して空気を押すことによって、内側からチューブやマイクロピペットを乾燥させます。 </li><li>乾燥を避けるために、並びに有機物質の分解を確実にするために、酵素溶液に浸漬したガイド管、延長電極とマイクロピペットを格納します。 </li></ol>

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	<li>Noudoost, B., Moore, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+neuromodulators+in+selective+attention.">The role of neuromodulators in selective attention.</a> Trends Cogn Sci. 15 (12), 585-591 (2011).</li><li>Jochems, A., Reboreda, A., Hasselmo, M., Yoshida, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholinergic+receptor+activation+supports+persistent+firing+in+layer+III+neurons+in+the+medial+entorhinal+cortex.">Cholinergic receptor activation supports persistent firing in layer III neurons in the medial entorhinal cortex.</a> Behav Brain Res. 254, 108-115 (2013).</li><li>Thiele, A., Herrero, J. L., Distler, C., Hoffmann, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+cholinergic+and+GABAergic+mechanisms+to+direction+tuning,+discriminability,+response+reliability,+and+neuronal+rate+correlations+in+macaque+middle+temporal+area.">Contribution of cholinergic and GABAergic mechanisms to direction tuning, discriminability, response reliability, and neuronal rate correlations in macaque middle temporal area.</a> J Neurosci. 32 (47), 16602-16615 (2012).</li><li>Thienel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscarinic+antagonist+effects+on+executive+control+of+attention.">Muscarinic antagonist effects on executive control of attention.</a> Int J Neuropsychopharmacol. 12 (10), 1307-1317 (2009).</li><li>Anthony, B. L., Dennison, R. L., Aronstam, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+muscarinic+receptor-G+protein+coupling+is+a+general+property+of+liquid+volatile+anesthetics.">Disruption of muscarinic receptor-G protein coupling is a general property of liquid volatile anesthetics.</a> Neurosci Lett. 99 (1-2), 191-196 (1989).</li><li>Yamakura, T., Bertaccini, E., Trudell, J. R., Harris, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anesthetics+and+ion+channels:+molecular+models+and+sites+of+action.">Anesthetics and ion channels: molecular models and sites of action.</a> Annu Rev Pharmacol Toxicol. 41, 23-51 (2001).</li><li>Herr, N. R., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+techniques+for+examining+rapid+dopamine+signaling+with+iontophoresis.">Improved techniques for examining rapid dopamine signaling with iontophoresis.</a> Front Biosci. 5, 249-257 (2013).</li><li>Bevan, P., Bradshaw, C. M., Pun, R. Y., Slater, N. T., Szabadi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relative+contribution+of+iontophoresis+and+electro-osmosis+to+the+electrophoretic+release+of+noradrenaline+from+multi+barrelled+micropipettes+[proceedings].">The relative contribution of iontophoresis and electro-osmosis to the electrophoretic release of noradrenaline from multi barrelled micropipettes [proceedings].</a> Br J Pharmacol. 67 (3), 478-479 (1979).</li><li>Herr, N. R., Kile, B. M., Carelli, R. M., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroosmotic+flow+and+its+contribution+to+iontophoretic+delivery.">Electroosmotic flow and its contribution to iontophoretic delivery.</a> Anal Chem. 80, 8635-8641 (2008).</li><li>Thiele, A., Delicato, L. S., Roberts, M. J., Gieselmann, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+electrode-pipette+design+for+simultaneous+recording+of+extracellular+spikes+and+iontophoretic+drug+application+in+awake+behaving+monkeys.">A novel electrode-pipette design for simultaneous recording of extracellular spikes and iontophoretic drug application in awake behaving monkeys.</a> J Neurosci Meth. 158 (2-4), 207-211 (2006).</li><li>Lalley, P. M., Johansson, H., Windhorst, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Microiontophoresis and Pressure Ejection: Modern Techniques in Neuroscience. , 193-209 (1999).</li><li>Malpeli, J. G., Schiller, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+of+reversible+inactivation+of+small+regions+of+brain+tissue.">A method of reversible inactivation of small regions of brain tissue.</a> J Neurosci Meth. 1 (2), 145-159 (1979).</li><li>Malpeli, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+inactivation+of+subcortical+sites+by+drug+injection.">Reversible inactivation of subcortical sites by drug injection.</a> J Neurosci Meth. 86 (2), 119-128 (1999).</li><li>Dias, E. C., Segraves, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pressure+system+for+the+microinjection+of+substances+into+the+brain+of+awake+monkeys.">A pressure system for the microinjection of substances into the brain of awake monkeys.</a> J Neurosci Meth. 72 (1), 43-47 (1997).</li><li>Szente, M. B., Baranyi, A., Woody, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+protein+kinase+C+inhibitor+H-7on+membrane+properties+and+synaptic+responses+of+neocortical+neurons+of+awake+cats.">Effects of protein kinase C inhibitor H-7on membrane properties and synaptic responses of neocortical neurons of awake cats.</a> Brain Res. 506 (2), 281-286 (1990).</li><li>Woody, C. D., Bartfai, T., Gruen, E., Nairn, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=lntracellular+injection+of+cGMP-dependent+protein+kinase+results+in+increased+input+resistance+in+neurons+of+the+mammalian+motor+cortex.">lntracellular injection of cGMP-dependent protein kinase results in increased input resistance in neurons of the mammalian motor cortex.</a> Brain Res. 386 (1-2), 379-385 (1986).</li><li>Noudoost, B., Moore, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reliable+microinjectrode+system+for+use+in+behaving+monkeys.">A reliable microinjectrode system for use in behaving monkeys.</a> J Neurosci Meth. 194 (2), 218-223 (2011).</li><li>Association of Primate Veterinarians. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cranial Implant Care Guidelines for Nonhuman Primates in Biomedical Research. , (2015).</li><li>Treue, S., Martinez-Trujillo, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feature-based+attention+influences+motion+processing+gain+in+macaque+visual+cortex.">Feature-based attention influences motion processing gain in macaque visual cortex.</a> Nature. 399, 575-579 (1999).</li><li>Martinez-Trujillo, J. C., Treue, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feature-based+attention+increases+the+selectivity+of+population+responses+in+primate+visual+cortex.">Feature-based attention increases the selectivity of population responses in primate visual cortex.</a> Curr Biol. 14 (9), 744-751 (2004).</li></ol>

著者らは、開示することは何もありません。

ここでは、「既製」圧力噴射システムで信頼性が高く、正確な注射と高品質の単セル記録を実行する方法を詳細に説明しています。薬剤送達のこの方法は、以前に（17に概説）サルの挙動で使用されてきたが、ここに提示システムは、以下のレビューの利点を有します。 図4（a）に示すように 、ここで説明したシステムは、記録部位のすぐ近くで、薬理学的注射でとせずに、単一ニューロン活動の安定した測定を提供することができます。 図4Bに示すように、対照物質、生理食塩水の注入は、発火率の変化をもたらしませんでした。この制御は、注入プロセス自体が記録されたニューロンの発火特性に測定可能な影響を及ぼさないことを示しています。 空間的なニューロンの構成、記録電極、およびマイクロピペットが重要です<html>これらの実験で重要。記録時の組織におけるそれらの相対位置の正確な測定が可能ではないですが、我々が検討し、分散の可能なソースのために制御することができます。まず、容量注入中に関心のニューロンが記録された信号の安定性に影響を与え、記録電極から離れて変位するおそれがあります。そのためには、信号の安定性を確認するために注入ブロックの前後の発火率を比較することが賢明です。次に、記録装置のガイドチューブ構成は、電極とマイクロピペットとの間の距離を定義する（ 例えば 、この実験に用いた同心の3チャネルシステム305ミクロン）。システムは、組織内の電極とマイクロピペットの深さの正確な位置制御を提供するので、それらの間の距離は注意深く（ステップ3.5）を記録し、記録時に共通の深さでそれらを保持する前に、相対的な深さを較正することによって最小限に抑えることができます。 ENT &quot;&gt; 潜在的な制限 チューブ、シリンジなどの異なるブランドが使用することができ、排出された量の違いにつながる可能性として製造業者によって、社内の品質管理に加えて、システムは、実験室条件下​​で検証する必要があります。システムは、ここに示した実験と同様に、非常に少量を注入するために使用することができるが、これらは、通常の実験室環境において実際の測定限界に起因して検証することができる最小量以下です。しかし、より大きな注入量は、ソフトウェア定義された量とハードウェアによって吐出される体積との間の関係を推測するために使用することができます。透明な管が使用される場合、注入プロセスの追加の目視検査は、視覚マーカの変位を測定することが可能です。 マイクロピペットの直径がやや大きく、材料がより壊れやすいようにシステムにマイクロピペットを挿入すると、電極挿入よりも厳しいです。加えて、それはマイクロピペットの上部を破壊する高いリスクを伴うようマイクロピペットのピンにチューブを接合することは困難です。しかし、正常にロードされたマイクロピペットの寿命があっても日常的に使用して、数ヶ月です。 実際には、我々はまだシステムのアフレコ洗浄中に噴射システム内の閉塞を発生していません。それにもかかわらず、何も「オンライン」のチェックは不可能であり、（そのようなマイクロピペットの先端で組織としての）物理的な閉塞は、物質の注入を防止するかもしれないという危険性があります。従って、このような実験の制御と注入ブロック間の発火率の有意な変化を示すさらなる分析における細胞のみを含むように、保守的にデータを分析することをお勧めかもしれません。 その小さい直径にもかかわらず、微小電極とピペットは、脳組織を変位され、いくつかの局所的な組織の損傷を引き起こし得ます。これは、手動で番目のチップを配置することによって最小化することができますちょうど硬膜上記電子案内管。電極はその後、硬膜を貫通し、その完全性は、オンラインでのインピーダンスを測定することにより推定されます。その後、マイクロピペットが挿入されています。このアプローチを使用する場合は、硬膜上記組織の定期的な除去は、さらに電極やピペット破損のリスクを軽減することをお勧めします。 代替的な方法と比較し ここで使用されるシステムは、他の圧力噴射システムと比較して明らかな利点を示しています。一強い利点は、他の利用可能なプローブ17の半分の大きさであるため、神経組織の損傷を最小限にマイクロピペット（約100ミクロン）の直径です。以前の設計とは対照的に、現在のシステムは、空間的に分離された記録電極とマイクロピペットを用いています。他のシステムは、電極とピペットの間に小さい距離を提供するが、ここで説明するシステムは、このようにpermi、電極とピペットの独立した深さの変更を可能にしますレコーディング・セッション内の変数の相対的な距離をめの設定。注入システムは、確立された記録装置の延長であるように重要なのは、記録品質に関して妥協がなされる必要はありません。唯一のマイクロピペット、従って一つの物質は、このプロトコルで使用されるが、1つの実験手順内のいくつかの物質を注入することができます。これを達成するために、いくつかのマイクロピペットは、別個のガイド管にねじ込ま、個々の注入ポンプに取り付けられた注射器に接続することができます。一つのコンピュータプログラムは、電極とマイクロピペットを進めるために、実験中圧インジェクションを行うために必要とされるように、最終的に、システムを制御することは、容易です。 イオントフォレーシスに圧力注入を比較すると、相対的な長所と短所があります。例えば、圧力注入は、このように、神経変位の危険性を増加させる、イオントフォレーシスよりも組織内に導入される大きな容積を必要とします。現在のプロトcolがnLの範囲内のボリュームを使用して、我々はほとんど記録され、セルの信号品質の顕著な変化を経験しませんでした。システムはまた、行動操作に有用である可能性があるが、神経細胞の記録の安定性に影響を与える可能性があり、より大きなボリュームを注入することを可能にします。帯電した物質を使用するための要件が​​ないとしてイオントフォレーシスを超える圧力注入の明らかな利点は、使用可能な物質の大きい品種です。しかし、pH値をチェックする必要があり、実験と対照物質との間で比較（ 例えば 、生理食塩水）。 質問は、神経活動を操作するための代わりに、このような光遺伝学などの新しい技術の圧力注入の老舗の方法を使用することをなぜ発生する可能性があります。よくげっ歯類に設立されたが、光遺伝学は、まだ確実アカゲザルで確立されていません。特に、それはまだ特定の神経伝達物質のタイプの細胞の局所操作は選択できません。長期的には、我々が表示さ認知機能の神経基盤を解明にoptogentic操作の利点を持つ薬理学的操作の利点の組み合わせのための大きな可能性。 ここでは、圧力噴射がアカゲザルの挙動、薬理学的に覚醒の脳内の局所的に制限された領域を操作するために使用することができる方法を示しています。我々は、この方法は、神経活動のダイナミクスに神経調節貢献を調査するために他の科学者を鼓舞することを願っています。

In cortical and subcortical areas, neuronal activity is affected by various neuromodulators, for example acetylcholine1. These modulatory effects on neuronal responses have been reported in in vitro studies2, as well as in electrophysiological recordings from anesthetized animals3 and systemic pharmacological manipulations in humans4. Nevertheless, the exact role of different neuromodulators and the involvement of various receptor subtypes are largely unknown. To measure the effects of specific neuromodulators on the activity of single neurons, it is desirable to induce a temporary neuromodulator change as close as possible to the recording electrode. Furthermore, it is important that those manipulations are done in awake animals, as cognitive functions are only present in the absence of anesthesia. Additionally, anesthesia interacts with cholinergic and GABAergic systems5,6 and can lead to changes in neural activity3.
Within the last decades, two main methods of local drug delivery have been developed and refined: iontophoresis and pressure injection. In both methods drugs are delivered through micropipettes made of either glass or steel. With iontophoresis, an electrical current regulates the release of the drug7. Additionally, there is a significant contribution of electro-osmosis to the total amount of ejected molecules8, correlating with the tip diameter9 of the micropipette as well as with the concentration8 of the substance used. Iontophoresis is a powerful tool to quickly and precisely manipulate small volumes of nervous tissue. For iontophoretic injections, multi-barrel micropipettes are usually used10, with one acting as a recording device while the other positions serve as delivery pipettes. A limitation of this method is that only charged molecules can be used, severely limiting the selection of drugs. 
Pressure injection uses either air compression or mechanical pressure to eject a substance from a micropipette. Using this method any soluble substance, charged or uncharged, can be used, including large molecules. The method of pressure injection was first described by Reyniers in 1933 and further refined in the 1950s (see Lalley11 for a review). In the 1980s the method was further refined to allow delivery of amounts in the nanoliter range (mainly lidocain12) to a defined brain area13 while simultaneously performing single-cell recording. The ejected volume was usually monitored by observing the movement of a marker, such as the meniscus in the upper part of the pipette13. Pressure injection was first used in the 1990s in awake animals, both extracellularly14 and intracellularly15,16. Based on the cumulative expertise gained in these studies it is now possible to reliably record from different brain structures in combination with pharmacological manipulation (see17 for a comparison of recent pressure injection systems). 
An enduring open issue for both drug delivery methods is the difficulty in determining the precise volume injected. This is an even bigger challenge for experiments with awake, behaving rhesus monkeys where the animal performs the experimental task in a separate room. This can be alleviated by the use of a software-controlled system instead of relying on a visual marker to continuously monitor an injection. 
The system described here is an extension of a well-established electrophysiological recording system (Mini Matrix System) and combines an injection pipette with multiple parallel-oriented recording electrodes at defined distances in a customizable arrangement. Pharmacological manipulation of the tissue near the recording electrode is possible using only a small amount of substance, ensuring a fast recovery and allowing multiple blocks of injection and control/recovery within the limited time window offered by the behavioral task of the animal.

<table><tbody><tr><td>(-)-Scopolamine hydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>55-16-3</td><td>Mr 339.81 g/mol</td></tr><tr><td>NaCl 0.9%&amp;nbsp;</td><td>B. Braun Melsungen AG</td><td>3079870</td><td>5ml&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Terg-a-zyme</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z273287</td><td>enzyme detergen</td></tr><tr><td>Hydrogen peroxide</td><td>Roth</td><td></td><td>Used in 3% solution with deionized water</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Chemie-Vertieb Hannover</td><td>104642</td><td>70%</td></tr><tr><td>Deionized water</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Injekt 40 Duo</td><td>B. Braun Melsungen AG</td><td>9166432V</td><td>Syringe and needle&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Eppendorf Safe-Lock microcentrifuge tubes, amber</td><td>Eppendorf</td><td>0030 120.191</td><td>1,5ml&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Quarzglass micropipette</td><td>Thomas Recording</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Recording electrode</td><td>Thomas Recording</td><td></td><td>quartz/platinum-tungsten fiber electrode; impedance value 1-2 M&amp;Omega;&amp;nbsp; and 0.3-0.5 M&amp;Omega;</td></tr><tr><td>PharmedBPT-Schlauch</td><td>Saint-Gobain Performance Plastics&amp;nbsp;</td><td>3702003</td><td>&amp;nbsp;Size: 0,25 x 2,05 mm (Wd: 0,9mm)</td></tr><tr><td>Loctite 401</td><td>Henkel</td><td>233641</td><td>Superglue</td></tr><tr><td>Silicon oil</td><td>Thomas Recording</td><td>M-1000</td><td></td></tr><tr><td>Minisart RC15</td><td>Sartorius</td><td>17761----------R</td><td>Syringe filter</td></tr><tr><td>Multichannel Micro Injection System</td><td>Thomas Recording</td><td></td><td>multichannel microelectrode manipulator &amp;ldquo;System Eckhorn&amp;rdquo; equipped with microelectrodes and micropipettes and a precision multichannel microinjection pump</td></tr><tr><td>McLab</td><td>custom</td><td></td><td>internal lab software to control stimulus presentation</td></tr></tbody></table>

a pressure injection system for investigating the neuropharmacology of information processing in awake behaving macaque monkey cortex

The top-down modulation of feed-forward cortical information processing is functionally important for many cognitive processes, including the modulation of sensory information processing by attention. However, little is known about which neurotransmitter systems are involved in such modulations. A practical way to address this question is to combine single-cell recording with local and temporary neuropharmacological manipulation in a suitable animal model. Here we demonstrate a technique combining acute single-cell recordings with the injection of neuropharmacological agents in the direct vicinity of the recording electrode. The video shows the preparation of the pressure injection/recording system, including preparation of the substance to be injected. We show a rhesus monkey performing a visual attention task and the procedure of single-unit recording with block-wise pharmacological manipulations.

図2は、注入プロセスを実施した一方で、サルが行わ空間的注意のタスクを示しています。サルを記録ニューロンの受容野内に位置する刺激（出席-中）、受容野（出席アウト）や固定点（出席-修正を）の外側に位置刺激のいずれかに出席するために訓練されました。これらの条件は異なる注意状態における神経活動の比較を可能にします。 図3はスコポラミン、ムスカリン性コリン作動性拮抗薬を用いた実験では、サンプルニューロンの周囲の刺激時間のヒストグラムを示しています。プロットは、細胞の好ましい方向に移動するパターンがニューロンの受容野の内側に提示され、動物が出席された注射なし、対スコポラミン注射時の応答抑制を示しています。 2最初のピークは、ニューロンを表します9; sのオンに応答して、その受容野の内側に表示される空間キューのオフセット。これは、500ミリキュー発症後、画面に表示された移動パターンに応じて続いています。灰色斜線部は、すべての試験の平均発火率を計算するために使用される分析期間を示しています。緑豊かなエリアには、細胞の発火率にスコポラミン注射の抑制の影響を強調しています。濃い緑色の領域は、分析期間内に抑制を示しています。 図4Aは、三注意条件のそれぞれにおけるサンプルニューロンの平均発火率にスコポラミンの効果を示します。 2つの空間の注目条件（内部または記録ニューロンの受容野の外に注意）のためだけでなく、感覚的条件（固定点で注目さ）のためのニューロンの発火率は、射出ブロック（灰色の影付きの最初の注射直後に低下しましたありますa）および回復ブロックの間には、注入前と同じレベルまでの遅延の後に増加しました。 図4Bは、生理食塩水（0.9％のNaCl）をスコポラミン注射と同じプロトコルを用いて、注入された第2のサンプルのニューロンから記録制御を示しています。注入ブロック中のニューロンの発火率の変化は、制御ブロックと比較して観察されませんでした。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53724/53724fig1.jpg" /> 記録中に薬理学的操作のために使用される図1.セットアップ。（A） は、マイクロインジェクションポンプと電極とマイクロピペットを搭載した電気生理学的記録システムを示します。シリコンオイルは、電極とマイクロピペットを潤滑するために挿入されるguidetubeギャップは、拡大して示されています。 （B）は、（上記の）例のマイクロピペットを表示します記録電極（下）。サイズ比較のために、ユーロセント（直径：16ミリメートル）が下に置かれている。 <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53724/53724fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53724/53724fig2.jpg" /> 図2.タスクのデザインが空間的注意を案内する。サルは頭出しをドットパターンで運動方向の変化を検出するために訓練されました。図中、またはその外側に示されるようにキューは、いずれの（出席アウト）、（出席イン）ニューロンの受容野の中に置きました。感覚対照として、サルが注視点の輝度変化を検出するために訓練された（出席フィックス）。 <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53724/53724fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> &lt;<html> imgのalt = &quot;図3&quot; SRC = &quot;/ファイル/ ftp_upload / 53724 / 53724fig3.jpg&quot; /&gt; 発火率にアンタゴニストスコポラミンの図3.影響サンプルニューロンのために周囲の刺激時間のヒストグラムは、射出ブロックの間および制御ブロックの間に出席イン条件（記録ニューロンの受容野内部注意）のために示されています。 x軸は、スパイクでの発火率/秒を示しているキュー発症とy軸後のミリ秒単位の時間を示しています。灰色の領域は、裁判平均発火率を計算するために使用される分析期間を（刺激開始後300〜800ミリ秒）を示します。緑の斜線部分は、二つの条件全体の発火率で抑制を示しています。濃い緑色は、分析期間内に抑制を強調しています。 <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53724/53724fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> ジル/ ftp_upload / 53724 / 53724fig4.jpg &quot;/&gt; 発火率にスコポラミンおよび生理食塩水の図4.影響。（A）拮抗薬スコポラミン注射。実験の過程で、図3から試料セルのトライアル平均発火率は、3つすべての注意の条件のための好適な刺激のために示されています。 x軸は分で試験開始時刻を示して、y軸は、秒あたりのスパイクの単位の発火率を示しています。記号（ <img alt="プラス" src="/files/ftp_upload/53724/53724plussign.jpg" />出席-で、 <img alt="サークル" src="/files/ftp_upload/53724/53724circle.jpg" />出席した修正を、 <img alt="Trianle" src="/files/ftp_upload/53724/53724triangle.jpg" /> ）アウト出席ごとに正常に実行さ試験における分析期間内のニューロンの発火率を表し、水平線（実線：出席-で、点線：出席-修正を、破線：出席アウト）の平均発火率を示し、三つの異なる実験BLocks（コントロール、注射、回復）。灰色の網掛け部分は、最初の注射から始まり、最後の注射後1分を終了、注入ブロックを示しています。注入ブロック0.1モルスコポラミンの2 nLの間に2 NL / sの射出速度で毎分を注入しました。 （B）生理食塩水注射。対照実験の過程で試料セルの発火率は、3つすべての注意の条件のための好適な刺激のために示されています。グレー斜線部分は、生理食塩水注入のブロックを視覚化したものである。 <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53724/53724fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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A Pressure Injection System for Investigating the Neuropharmacology of Information Processing in Awake Behaving Macaque Monkey Cortex

Here, we show the pressure injection of neuropharmacological substances during single-cell recording in an awake, behaving macaque monkey. This procedure allows pharmacological manipulation in the direct vicinity of a cortical recording site.

目を覚まし振る舞うマカクザルのCortexに情報処理の神経薬理学の調査用圧力注入システム

The top-down modulation of feed-forward cortical information processing is functionally important for many cognitive processes, including the modulation ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Behavior

8.3K ビュー.  German Primate Center. Here, we show the pressure injection of neuropharmacological substances during single-cell recording in an awake, behaving macaque monkey. This procedure allows pharmacological manipulation in the direct vicinity of a cortical recording site. 

ビデオ: A Pressure Injection System for Investigating the Neuropharmacology of Information Processing in Awake Behaving Macaque Monkey Cortex

Multi-layer Cortical Ca2+ Imaging in Freely Moving Mice with Prism Probes and Miniaturized Fluorescence Microscopy

In vivo circuit and cellular level functional imaging is a critical tool for understanding the brain in action. High resolution imaging of mouse cortical neurons with two-photon microscopy has provided unique insights into cortical structure, function and plasticity. However, these studies are limited to head fixed animals, greatly reducing the behavioral complexity available for study. In this paper, we describe a procedure for performing chronic fluorescence microscopy with cellular-resolution across multiple cortical layers in freely behaving mice. We used an integrated miniaturized fluorescence microscope paired with an implanted prism probe to simultaneously visualize and record the calcium dynamics of hundreds of neurons across multiple layers of the somatosensory cortex as the mouse engaged in a novel object exploration task, over several days. This technique can be adapted to other brain regions in different animal species for other behavioral paradigms.

Multi-layer Cortical Ca2+ Imaging in Freely Moving Mice with Prism Probes and Miniaturized Fluorescence Microscopy

Here, we present a procedure for performing large-scale Ca2+ imaging with cellular-resolution across multiple cortical layers in freely moving mice. Hundreds of active cells can be observed simultaneously using a miniature, head-mounted microscope coupled with an implanted prism probe.

多層皮質Ca<sup&gt; 2+</sup&gt;プリズムプローブと小型蛍光顕微鏡を用いて自由に動くマウスのイメージング

In vivo circuit and cellular level functional imaging is a critical tool for understanding the brain in action. High resolution imaging of mouse cortical ...

行動学

Preparation of an Awake Mouse for Recording Neural Responses and Injecting Tracers

It is well known that anesthesia alters neural response properties in various regions of the brain.13. In the auditory system, fundamental response properties of brainstem neurons including threshold, frequency specificity, and inhibitory sidebands are altered in significant ways under anesthesia1-2. These observations prompted physiologists to seek ways to record from single neurons without the contaminating effects of anesthesia. One result was a decerebrate preparation, where the brainstem was completely transected at the level of the midbrain4. The drawbacks of this preparation are a formidable surgery, the elimination of descending projections from the forebrain, and an inability to use sensory stimulation to examine structures above the midbrain. A different strategy has been to implant electrode arrays chronically to record from single neurons and multiunit clusters while the animal is awake and/or behaving5,6. These techniques however are not compatible with injecting tracer dyes after first electrophysiologically characterizing a brain structure. To avoid altering neural response properties with anesthetics while recording electrophysiological response properties from single neurons, we have adapted a head restraint technique long used in bats7-9 to mouse10-12. Using this method, we are able to conduct electrophysiological recordings over several days in the unanesthetized mouse. At the end of the recording sessions, we can then inject a dye to reconstruct electrode positions and recording sites or inject a tracer so that pathways to and from the recording loci can be determined. This method allows for well isolated single neuron recordings over multiple days without the use anesthetics.

Electrophysiological characterization of neuronal responses is important for understanding brain function and for guiding the placement of dyes for pathway tracing. However, many studies are performed in anesthetized animals. To understand brain function without anesthetics, we developed a method to record neuronal response properties and inject dyes in awake mouse.

神経応答を記録し、トレーサーを注入するための覚醒マウスの作製

It is well known that anesthesia alters neural response properties in various regions of the brain.13.  In the auditory system, fundamental response ...

神経科学

Juxtacellular Monitoring and Localization of Single Neurons within Sub-cortical Brain Structures of Alert, Head-restrained Rats

There are a variety of techniques to monitor extracellular activity of single neuronal units. However, monitoring this activity from deep brain structures in behaving animals remains a technical challenge, especially if the structures must be targeted stereotaxically. This protocol describes convenient surgical and electrophysiological techniques that maintain the animal&#8217;s head in the stereotaxic plane and unambiguously isolate the spiking activity of single neurons. The protocol combines head restraint of alert rodents, juxtacellular monitoring with micropipette electrodes, and iontophoretic dye injection to identify the neuron location in post-hoc histology. While each of these techniques is in itself well-established, the protocol focuses on the specifics of their combined use in a single experiment. These neurophysiological and neuroanatomical techniques are combined with behavioral monitoring. In the present example, the combined techniques are used to determine how self-generated vibrissa movements are encoded in the activity of neurons within the somatosensory thalamus. More generally, it is straightforward to adapt this protocol to monitor neuronal activity in conjunction with a variety of behavioral tasks in rats, mice, and other animals. Critically, the combination of these methods allows the experimenter to directly relate anatomically-identified neurophysiological signals to behavior.

This protocol describes the design and surgical implantation of a head-restraining mechanism to monitor neuronal activity in sub-cortical brain structures in alert rats. It delineates procedures to isolate single neurons in the juxtacellular configuration and to efficiently identify their anatomical locations.

アラート、頭部拘束ラットの皮質下脳構造内の単一ニューロンのJuxtacellular監視とローカリゼーション

There are a variety of techniques to monitor extracellular activity of single neuronal units. However, monitoring this activity from deep brain structures ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Micro-injections of Inhibitory Agents in the Rodent Brain

Here we describe a method for the construction of a single-use &#8220;injectrode&#8221; using commercially accessible and affordable parts. A probing system was developed that allows for the injection of a drug while recording electrophysiological signals from the affected neuronal population. This method provides a simple and economical alternative to commercial solutions. A glass pipette was modified by combining it with a hypodermic needle and a silver filament. The injectrode is attached to commercial microsyringe pump for drug delivery. This results in a technique that provides real-time pharmacodynamics feedback through multi-unit extracellular signals originating from the site of drug delivery. As a proof of concept, we recorded neuronal activity from the superior colliculus elicited by flashes of light in rats, concomitantly with delivery of drugs through the injectrode. The injectrode recording capacity permits the functional characterization of the injection site favoring precise control over the localization of drug delivery. Application of this method also extends far beyond what is demonstrated here, as the choice of chemical substance loaded into the injectrode is vast, including tracing markers for anatomic experiments.

Here, we craft a glass pipette with dual functions: inhibition of deep brain structures by microinjections of drugs and real-time monitoring of their effects through simultaneous electrophysiological recordings.

同時電気生理学的記録およびげっ歯類の脳における阻害剤のマイクロ注射

Here we describe a method for the construction of a single-use &#8220;injectrode&#8221; using commercially accessible and affordable parts. A probing ...

Induction of an Isoelectric Brain State to Investigate the Impact of Endogenous Synaptic Activity on Neuronal Excitability In Vivo

The way neurons process information depends both on their intrinsic membrane properties and on the dynamics of the afferent synaptic network. In particular, endogenously-generated network activity, which strongly varies as a function of the state of vigilance, significantly modulates neuronal computation. To investigate how different spontaneous cerebral dynamics impact single neurons&#39; integrative properties, we developed a new experimental strategy in the rat consisting in suppressing in vivo all cerebral activity by means of a systemic injection of a high dose of sodium pentobarbital. Cortical activities, continuously monitored by combined electrocorticogram (ECoG) and intracellular recordings are progressively slowed down, leading to a steady isoelectric profile. This extreme brain state, putting the rat into a deep comatose, was carefully monitored by measuring the physiological constants of the animal throughout the experiments. Intracellular recordings allowed us to characterize and compare the integrative properties of the same neuron embedded into physiologically relevant cortical dynamics, such as those encountered in the sleep-wake cycle, and when the brain was fully silent.

Induction of an Isoelectric Brain State to Investigate the Impact of Endogenous Synaptic Activity on Neuronal Excitability In Vivo

This procedure performs long-lasting in vivo intracellular recordings from single neurons during physiologically relevant cerebral states and after complete abolition of ongoing electrical activities, resulting in an isoelectric brain state. The physiological constants of the animal are carefully monitored during the transition to the artificial comatose condition.

等電点電気泳動脳の状態の誘導は、神経細胞の興奮に内因性シナプス活性の影響を調査するために、<em&gt;インビボ</em

The way neurons process information depends both on their intrinsic membrane properties and on the dynamics of the afferent synaptic network. In ...

Investigating Object Representations in the Macaque Dorsal Visual Stream Using Single-unit Recordings

Previous studies have shown that neurons in parieto-frontal areas of the macaque brain can be highly selective for real-world objects, disparity-defined curved surfaces, and images of real-world objects (with and without disparity) in a similar manner as described in the ventral visual stream. In addition, parieto-frontal areas are believed to convert visual object information into appropriate motor outputs, such as the pre-shaping of the hand during grasping. To better characterize object selectivity in the cortical network involved in visuomotor transformations, we provide a battery of tests intended to analyze the visual object selectivity of neurons in parieto-frontal regions.

A detailed protocol to analyze object selectivity of parieto-frontal neurons involved in visuomotor transformations is presented.

単一ユニットの録音を使用してサルの背側視覚ストリームのオブジェクト表現を調査

Previous studies have shown that neurons in parieto-frontal areas of the macaque brain can be highly selective for real-world objects, disparity-defined ...

Convection Enhanced Delivery of Optogenetic Adeno-associated Viral Vector to the Cortex of Rhesus Macaque Under Guidance of Online MRI Images

In non-human primate (NHP) optogenetics, infecting large cortical areas with viral vectors is often a difficult and time-consuming task. Here, we demonstrate the use of magnetic resonance (MR)-guided convection enhanced delivery (CED) of optogenetic viral vectors into primary somatosensory (S1) and motor (M1) cortices of macaques to obtain efficient, widespread cortical expression of light-sensitive ion channels. Adeno-associated viral (AAV) vectors encoding the red-shifted opsin C1V1 fused to yellow fluorescent protein (EYFP) were injected into the cortex of rhesus macaques under MR-guided CED. Three months post-infusion, epifluorescent imaging confirmed large regions of optogenetic expression (&#62;130 mm2) in M1 and S1 in two macaques. Furthermore, we were able to record reliable light-evoked electrophysiology responses from the expressing areas using micro-electrocorticographic arrays. Later histological analysis and immunostaining against the reporter revealed widespread and dense optogenetic expression in M1 and S1 corresponding to the distribution indicated by epifluorescent imaging. This technique enables us to obtain expression across large areas of the cortex within a shorter period of time with minimal damage compared to the traditional techniques and can be an optimal approach for optogenetic viral delivery in large animals such as NHPs. This approach demonstrates great potential for network-level manipulation of neural circuits with cell-type specificity in animal models evolutionarily close to humans.&#160;

Here, we demonstrate magnetic resonance (MR)-guided convection enhanced delivery (CED) of viral vectors into the cortex as an efficient and simplified approach for achieving optogenetic expression across large cortical areas in the macaque brain.

オンラインMRI画像のガイダンスの下でレソスマカクの皮質への光遺伝学アデノ関連ウイルスベクターの対流強化された配信

In non-human primate (NHP) optogenetics, infecting large cortical areas with viral vectors is often a difficult and time-consuming task. Here, we ...

Microinjectrode System for Combined Drug Infusion and Electrophysiology

This microinjectrode system is designed for drug infusion, electrophysiology, and delivery and retrieval of experimental probes, such as microelectrodes and nanosensors, optimized for repeated use in awake, behaving animals. The microinjectrode system can be configured for multiple purposes: (1) simple arrangement of the cannula for placement of an experimental probe that would otherwise be too fragile to penetrate the dura mater, (2) microfluidic infusion of a drug, either independently or coupled to a cannula containing an experimental probe (i.e., microelectrode, nanosensor). In this protocol we explain the step by step construction of the microinjectrode, its coupling to microfluidic components, and the protocol for use of the system in vivo. The microfluidic components of this system allow for delivery of volumes on the nanoliter scale, with minimal penetration damage. Drug infusion can be performed independently or simultaneously with experimental probes such as microelectrodes or nanosensors in an awake, behaving animal. Applications of this system range from measuring the effects of a drug on cortical electrical activity and behavior, to understanding the function of a specific region of cortex in the context of behavioral performance based on probe or nanosensor measurements. To demonstrate some of the capabilities of this system, we present an example of muscimol infusion for reversible inactivation of the frontal eye field (FEF) in rhesus macaque during a working memory task.

We present a microinjectrode system designed for electrophysiology and assisted delivery of experimental probes (i.e., nanosensors, microelectrodes), with optional drug infusion. Widely available microfluidic components are coupled to a cannula containing the probe. A step-by-step protocol for microinjectrode construction is included, with results during muscimol infusion in macaque cortex.

複合薬物注入と電気生理学のためのマイクロインジェクストローデシステム

This microinjectrode system is designed for drug infusion, electrophysiology, and delivery and retrieval of experimental probes, such as microelectrodes ...

Injections of AAV Vectors for Optogenetics in Anesthetized and Awake Behaving Non-Human Primate Brain

Optogenetic techniques have revolutionized neuroscience research and are poised to do the same for neurological gene therapy. The clinical use of optogenetics, however, requires that safety and efficacy be demonstrated in animal models, ideally in non-human primates (NHPs), because of their neurological similarity to humans. The number of candidate vectors that are potentially useful for neuroscience and medicine is vast, and no high-throughput means to test these vectors yet exists. Thus, there is a need for techniques to make multiple spatially and volumetrically accurate injections of viral vectors into NHP brain that can be identified unambiguously through postmortem histology. Described herein is such a method. Injection cannulas are constructed from coupled polytetrafluoroethylene and stainless-steel tubes. These cannulas are autoclavable, disposable, and have low minimal-loading volumes, making them ideal for the injection of expensive, highly concentrated viral vector solutions. An inert, red-dyed mineral oil fills the dead space and forms a visible meniscus with the vector solution, allowing instantaneous and accurate measurement of injection rates and volumes. The oil is loaded into the rear of the cannula, reducing the risk of co-injection with the vector. Cannulas can be loaded in 10 min, and injections can be made in 20 min. This procedure is well suited for injections into awake or anesthetized animals. When used to deliver high-quality viral vectors, this procedure can produce robust expression of optogenetic proteins, allowing optical control of neural activity and behavior in NHPs.

As currently implemented, optogenetics in non-human primates requires injection of viral vectors into the brain. An optimal injection method should be reliable and, for many applications, capable of targeting individual sites of arbitrary depth that are readily and unambiguously identified in postmortem histology. An injection method with these properties is presented.

非ヒト霊長類脳における麻酔および覚醒行動のための光遺伝学のためのAAVベクターの注射

Optogenetic techniques have revolutionized neuroscience research and are poised to do the same for neurological gene therapy. The clinical use of ...

Head Implants for the Neuroimaging of Awake, Head-Fixed Rats

Anesthetics, commonly used in preclinical and fundamental scientific research, have a depressive influence on the metabolic, neuronal, and vascular functions of the brain and can adversely influence neurophysiological results. The use of awake animals for research studies is advantageous but poses the major challenge of keeping the animals calm and stationary to minimize motion artifacts throughout data acquisition. Awake imaging in smaller-sized rodents (e.g., mice) is very common but remains scant in rats as rats are bigger, stronger, and have a greater tendency to oppose movement restraints and head fixation over the long durations required for imaging. A new model of neuroimaging of awake, head-fixed rats using customized hand-sewn slings, 3D-printed head implants, head caps, and a headframe is described. The results acquired following a single trial of single-whisker stimulation suggest an increase in the intensity of the evoked functional response. The acquisition of the evoked functional response from awake, head-fixed rats is faster than that from anesthetized rats, reliable, reproducible, and can be used for repeated longitudinal studies.

A detailed new procedure for functional imaging of awake, head-fixed rats is described.

覚醒した頭部固定ラットのニューロイメージングのための頭部インプラント

Anesthetics, commonly used in preclinical and fundamental scientific research, have a depressive influence on the metabolic, neuronal, and vascular ...

目を覚まし振る舞うマカクザルのCortexに情報処理の神経薬理学の調査用圧力注入システム

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