עבודה זו נתמכה על ידי מענקים של דויטשה Forschungsgemeinschaft דרך מרכז שיתופי מחקר 889 &quot;המנגנונים התאיים של בעיבוד החושי&quot; ל- ST (פרויקט C04). אנו מודים סינא פלומר, לאונור Burchardt, דירק Prüsse, קלאוס Heisig ואת ראלף Brockhausen לתמיכה טכנית חיה הקשורות ומשתפי הפעולה שלנו ביחידה תאי גזע של מרכז הפרימאטים הגרמני, ד&quot;ר קתרינה Debowski ואנה Magerhans עבור סיוע טכני תהליך סינון.

טיפול בבעלי חיים וכל הפרוצדורות בוצעו בהתאם לחוקים הגרמנים טיפול בבעלי חיים מסדיר ואושרו על ידי ממשלת המחוז של בראונשווייג, סקסוניה תחתונה, גרמניה. הערה: ככל שהניסוי מבוצע in vivo, חשוב לשמור על הסטנדרטים היגיינה הגבוהים ביותר האפשריים. במידת האפשר, לעבוד בתנאים סטריליים. 1. הכנת מערכת ההזרקה / הקלטה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר את הצינור המחבר בין micropipette עם המזרק. השתמש אורך הקצר של צינור אפשרי הניסוי הגדרת בין משאבת הזרקה ומערכת הקלטה אלקטרו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה את צינורות המדריך של שיטת הרישום באמצעות חוטי ניקוי. טובלים אותם בשמן סיליקון סטרילי ולהאכיל אותם דרך צינורות מדריך הפרט מספר פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את micropipette זכוכית קוורץ לתוך צינור מדריך אחד מערכת ההקלטה. ראה איור 1 א. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר תיקון micropipette במערכת ההקלטה, לצרף את צינור סטרילי לפין המתכת של micropipette. שמור על עצמך; למרות micropipette הוא קבוע במערכת זה יכול לשבור בקלות בעת צירוף הצינור. השתמש בשתי פינצטה סטרילית להפעיל לחץ שווה על פיני צינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשתמש בדבק סופר נוזלי לאטום את הצומת בין צינור micropipette. חכו לפחות שעה 3 עבור דבק להקשיח לפני מילוי micropipette עם נוזל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס microelectrodes (למשל, טונגסטן פלטינה מבודדת קוורץ זכוכית) לעמדות האחרות של מערכת ההקלטה לפני או לאחר כניסת micropipette. </li></ol> 2. הכנה והאלכוהול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר צינורות 1.5 מיליליטר microcentrifuge לאחסון מאוחר יותר של פתרונות הזרקה באמצעות חיטוי או הליך אמין אחר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול את hydrochloride סקופולמין חומר המקביל להכין 5 מ&quot;ל של פתרון 0.1 טוחנת. ממיסים ב תמיסת מלח סטרילית (0.9% NaCl). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת i בתנאים סטרילייםנה עשן מכסה מנוע, לסנן את הפתרון באמצעות מזרק מסנן עם קוטר נקבובי גדול מספיק, למשל, 0.2 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתחת למכסה המנוע קטר, aliquot הפתרון לתוך כרכים מספיק עבור ניסוי בודד, למשל, עבור סקופולמין, 500 μl בצינור 1.5 מ&quot;ל microcentrifuge סטרילית. השתמש צינורות כהים כדי להגן על החומר מפני אור; לחילופין, לעטוף צינורות בנייר אלומיניום. לקבלת סקופולמין, לאחסן הפתרון עד 14 ימים על 4 מעלות צלזיוס. </li></ol> 3. הכנת יומי של מערכת ההזרקה / הקלטה הערה: כאשר מותקנים במערכת ההקלטה, אלקטרודות micropipette מאוחסנים פתרון אנזים (Tergazyme, 1 פתרון% עם מים ללא יונים) בין הקלטות. השלבים הבאים חייבים להתבצע לפני כל הקלטה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף צינור של החומר להיות מוזרק. אפשר לו להגיע RT אם בקירור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבטל את מערכת הזרקה / הקלטה מפתרון האנזים ולשטוף אלקטרודותו micropipette עם מים ללא יונים לנקות לחלוטין של פתרון האנזים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המכסה הקדמי של מערכת הקלטה כדי לבדוק חזותית את החותם בין micropipette צינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל שמן סיליקון סטרילי לפער צינור מדריך (ראה איור 1 א) וטיפים של אלקטרודות micropipette כדי לשמן את המערכת עבור תנועה חלקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק טיפים של אלקטרודות micropipette באמצעות מיקרוסקופ כדי לוודא שהם שלמים. יישר את האלקטרודות ואת micropipette מתחת למיקרוסקופ, כך שהם להאריך מתוך צינורות מדריך עם אותו אורך. כונן אותם לתוך צינורות המדריך, מפסיק ברגע שהם כבר לא נראים לעין. זה מוגדר עמדת אלקטרודה אפס. הגדר את עומק אלקטרודות micropipette ל -0 התוכנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממלאי מזרק סטרילי עם מי מלח סטרילית להכניס את המחט לתוך הצינור, נזהר שלא לחדור את החומה של הצינור. להסיע את micropipette מתוך צינור מדריך Visuשליטה אל זרימת החומר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סומק לפחות 2 מ&quot;ל תמיסת מלח סטרילית דרך הצינור micropipette על מנת להבטיח שום האוויר נשאר בתוך המזרק או בצינור. אין להפעיל לחץ רב מדי על הבוכנה של המזרק. ודא את הצומת בין הצינור micropipette הוא חתום. אם הדליפה גלויה, מחדש להדביק את הצומת (ראה שלב 1.5) ולדחות הקלטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממלאי מזרק סטרילי חדש עם הפתרון להיות מוזרק ולהחליף אותו עם החבית של המזרק המלוח, כלומר, לשמור את המחט של המזרק מלא המלוח בצינור. יש לוודא שאין אוויר מועבר למערכת. זו מושגת הטובה ביותר על ידי מילוי רכזת המחט עם מי מלח לאחר הסרת החבית המלאה המלוחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרוקן את המערכת עם 250 μl של הפתרון להיות מוזרק, על מנת להסיר את מלוחים לחלוטין מהצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בתוכנת שליטה מוטורית, לחזור אלקטרודות micropipette לתוך guidetubesto לעומק של לפחות -500 מיקרומטר. </li><li&gt; מנמיכה את טבעת צינור מדריך (איור 1 א) לחלק התחתון של צינורות המדריך כדי לשמור על המיקום היחסי שלהם קבוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה את הבסיס של המערכת עם אתנול, ובמיוחד כאשר זה ייגע לתא ההקלטה של ​​הקוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סגור את מערכת ההקלטה על ידי החלפת המכסה הקדמי הידוק הברגים. </li></ol> 4. אימות של מערכת ההזרקה הערה: למרות שהחברה מכיילת את המערכת, מומלץ לאמת את הכרכים נפלטו עם החומרים המשמשים ניסוי ההגדרה (צינורות, מזרקים וכו &#39;). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את המערכת כמתואר בשלב 3, שמירה אלקטרודות micropipette המורחבת מתוך צינורות מדריך. בעומק של לפחות 7,000 מיקרומטר מומלץ כדי למנוע אובדן של נפח המדידה עקב הידבקות לאורך המשטח החיצוני של micropipette ואלקטרודות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את מערכת ההקלטה במצב זה ישמש במהלך הניסוי וקבע syringe למשאבת microinjection. תקן את המזרק במקום באמצעות גומייה אחיזה מתכווננת (ראה איור 1 א). חלק את החלק הנע של המשאבה עד שהוא במקומו מאחורי הבוכנה של המזרק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות יחידת המנוע שבשליטת תוכנה, להוציא נפח גדול מספיק כדי למדוד בדייקנות, למשל., 1000 NL. עדיף להשתמש שלב אחד בלבד כדי להוציא את הנפח הכולל על מנת למנוע תופעות של פעולה נימי לאורך משטח micropipette. מהירויות נמוכות מאוד (1 NL / s) יכולות גם להוביל את האפקט הזה במהלך הליך האימות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף את הנפח הכולל במיכל תחת micropipette, או בזהירות לאסוף את הירידה נפלט ישירות קצה micropipette. לאמוד את היקף נפלט בעזרת פיפטה ובין בהתחשב עם סולם דיוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על התהליך מספר פעמים כדי לאשר מדידות. </li></ol> 5. הקלטות חריפות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את מיקום XYשל מערכת ההקלטה. זה מגדיר את הנקודה שבה צינורות מדריך להגיע דורה מאטר בתוך חדר הקלטה מושתל כרוני. ודא צינורות המדריך הם חזרו בו לחלוטין (מיקום z צינור מדריך 0). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תביאו את מערכת ההקלטה למצב ולמקם את המזרק משאבת microinjection. תקן את המזרק במקום באמצעות גומייה אחיזה מתכווננת (ראה איור 1 א). חלק את החלק הנע של המשאבה עד שהוא במקומו מאחורי הבוכנה של המזרק. אם ירידה של חומר גלוי בקצה של צינורות מדריך, בזהירות להסיר אותם באמצעות מקלון צמר גפן סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את החיה להקלטת בהתאם לנוהל של המעבדה (ראה 18 להנחיות למשל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מאובטח לעלות את מערכת ההקלטה על חדר ההקלטה של ​​הקוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט באופן ידני להוריד את צינורות מדריך החדרת ההקלטה עד להשגת הדורה, ואז לנסוע האלקטרודות באמצעות שיתוף המנועתוכנת ntrol. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כמו כן, הוא לא ניתן למדוד עכבה של micropipette, כונן הראשון עם אלקטרודות ולבדוק העכבות שלהם באופן קבוע בעומקים שונים. לאחר חדירת הדורה מבוצעת בהצלחה מבלי לפגוע אלקטרודות, לקדם את micropipette. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיע את האלקטרודות ואת micropipette לעומק אלקטרודה היעד שבו השטח של עניין המוח צפוי להימצא. לאט לקדם את האלקטרודה עד שהוא מספיק קרוב כדי להקליט את הפעילות של יחידה אחת, כפי שמעיד יחס אות לרעש טוב את האות המוקלט. חשוב לציין, למקם את האלקטרודה ההקלטה ואת micropipette באותו עומק על מנת להבטיח את המרחק המינימלי בין האלקטרודה micropipette. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במידת האפשר, לשמור על אלקטרודות micropipette בעומק זה עבור הקלטת כולה. עם זאת, אם הדרך היחידה לשמור על איכות אות של התא רשם היא להעביר את האלקטרודות, ואז לנסוע את האלקטרודות ואת micropipetteבעת ובעונה אחת כדי לשמור על המרחק ביניהם. </li></ol></li></ol> 6. שימו לב מרחבית משימות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסדרה של ניסויים, הוצגו שני דפוסי נקודה נעו על המסך, אחד ממוקם בתוך השדה הפתוח של הנוירון הקליט מבחוץ השניים של זה, יחד עם נקודת קיבעון הציגה מאתר מרכזי, החיה צריכה foveate לאורך כל ניסוי 19, 20. הערה: הקוף הוא אימן להגיב שינוי כיוון בדפוס נקודות הרמז (במקרה היעד) תוך התעלמות כל שינוי כיוון בדפוס הנקודות האחר, והוא מתוגמל טיפת הנוזל על כל השלמה מוצלחת של ניסוי 19, 20. כתנאי שליטה חושיים, הקוף יש לדווח על שינוי בהיקות של נקודת הקיבעון תוך התעלמות הוא דפוסי הנקודה נעו (ראה איור 2 עבור תיאור מפורט יותר של המשימה). </li></ol> 7. מניפולציה תרופתית בזמן הקלטה <p&gt; הערה: בעוד קוף ביצוע המשימה, להזריק את החומר באופן גוש-חכם. שלושה בלוקים רצופים מוגדרים: שליטה, אשר משמש כבסיס; זריקה, שבמהלכו חומר נפלט; התאוששות, שבמהלכו התאים ממוקדים ידי חזרת הזרקת לקו הבסיס. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך לחסום זריקה, להזריק כמות מוגדרת מראש של החומר במרווחי זמן קבועים למשל., 2 nl מכל רגע בשיעור של 2 s / NL. בדוגמה זו, השתמש hydrochloride סקופולמין. תהליך ההזרקה נשלט באמצעות תוכנה הספק אפשרויות שונות. לדוגמא, השתמש בפונקצית הצעד להגדיר עוצמת זריקה, ולחץ על כפתור זריקה מכל רגע על פי השעון של תוכנת הצריבה. הערה: משך הזמן המדויק של גוש הזריקה היא חומר ולהתנסות תלויים, למשל, לשימוש סקופולמין 2 זריקות NL כל דקה במשך 10 דקות (20 nl בסך הכל).. עדיף שלא לקדם את האלקטרודות ואת דורי micropipetteng לחסום זריקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הערה הזמן והמשפט שבמהלכו החומר מוזרק, עומק אלקטרודות micropipette, כמו גם את כמות החומר נפלט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את הבלוק הזרקה עם בלוק התאוששות, שבו אין חומר מוזרק. משך בלוק ההתאוששות הוא חומר ספציפי צריך להיות מוגדר ב-בדיקות טרום. לפקח ולשמור על איכות ההקלטה של ​​יחידות בודדות שנבחרו עד סוף בלוק ההתאוששות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלושה רחובות כל עוד את איכות ההקלטה ומוטיבציה של הקוף לאפשר. </li></ol> 8. ונהלי הקלטת ההודעה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הקלטת נתונים, לחזור אלקטרודות micropipette לתוך צינורות מדריך ולאחר מכן באופן ידני לחזור בו צינורות המדריך. לבטל את מערכת ההקלטה מאולם ההקלטה של ​​הקוף. שחרר את מזרק משאבת ההזרקה ולהעביר את המערכת לאזור ההכנה לניקוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ידית החיה(כולל ניקוי של תא ההקלטה 18) על פי הנהלים הקבועים של המעבדה ולהחזיר אותו למתקן הדיור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את החלק החיצוני של צינורות מדריך עם מי חמצן (3%) ולאחר מכן עם מים ללא יונים. אלקטרודות דרייב micropipette מתוך צינורות מדריך, לשטוף עם מי חמצן ומים deionized מכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחליף את הקנה של המזרק עם חבית מזרק המלא עם תמיסת מלח סטרילית, שמירת המחט בצינור. שטוף את הצינור ואת micropipette עם 1-2 מ&quot;ל של תמיסת מלח. לאחר השטיפה, להסיר את החבית ולמלא אותו עם אוויר. הכנס מחדש את הקנה לתוך המחט ולייבש את הצינור ואת micropipette מבפנים על ידי דחיפת אוויר דרך בעדינות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את צינורות מדריך, אלקטרודות המורחבת micropipette שקוע בפתרון האנזים כדי למנוע התייבשות, כמו גם על מנת להבטיח את התפלגות החומר האורגני. </li></ol>

<ol>
	<li>Noudoost, B., Moore, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+neuromodulators+in+selective+attention.">The role of neuromodulators in selective attention.</a> Trends Cogn Sci. 15 (12), 585-591 (2011).</li><li>Jochems, A., Reboreda, A., Hasselmo, M., Yoshida, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholinergic+receptor+activation+supports+persistent+firing+in+layer+III+neurons+in+the+medial+entorhinal+cortex.">Cholinergic receptor activation supports persistent firing in layer III neurons in the medial entorhinal cortex.</a> Behav Brain Res. 254, 108-115 (2013).</li><li>Thiele, A., Herrero, J. L., Distler, C., Hoffmann, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+cholinergic+and+GABAergic+mechanisms+to+direction+tuning,+discriminability,+response+reliability,+and+neuronal+rate+correlations+in+macaque+middle+temporal+area.">Contribution of cholinergic and GABAergic mechanisms to direction tuning, discriminability, response reliability, and neuronal rate correlations in macaque middle temporal area.</a> J Neurosci. 32 (47), 16602-16615 (2012).</li><li>Thienel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscarinic+antagonist+effects+on+executive+control+of+attention.">Muscarinic antagonist effects on executive control of attention.</a> Int J Neuropsychopharmacol. 12 (10), 1307-1317 (2009).</li><li>Anthony, B. L., Dennison, R. L., Aronstam, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+muscarinic+receptor-G+protein+coupling+is+a+general+property+of+liquid+volatile+anesthetics.">Disruption of muscarinic receptor-G protein coupling is a general property of liquid volatile anesthetics.</a> Neurosci Lett. 99 (1-2), 191-196 (1989).</li><li>Yamakura, T., Bertaccini, E., Trudell, J. R., Harris, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anesthetics+and+ion+channels:+molecular+models+and+sites+of+action.">Anesthetics and ion channels: molecular models and sites of action.</a> Annu Rev Pharmacol Toxicol. 41, 23-51 (2001).</li><li>Herr, N. R., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+techniques+for+examining+rapid+dopamine+signaling+with+iontophoresis.">Improved techniques for examining rapid dopamine signaling with iontophoresis.</a> Front Biosci. 5, 249-257 (2013).</li><li>Bevan, P., Bradshaw, C. M., Pun, R. Y., Slater, N. T., Szabadi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relative+contribution+of+iontophoresis+and+electro-osmosis+to+the+electrophoretic+release+of+noradrenaline+from+multi+barrelled+micropipettes+[proceedings].">The relative contribution of iontophoresis and electro-osmosis to the electrophoretic release of noradrenaline from multi barrelled micropipettes [proceedings].</a> Br J Pharmacol. 67 (3), 478-479 (1979).</li><li>Herr, N. R., Kile, B. M., Carelli, R. M., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroosmotic+flow+and+its+contribution+to+iontophoretic+delivery.">Electroosmotic flow and its contribution to iontophoretic delivery.</a> Anal Chem. 80, 8635-8641 (2008).</li><li>Thiele, A., Delicato, L. S., Roberts, M. J., Gieselmann, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+electrode-pipette+design+for+simultaneous+recording+of+extracellular+spikes+and+iontophoretic+drug+application+in+awake+behaving+monkeys.">A novel electrode-pipette design for simultaneous recording of extracellular spikes and iontophoretic drug application in awake behaving monkeys.</a> J Neurosci Meth. 158 (2-4), 207-211 (2006).</li><li>Lalley, P. M., Johansson, H., Windhorst, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Microiontophoresis and Pressure Ejection: Modern Techniques in Neuroscience. , 193-209 (1999).</li><li>Malpeli, J. G., Schiller, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+of+reversible+inactivation+of+small+regions+of+brain+tissue.">A method of reversible inactivation of small regions of brain tissue.</a> J Neurosci Meth. 1 (2), 145-159 (1979).</li><li>Malpeli, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+inactivation+of+subcortical+sites+by+drug+injection.">Reversible inactivation of subcortical sites by drug injection.</a> J Neurosci Meth. 86 (2), 119-128 (1999).</li><li>Dias, E. C., Segraves, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pressure+system+for+the+microinjection+of+substances+into+the+brain+of+awake+monkeys.">A pressure system for the microinjection of substances into the brain of awake monkeys.</a> J Neurosci Meth. 72 (1), 43-47 (1997).</li><li>Szente, M. B., Baranyi, A., Woody, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+protein+kinase+C+inhibitor+H-7on+membrane+properties+and+synaptic+responses+of+neocortical+neurons+of+awake+cats.">Effects of protein kinase C inhibitor H-7on membrane properties and synaptic responses of neocortical neurons of awake cats.</a> Brain Res. 506 (2), 281-286 (1990).</li><li>Woody, C. D., Bartfai, T., Gruen, E., Nairn, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=lntracellular+injection+of+cGMP-dependent+protein+kinase+results+in+increased+input+resistance+in+neurons+of+the+mammalian+motor+cortex.">lntracellular injection of cGMP-dependent protein kinase results in increased input resistance in neurons of the mammalian motor cortex.</a> Brain Res. 386 (1-2), 379-385 (1986).</li><li>Noudoost, B., Moore, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reliable+microinjectrode+system+for+use+in+behaving+monkeys.">A reliable microinjectrode system for use in behaving monkeys.</a> J Neurosci Meth. 194 (2), 218-223 (2011).</li><li>Association of Primate Veterinarians. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cranial Implant Care Guidelines for Nonhuman Primates in Biomedical Research. , (2015).</li><li>Treue, S., Martinez-Trujillo, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feature-based+attention+influences+motion+processing+gain+in+macaque+visual+cortex.">Feature-based attention influences motion processing gain in macaque visual cortex.</a> Nature. 399, 575-579 (1999).</li><li>Martinez-Trujillo, J. C., Treue, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feature-based+attention+increases+the+selectivity+of+population+responses+in+primate+visual+cortex.">Feature-based attention increases the selectivity of population responses in primate visual cortex.</a> Curr Biol. 14 (9), 744-751 (2004).</li></ol>

החוקרים אין לי מה לחשוף.

כאן אנו הדגמנו בפירוט כיצד לבצע זריקות אמינות ומדויקות והקלטות תא בודד באיכות גבוהה עם מערכת הזרקה בלחץ &quot;ה- off- המדף&quot;. למרות ששיטה זו של אספקת סמים בעבר נעשתה שימוש מתנהג קופים (הנסקרת ב 17), המערכת הציגה יש כאן יתרונות, להלן סקירה. כמו באיור 4 א, ​​המערכת המתוארת כאן יכולה לספק מדידה יציבה של פעילות נוירון בודדת עם ובלי זריקות תרופתיות בסביבה הישירה של אתר ההקלטה. כפי שניתן לראות בתרשים 4 ב &#39;, ההזרקה של שליטה בחומר, מלוח, לא להוביל לשינוי בירי שיעור. שליטה זו ממחישה כי תהליך ההזרקה עצם אין השפעה מדידה על נכסי הירי של נוירונים המוקלטים. התצורה המרחבית של נוירון, אלקטרודה הקלטה, micropipette הוא של מכריע<html> חשיבות בניסויים אלה. למרות מדידה מדויקת של עמדות ביחס שלהם בתוך הרקמה במהלך ההקלטה אינה אפשרית, אנחנו יכולים לשקול ובקרת מקורות אפשריים של שונות. ראשית, במהלך הזרקת נפח קיים סיכון כי הנוירון של עניין עשוי להיות שנעקר מן האלקטרודה ההקלטה, להם השלכה על איתנותו של אותות רשמו. מסיבה זו הוא פקח כדי להשוות את קצב הירי לפני ואחרי לחסום זריקה כדי לוודא את יציבותה אות. שנית, תצורת צינור מדריך של שיטת הרישום מגדירה את המרחק בין אלקטרודות micropipette (למשל., 305 מיקרומטר במערכת 3 ערוצים קונצנטריים השתמש בניסוי זה). כמו המערכת מספקת שליטה על מיקום מדויקת של עומק אלקטרודות micropipette בתוך הרקמה, המרחק ביניהם ניתן למזער על ידי כיול עומק ביחס בקפידה לפני ההקלטה (שלב 3.5), ושמירה על אותם בעומק נפוץ במהלך הקלטות. אף אוזן גרון &quot;&gt; מגבלות פוטנציאליות בנוסף בקרת איכות ללא צורך במיקור חוץ על ידי היצרן, המערכת צריכה להיות מאומתת בתנאי מעבדה, כמו סוגים שונים של צינורות, מזרקים וכו &#39;יכולים לשמש עלול להוביל הבדלים בהיקפיים נפלט. למרות המערכת יכולה לשמש כדי להזריק כמויות קטנות מאוד כמו בניסוי המוצג כאן, אלה הם מתחת ההיקף המינימאלי שניתן תוקף בשל מגבלות מדידה מעשיות בסביבת מעבדה רגילה. עם זאת, כרכי הזרקה גדולים יכולים לשמש כדי להסיק את היחס בין הנפח מוגדר תוכנה בהיקף נפלט על ידי החומרה. אם צינורות שקופים משמשים, בדיקה חזותית נוספת של תהליך ההזרקה אפשרית על ידי מדידת התזוזה של סמן חזותי. הכנסת micropipette לתוך המערכת היא יותר תובענית מאשר החדרת אלקטרודה, כמו הקוטר של micropipette הוא מעט גדול יותר ואת החומר הוא יותר שביר. בנוסף,הצטרפותו הצינור לפין של micropipette היא מאתגרת שכן יש בה סיכון גבוה לשבור את החלק העליון של micropipette. עם זאת, אורך החיים של micropipette נטען בהצלחה הוא מספר חודשים, אפילו עם לשימוש יומיומי. בפועל, אנחנו עדיין לא נתקלנו סתימה במערכת ההזרקה במהלך הניקוי-הקלטת פוסט של המערכת. אף על פי כן, אין בדיקה &quot;מקוונת&quot; אפשרית, קיים סיכון כי חסימה פיזית (כגון רקמה על קצה micropipette) עשויה למנוע הזרקת חומר. זה יכול אפוא להיות רצוי לנתח את הנתונים באופן שמרני, כגון כולל רק אותם התאים לניתוח נוסף המראים שינויים משמעותיים ירי שיעורים בין בלוקים מלאי הזרקת הניסוי. למרות הקוטר הקטן שלהם, microelectrodes ו טפטפות יתפוס את מקומו של רקמת המוח ועלול לגרום נזק לרקמות מקומיות. זה יכול להיות ממוזער באופן ידני על ידי צבת הקצה הדואר מדריך צינורות בדיוק מעל דורה מאטר. האלקטרודות ואז לחדור הדורה התקינה שלהם הוא להסיק על ידי מדידת העכבות שלהם באינטרנט. לאחר מכן, micropipette מוכנס. בעת השימוש בגישה זו, הסרה קבועה של רקמה מעל הדורה מומלצת לצמצם עוד יותר את הסיכון של שבירת אלקטרודה או טפטף. השוואה לשיטות חלופיות המערכת המשמשת כאן מראה יתרונות ברורים בהשוואה למערכות הזרקה בלחץ אחרות. יתרון חזק אחת הוא בקוטר של micropipette (כ 100 מיקרומטר), אשר הוא חצי בגודל של בדיקות זמינות אחרות 17 ולכן ממזער את ניזק רקמה עצבי. בניגוד עיצובים קודמים, המערכת הנוכחית מעסיקה מופרדים מרחבית אלקטרודה הקלטה micropipette. בעוד שמערכות אחרות לספק מרחק קטן יותר בין האלקטרודה פיפטה, המערכת המתוארת כאן מאפשרת שינויי עומק עצמאיים של אלקטרודות פיפטה, ובכך permitting מרחקים יחסיים משתנים בתוך הקלטות. חשוב לציין, ללא פשרות לגבי איכות הקלטה צריכה להיעשות, כמו מערכת ההזרקה הוא רחבה של מכשיר הקלטה הוקם. בעוד רק micropipette אחד ובכך חומר אחד משמש פרוטוקול זה, אפשר להזריק מספר חומרים בתוך הליך ניסיוני אחד. כדי להשיג זאת, כמה micropipettes ניתן מושחל לתוך צינורות מדריך נפרדים ומחובר המזרקים רכובי משאבות הזרקת פרט. לבסוף, שליטה על המערכת קלה, כמו שרק תוכנת מחשב אחד נדרשה כדי לקדם את אלקטרודות micropipette, וכדי לבצע את ההזרקה בלחץ במהלך הניסוי. השוואת הזרקה בלחץ כדי iontophoresis, יש יתרונות וחסרונות יחסיים. לדוגמא, הזרקה בלחץ דורשת כמויות יותר יוכנסו הרקמה מ iontophoresis, ובכך מגדיל את הסיכון של עקירה עצבית. פרוטו הנוכחיcol בשימוש כרכים בטווח NL, ואנחנו כמעט ולא חווינו שינויים מורגשים בתוך איכות האות של תא מוקלט. המערכת גם מאפשרת נפחים גדולים יותר להיות מוזרקים, וזה שימושי פוטנציאלי עבור מניפולציות התנהגותיות אבל יכול להשפיע על יציבות של הקלטה עצבית. יתרון ברור של הזרקה בלחץ מעל iontophoresis הוא המגוון הגדול יותר של חומרים שמישים כמו אין דרישה להשתמש בחומרים טעונים. עם זאת, ערכי ה- pH צריכים להיבדק ומשווים בין חומרים ניסיוניים ובקרה (למשל., מלוח). השאלה שעלולה להתעורר למה להשתמש בשיטה הוותיקה של הזרקה בלחץ במקום טכניקות חדשות יותר כגון optogenetics מניפולצית פעילות עצבית. למרות וותיקה במכרסמים, optogenetics כי לא נקבע עדיין מהימן בקופי רזוס. בפרט, זה אינו מאפשר המניפולציה המקומית של תאים סלקטיבי לסוג הנוירוטרנסמיטר בפרט. בטווח הארוך יותר, אנו רואיםפוטנציאל גדול עבור שילוב היתרונות של מניפולציות תרופתיות עם היתרונות של מניפולציות optogentic הבהרת הבסיס העצבי של תפקודים קוגניטיביים. הנה הראינו כיצד הזרקה בלחץ יכולה לשמש פרמקולוגית לתפעל אזור מקומי מוגבל במוח של ער, מתנהגת קופי רזוס. אנו מקווים כי שיטה זו מעניקה השראה למדענים אחרים כדי לחקור תרומות neuromodulatory לדינמיקה של פעילות עצבית.

In cortical and subcortical areas, neuronal activity is affected by various neuromodulators, for example acetylcholine1. These modulatory effects on neuronal responses have been reported in in vitro studies2, as well as in electrophysiological recordings from anesthetized animals3 and systemic pharmacological manipulations in humans4. Nevertheless, the exact role of different neuromodulators and the involvement of various receptor subtypes are largely unknown. To measure the effects of specific neuromodulators on the activity of single neurons, it is desirable to induce a temporary neuromodulator change as close as possible to the recording electrode. Furthermore, it is important that those manipulations are done in awake animals, as cognitive functions are only present in the absence of anesthesia. Additionally, anesthesia interacts with cholinergic and GABAergic systems5,6 and can lead to changes in neural activity3.
Within the last decades, two main methods of local drug delivery have been developed and refined: iontophoresis and pressure injection. In both methods drugs are delivered through micropipettes made of either glass or steel. With iontophoresis, an electrical current regulates the release of the drug7. Additionally, there is a significant contribution of electro-osmosis to the total amount of ejected molecules8, correlating with the tip diameter9 of the micropipette as well as with the concentration8 of the substance used. Iontophoresis is a powerful tool to quickly and precisely manipulate small volumes of nervous tissue. For iontophoretic injections, multi-barrel micropipettes are usually used10, with one acting as a recording device while the other positions serve as delivery pipettes. A limitation of this method is that only charged molecules can be used, severely limiting the selection of drugs. 
Pressure injection uses either air compression or mechanical pressure to eject a substance from a micropipette. Using this method any soluble substance, charged or uncharged, can be used, including large molecules. The method of pressure injection was first described by Reyniers in 1933 and further refined in the 1950s (see Lalley11 for a review). In the 1980s the method was further refined to allow delivery of amounts in the nanoliter range (mainly lidocain12) to a defined brain area13 while simultaneously performing single-cell recording. The ejected volume was usually monitored by observing the movement of a marker, such as the meniscus in the upper part of the pipette13. Pressure injection was first used in the 1990s in awake animals, both extracellularly14 and intracellularly15,16. Based on the cumulative expertise gained in these studies it is now possible to reliably record from different brain structures in combination with pharmacological manipulation (see17 for a comparison of recent pressure injection systems). 
An enduring open issue for both drug delivery methods is the difficulty in determining the precise volume injected. This is an even bigger challenge for experiments with awake, behaving rhesus monkeys where the animal performs the experimental task in a separate room. This can be alleviated by the use of a software-controlled system instead of relying on a visual marker to continuously monitor an injection. 
The system described here is an extension of a well-established electrophysiological recording system (Mini Matrix System) and combines an injection pipette with multiple parallel-oriented recording electrodes at defined distances in a customizable arrangement. Pharmacological manipulation of the tissue near the recording electrode is possible using only a small amount of substance, ensuring a fast recovery and allowing multiple blocks of injection and control/recovery within the limited time window offered by the behavioral task of the animal.

<table><tbody><tr><td>(-)-Scopolamine hydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>55-16-3</td><td>Mr 339.81 g/mol</td></tr><tr><td>NaCl 0.9%&amp;nbsp;</td><td>B. Braun Melsungen AG</td><td>3079870</td><td>5ml&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Terg-a-zyme</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z273287</td><td>enzyme detergen</td></tr><tr><td>Hydrogen peroxide</td><td>Roth</td><td></td><td>Used in 3% solution with deionized water</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Chemie-Vertieb Hannover</td><td>104642</td><td>70%</td></tr><tr><td>Deionized water</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Injekt 40 Duo</td><td>B. Braun Melsungen AG</td><td>9166432V</td><td>Syringe and needle&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Eppendorf Safe-Lock microcentrifuge tubes, amber</td><td>Eppendorf</td><td>0030 120.191</td><td>1,5ml&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Quarzglass micropipette</td><td>Thomas Recording</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Recording electrode</td><td>Thomas Recording</td><td></td><td>quartz/platinum-tungsten fiber electrode; impedance value 1-2 M&amp;Omega;&amp;nbsp; and 0.3-0.5 M&amp;Omega;</td></tr><tr><td>PharmedBPT-Schlauch</td><td>Saint-Gobain Performance Plastics&amp;nbsp;</td><td>3702003</td><td>&amp;nbsp;Size: 0,25 x 2,05 mm (Wd: 0,9mm)</td></tr><tr><td>Loctite 401</td><td>Henkel</td><td>233641</td><td>Superglue</td></tr><tr><td>Silicon oil</td><td>Thomas Recording</td><td>M-1000</td><td></td></tr><tr><td>Minisart RC15</td><td>Sartorius</td><td>17761----------R</td><td>Syringe filter</td></tr><tr><td>Multichannel Micro Injection System</td><td>Thomas Recording</td><td></td><td>multichannel microelectrode manipulator &amp;ldquo;System Eckhorn&amp;rdquo; equipped with microelectrodes and micropipettes and a precision multichannel microinjection pump</td></tr><tr><td>McLab</td><td>custom</td><td></td><td>internal lab software to control stimulus presentation</td></tr></tbody></table>

a pressure injection system for investigating the neuropharmacology of information processing in awake behaving macaque monkey cortex

The top-down modulation of feed-forward cortical information processing is functionally important for many cognitive processes, including the modulation of sensory information processing by attention. However, little is known about which neurotransmitter systems are involved in such modulations. A practical way to address this question is to combine single-cell recording with local and temporary neuropharmacological manipulation in a suitable animal model. Here we demonstrate a technique combining acute single-cell recordings with the injection of neuropharmacological agents in the direct vicinity of the recording electrode. The video shows the preparation of the pressure injection/recording system, including preparation of the substance to be injected. We show a rhesus monkey performing a visual attention task and the procedure of single-unit recording with block-wise pharmacological manipulations.

איור 2 מתאר את משימת תשומת לב מרחבית הקוף מבוצע תוך תהליך ההזרקה נערך. הקוף הוכשר לטפל גם הגירוי ממוקם בתוך השדה הפתוח של הנוירון המוקלט (להשתתף בפעילותו ב), הגירוי הממוקם מחוץ לשדה הפתוח (להשתתף-אאוט) או נקודת הקיבעון (להשתתף לתקן). תנאים אלה מאפשרים השוואה של פעילות עצבית במדינות קשב שונות. איור 3 מראה היסטוגרמה זמן פרי-גירוי של נוירון מדגם ניסוי בעזרת סקופולמין, אנטגוניסט כולינרגית מוסקריניים. העלילה מדגימה דיכוי התגובה במהלך הזרקת סקופולמין מול שום זריקה, כאשר דפוס נע בכיוון המועדף של התא מוצג בתוך השדה הפתוח של הנוירון והוא בהשתתפות החיה. שתי הפסגות הראשונות לייצג הנוירון9; s בתגובה וחוץ קיזוז קיו מרחבית, המופיע בתוך השדה הפתוח שלה. זה ואחריו התגובה לדפוס המרגש המופיע על המסך 500 מילישניות לאחר תחילת קיו. האזור המוצל האפור מתאר ניתוח התקופה ששמשה לחישוב קצב ירי הממוצע עבור כל בדיקה. האזור הירוק מדגיש השפעה המדכאת של הזרקת סקופולמין על קצב הירי של התא. האזור הירוק הכהה מראה את הדיכוי בתוך ניתוח התקופה. איור 4 א מראה את ההשפעה של סקופולמין על קצב ירי הממוצע של הנוירון מדגם בכל אחד משלושת תנאי הקשב. השיעור של ירי נוירון לשני תנאי הלב מרחבית (לב בתוך או מחוץ לשדה הפתוח של הנוירון ההקלטה) וכן על מצבו החושי (תשומת לב בשלב קיבוע) ירדה זמן קצר לאחר הזריקה הראשונה של בלוק ההזרקה (מוצל אפור הואא) ובמהלך לחסום ההתאוששות גדל באיחור לאותה רמה כמו לפני הזריקה. איור 4B מראה שליטת הקלטת נוירון דגימה שנייה שבה מלוח (0.9% NaCl) שהוזרק, באמצעות בפרוטוקול זהה עבור הזרקת סקופולמין. במהלך ההזרקה לחסום כל שינוי קצב הירי של נוירון נצפה לעומת דבוקת השליטה. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53724/53724fig1.jpg" /> איור 1. קמה המשמשת מניפולציה תרופתית בעת ההקלטה. (א) מתארת ​​את משאבת microinjection ומערכת הקלטת אלקטרו מצוידת אלקטרודות micropipette. הפער guidetube, שלתוכו שמן סיליקון מוכנס לשמן את אלקטרודות micropipette, מוצג מוגדל. (B) מציג micropipette למשל (לעיל)אלקטרודה הקלטה (להלן). לשם השוואה גודל, אגורה האירו (קוטר: 16 מ&quot;מ). הוא ממוקם מתחת <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53724/53724fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53724/53724fig2.jpg" /> איור 2. עיצוב משימות כדי להנחות את תשומת מרחבית. קופים אומנו לזהות שינוי כיוון תנועה בדפוס נקודות הרמז. קיו הוצב גם בתוך שדה פתוח של הנוירון (להשתתף בפעילותו ב), כפי שמוצג באיור, או מחוצה לו (להשתתף-אאוט). כביקורת חושית, הוכשר הקוף כדי לזהות שינוי בהיקות של נקודת הקיבעון (להשתתף לתקן). <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53724/53724fig2large.jpg" target="_blank">נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> &lt;<html> img alt = &quot;איור 3&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 53,724 / 53724fig3.jpg&quot; /&gt; איור 3. השפעת סקופולמין אנטגוניסט על ירי שיעור. ההיסטוגרמה זמן פרי-גירוי של נוירון מדגם מוצג עבור להשתתף בפעילותו במצב (לב בתוך שדה פתוח של הנוירון מוקלט) במהלך לחסום זריקה ובמהלך דבוקת שליטה. ציר ה- X מתאר את הזמן באלפיות השנייה לאחר הופעת קיו ואת ציר y מראה את קצב ירי קוצים / sec. האיזור האפור מתאר ניתוח תקופה (300-800 מילישניות לאחר הופעת גירוי) המשמשת לחישוב שיעור ירי ממוצעים לדין. האזור המוצלל הירוק מראה דיכוי בירי שיעור על פני שני התנאים. הצבע הירוק הכהה מדגיש את הדיכוי בתוך ניתוח התקופה. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53724/53724fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> Iles / ftp_upload / 53,724 / 53724fig4.jpg &quot;/&gt; איור 4. השפעת סקופולמין ומליחות על ירי שיעור. (א) הזרקה סקופולמין אנטגוניסט. שיעור ירי ממוצעי משפטו של התא מדגם מתרשים 3 במהלך הניסוי הוצג עבור הגירוי המועדף עבור כל שלושת תנאי הקשב. ציר ה- X מתאר את שעת ההתחלה לדין דק ואת ציר y מראה את קצב הירי של יחידת קוצים לכל שניות. סמלים ( <img alt="ועוד" src="/files/ftp_upload/53724/53724plussign.jpg" /> להשתתף בפעילותו ב, <img alt="מַעְגָל" src="/files/ftp_upload/53724/53724circle.jpg" /> להשתתף בפעילותו לתקן, <img alt="Trianle" src="/files/ftp_upload/53724/53724triangle.jpg" /> להשתתף-אאוט) מייצג את קצב הירי של נוירון בתוך תקופת הניתוח בכל משפט בצע בהצלחה, קווים אופקיים (קו מוצק: להשתתף בפעילותו ב, קו מקווקו: להשתתף לתקן, קו מקווקו: להשתתף-אאוט) להראות קצב ירי ממוצע עבור שלושה bl ניסויים שוניםocks (שליטה, זריקה, התאוששות). האזור המוצל האפור מציג את גוש ההזרקה, החל הזריקה הראשונה וכלת 1 דקות לאחר ההזרקה האחרונה. במהלך זריקת החסם 2 nL של 0.1 סקופולמין טוחן הוזרק מכל רגע עם מהירות זריקה של 2 s / NL. (ב) הזרקת תמיסת מלח. שיעור הירי של תא מדגם במהלך הניסוי המלא מוצג עבור הגירוי המועדף עבור כל שלושת תנאי הקשב. גריי מוצל באזור מדמיין את גוש הזרקת מי מלח. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53724/53724fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Pressure Injection System for Investigating the Neuropharmacology of Information Processing in Awake Behaving Macaque Monkey Cortex at JoVE.com

A Pressure Injection System for Investigating the Neuropharmacology of Information Processing in Awake Behaving Macaque Monkey Cortex

Here, we show the pressure injection of neuropharmacological substances during single-cell recording in an awake, behaving macaque monkey. This procedure allows pharmacological manipulation in the direct vicinity of a cortical recording site.

מערכת הזרקה בלחץ לחקירת neuropharmacology של עיבוד מידע Awake מתנהג מקוק קוף Cortex

The top-down modulation of feed-forward cortical information processing is functionally important for many cognitive processes, including the modulation ...

a-pressure-injection-system-for-investigating-neuropharmacology

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Behavior

8.3K Views.  German Primate Center. Here, we show the pressure injection of neuropharmacological substances during single-cell recording in an awake, behaving macaque monkey. This procedure allows pharmacological manipulation in the direct vicinity of a cortical recording site. 

Video: A Pressure Injection System for Investigating the Neuropharmacology of Information Processing in Awake Behaving Macaque Monkey Cortex

Multi-layer Cortical Ca2+ Imaging in Freely Moving Mice with Prism Probes and Miniaturized Fluorescence Microscopy

In vivo circuit and cellular level functional imaging is a critical tool for understanding the brain in action. High resolution imaging of mouse cortical neurons with two-photon microscopy has provided unique insights into cortical structure, function and plasticity. However, these studies are limited to head fixed animals, greatly reducing the behavioral complexity available for study. In this paper, we describe a procedure for performing chronic fluorescence microscopy with cellular-resolution across multiple cortical layers in freely behaving mice. We used an integrated miniaturized fluorescence microscope paired with an implanted prism probe to simultaneously visualize and record the calcium dynamics of hundreds of neurons across multiple layers of the somatosensory cortex as the mouse engaged in a novel object exploration task, over several days. This technique can be adapted to other brain regions in different animal species for other behavioral paradigms.

Multi-layer Cortical Ca2+ Imaging in Freely Moving Mice with Prism Probes and Miniaturized Fluorescence Microscopy

Here, we present a procedure for performing large-scale Ca2+ imaging with cellular-resolution across multiple cortical layers in freely moving mice. Hundreds of active cells can be observed simultaneously using a miniature, head-mounted microscope coupled with an implanted prism probe.

רב שכבתיים Ca קליפת המוח<sup&gt; 2+</sup&gt; הדמיה בחופשיות העברת עכברים עם בדיקות פריזמה מיקרוסקופית פלואורסצנטי מיניאטורי

In vivo circuit and cellular level functional imaging is a critical tool for understanding the brain in action. High resolution imaging of mouse cortical ...

Preparation of an Awake Mouse for Recording Neural Responses and Injecting Tracers

It is well known that anesthesia alters neural response properties in various regions of the brain.13. In the auditory system, fundamental response properties of brainstem neurons including threshold, frequency specificity, and inhibitory sidebands are altered in significant ways under anesthesia1-2. These observations prompted physiologists to seek ways to record from single neurons without the contaminating effects of anesthesia. One result was a decerebrate preparation, where the brainstem was completely transected at the level of the midbrain4. The drawbacks of this preparation are a formidable surgery, the elimination of descending projections from the forebrain, and an inability to use sensory stimulation to examine structures above the midbrain. A different strategy has been to implant electrode arrays chronically to record from single neurons and multiunit clusters while the animal is awake and/or behaving5,6. These techniques however are not compatible with injecting tracer dyes after first electrophysiologically characterizing a brain structure. To avoid altering neural response properties with anesthetics while recording electrophysiological response properties from single neurons, we have adapted a head restraint technique long used in bats7-9 to mouse10-12. Using this method, we are able to conduct electrophysiological recordings over several days in the unanesthetized mouse. At the end of the recording sessions, we can then inject a dye to reconstruct electrode positions and recording sites or inject a tracer so that pathways to and from the recording loci can be determined. This method allows for well isolated single neuron recordings over multiple days without the use anesthetics.

Electrophysiological characterization of neuronal responses is important for understanding brain function and for guiding the placement of dyes for pathway tracing. However, many studies are performed in anesthetized animals. To understand brain function without anesthetics, we developed a method to record neuronal response properties and inject dyes in awake mouse.

הכנת עכבר ער להקלטת תגובות עצביות והזרקת קליעים נותבים

It is well known that anesthesia alters neural response properties in various regions of the brain.13.  In the auditory system, fundamental response ...

Neuroscience

Juxtacellular Monitoring and Localization of Single Neurons within Sub-cortical Brain Structures of Alert, Head-restrained Rats

There are a variety of techniques to monitor extracellular activity of single neuronal units. However, monitoring this activity from deep brain structures in behaving animals remains a technical challenge, especially if the structures must be targeted stereotaxically. This protocol describes convenient surgical and electrophysiological techniques that maintain the animal&#8217;s head in the stereotaxic plane and unambiguously isolate the spiking activity of single neurons. The protocol combines head restraint of alert rodents, juxtacellular monitoring with micropipette electrodes, and iontophoretic dye injection to identify the neuron location in post-hoc histology. While each of these techniques is in itself well-established, the protocol focuses on the specifics of their combined use in a single experiment. These neurophysiological and neuroanatomical techniques are combined with behavioral monitoring. In the present example, the combined techniques are used to determine how self-generated vibrissa movements are encoded in the activity of neurons within the somatosensory thalamus. More generally, it is straightforward to adapt this protocol to monitor neuronal activity in conjunction with a variety of behavioral tasks in rats, mice, and other animals. Critically, the combination of these methods allows the experimenter to directly relate anatomically-identified neurophysiological signals to behavior.

This protocol describes the design and surgical implantation of a head-restraining mechanism to monitor neuronal activity in sub-cortical brain structures in alert rats. It delineates procedures to isolate single neurons in the juxtacellular configuration and to efficiently identify their anatomical locations.

ניטור Juxtacellular והלוקליזציה של Single נוירונים בתוך מבנים מוחיים תת-קליפת המוח של התראה, חולדות-מרוסן ראש

There are a variety of techniques to monitor extracellular activity of single neuronal units. However, monitoring this activity from deep brain structures ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Micro-injections of Inhibitory Agents in the Rodent Brain

Here we describe a method for the construction of a single-use &#8220;injectrode&#8221; using commercially accessible and affordable parts. A probing system was developed that allows for the injection of a drug while recording electrophysiological signals from the affected neuronal population. This method provides a simple and economical alternative to commercial solutions. A glass pipette was modified by combining it with a hypodermic needle and a silver filament. The injectrode is attached to commercial microsyringe pump for drug delivery. This results in a technique that provides real-time pharmacodynamics feedback through multi-unit extracellular signals originating from the site of drug delivery. As a proof of concept, we recorded neuronal activity from the superior colliculus elicited by flashes of light in rats, concomitantly with delivery of drugs through the injectrode. The injectrode recording capacity permits the functional characterization of the injection site favoring precise control over the localization of drug delivery. Application of this method also extends far beyond what is demonstrated here, as the choice of chemical substance loaded into the injectrode is vast, including tracing markers for anatomic experiments.

Here, we craft a glass pipette with dual functions: inhibition of deep brain structures by microinjections of drugs and real-time monitoring of their effects through simultaneous electrophysiological recordings.

אלקטרו הקלטה בו זמנית ומייקרו-הזרקות של סוכנים מעכבים במוח מכרסם

Here we describe a method for the construction of a single-use &#8220;injectrode&#8221; using commercially accessible and affordable parts. A probing ...

Induction of an Isoelectric Brain State to Investigate the Impact of Endogenous Synaptic Activity on Neuronal Excitability In Vivo

The way neurons process information depends both on their intrinsic membrane properties and on the dynamics of the afferent synaptic network. In particular, endogenously-generated network activity, which strongly varies as a function of the state of vigilance, significantly modulates neuronal computation. To investigate how different spontaneous cerebral dynamics impact single neurons&#39; integrative properties, we developed a new experimental strategy in the rat consisting in suppressing in vivo all cerebral activity by means of a systemic injection of a high dose of sodium pentobarbital. Cortical activities, continuously monitored by combined electrocorticogram (ECoG) and intracellular recordings are progressively slowed down, leading to a steady isoelectric profile. This extreme brain state, putting the rat into a deep comatose, was carefully monitored by measuring the physiological constants of the animal throughout the experiments. Intracellular recordings allowed us to characterize and compare the integrative properties of the same neuron embedded into physiologically relevant cortical dynamics, such as those encountered in the sleep-wake cycle, and when the brain was fully silent.

Induction of an Isoelectric Brain State to Investigate the Impact of Endogenous Synaptic Activity on Neuronal Excitability In Vivo

This procedure performs long-lasting in vivo intracellular recordings from single neurons during physiologically relevant cerebral states and after complete abolition of ongoing electrical activities, resulting in an isoelectric brain state. The physiological constants of the animal are carefully monitored during the transition to the artificial comatose condition.

אינדוקציה של מדינת איזואלקטרית מוח כדי לחקור את ההשפעה של פעילות סינפטית אנדוגני על העצבית רגישה<em&gt; In vivo</em

The way neurons process information depends both on their intrinsic membrane properties and on the dynamics of the afferent synaptic network. In ...

Investigating Object Representations in the Macaque Dorsal Visual Stream Using Single-unit Recordings

Previous studies have shown that neurons in parieto-frontal areas of the macaque brain can be highly selective for real-world objects, disparity-defined curved surfaces, and images of real-world objects (with and without disparity) in a similar manner as described in the ventral visual stream. In addition, parieto-frontal areas are believed to convert visual object information into appropriate motor outputs, such as the pre-shaping of the hand during grasping. To better characterize object selectivity in the cortical network involved in visuomotor transformations, we provide a battery of tests intended to analyze the visual object selectivity of neurons in parieto-frontal regions.

A detailed protocol to analyze object selectivity of parieto-frontal neurons involved in visuomotor transformations is presented.

חוקרים ייצוגי האובייקט בזרם Visual הגבי מקוק באמצעות הקלטות יחיד-יחידה

Previous studies have shown that neurons in parieto-frontal areas of the macaque brain can be highly selective for real-world objects, disparity-defined ...

Convection Enhanced Delivery of Optogenetic Adeno-associated Viral Vector to the Cortex of Rhesus Macaque Under Guidance of Online MRI Images

In non-human primate (NHP) optogenetics, infecting large cortical areas with viral vectors is often a difficult and time-consuming task. Here, we demonstrate the use of magnetic resonance (MR)-guided convection enhanced delivery (CED) of optogenetic viral vectors into primary somatosensory (S1) and motor (M1) cortices of macaques to obtain efficient, widespread cortical expression of light-sensitive ion channels. Adeno-associated viral (AAV) vectors encoding the red-shifted opsin C1V1 fused to yellow fluorescent protein (EYFP) were injected into the cortex of rhesus macaques under MR-guided CED. Three months post-infusion, epifluorescent imaging confirmed large regions of optogenetic expression (&#62;130 mm2) in M1 and S1 in two macaques. Furthermore, we were able to record reliable light-evoked electrophysiology responses from the expressing areas using micro-electrocorticographic arrays. Later histological analysis and immunostaining against the reporter revealed widespread and dense optogenetic expression in M1 and S1 corresponding to the distribution indicated by epifluorescent imaging. This technique enables us to obtain expression across large areas of the cortex within a shorter period of time with minimal damage compared to the traditional techniques and can be an optimal approach for optogenetic viral delivery in large animals such as NHPs. This approach demonstrates great potential for network-level manipulation of neural circuits with cell-type specificity in animal models evolutionarily close to humans.&#160;

Here, we demonstrate magnetic resonance (MR)-guided convection enhanced delivery (CED) of viral vectors into the cortex as an efficient and simplified approach for achieving optogenetic expression across large cortical areas in the macaque brain.

הסעה משופר משלוח אלקטרואופטיקה Adeno-וקטור ויראלי הקשורים לקליפת מקוק רזוס תחת הדרכה של תמונות MRI מקוונות

In non-human primate (NHP) optogenetics, infecting large cortical areas with viral vectors is often a difficult and time-consuming task. Here, we ...

Microinjectrode System for Combined Drug Infusion and Electrophysiology

This microinjectrode system is designed for drug infusion, electrophysiology, and delivery and retrieval of experimental probes, such as microelectrodes and nanosensors, optimized for repeated use in awake, behaving animals. The microinjectrode system can be configured for multiple purposes: (1) simple arrangement of the cannula for placement of an experimental probe that would otherwise be too fragile to penetrate the dura mater, (2) microfluidic infusion of a drug, either independently or coupled to a cannula containing an experimental probe (i.e., microelectrode, nanosensor). In this protocol we explain the step by step construction of the microinjectrode, its coupling to microfluidic components, and the protocol for use of the system in vivo. The microfluidic components of this system allow for delivery of volumes on the nanoliter scale, with minimal penetration damage. Drug infusion can be performed independently or simultaneously with experimental probes such as microelectrodes or nanosensors in an awake, behaving animal. Applications of this system range from measuring the effects of a drug on cortical electrical activity and behavior, to understanding the function of a specific region of cortex in the context of behavioral performance based on probe or nanosensor measurements. To demonstrate some of the capabilities of this system, we present an example of muscimol infusion for reversible inactivation of the frontal eye field (FEF) in rhesus macaque during a working memory task.

We present a microinjectrode system designed for electrophysiology and assisted delivery of experimental probes (i.e., nanosensors, microelectrodes), with optional drug infusion. Widely available microfluidic components are coupled to a cannula containing the probe. A step-by-step protocol for microinjectrode construction is included, with results during muscimol infusion in macaque cortex.

מערכת microinjectrode לטיפול בתרופות אינפוזיה ואלקטרופיזיולוגיה של התרופה

This microinjectrode system is designed for drug infusion, electrophysiology, and delivery and retrieval of experimental probes, such as microelectrodes ...

Injections of AAV Vectors for Optogenetics in Anesthetized and Awake Behaving Non-Human Primate Brain

Optogenetic techniques have revolutionized neuroscience research and are poised to do the same for neurological gene therapy. The clinical use of optogenetics, however, requires that safety and efficacy be demonstrated in animal models, ideally in non-human primates (NHPs), because of their neurological similarity to humans. The number of candidate vectors that are potentially useful for neuroscience and medicine is vast, and no high-throughput means to test these vectors yet exists. Thus, there is a need for techniques to make multiple spatially and volumetrically accurate injections of viral vectors into NHP brain that can be identified unambiguously through postmortem histology. Described herein is such a method. Injection cannulas are constructed from coupled polytetrafluoroethylene and stainless-steel tubes. These cannulas are autoclavable, disposable, and have low minimal-loading volumes, making them ideal for the injection of expensive, highly concentrated viral vector solutions. An inert, red-dyed mineral oil fills the dead space and forms a visible meniscus with the vector solution, allowing instantaneous and accurate measurement of injection rates and volumes. The oil is loaded into the rear of the cannula, reducing the risk of co-injection with the vector. Cannulas can be loaded in 10 min, and injections can be made in 20 min. This procedure is well suited for injections into awake or anesthetized animals. When used to deliver high-quality viral vectors, this procedure can produce robust expression of optogenetic proteins, allowing optical control of neural activity and behavior in NHPs.

As currently implemented, optogenetics in non-human primates requires injection of viral vectors into the brain. An optimal injection method should be reliable and, for many applications, capable of targeting individual sites of arbitrary depth that are readily and unambiguously identified in postmortem histology. An injection method with these properties is presented.

זריקות של וקטורים AAV לאופטוגנטיקה במוח פרימטים מורדם וער המתנהג באופן לא אנושי

Optogenetic techniques have revolutionized neuroscience research and are poised to do the same for neurological gene therapy. The clinical use of ...

Head Implants for the Neuroimaging of Awake, Head-Fixed Rats

Anesthetics, commonly used in preclinical and fundamental scientific research, have a depressive influence on the metabolic, neuronal, and vascular functions of the brain and can adversely influence neurophysiological results. The use of awake animals for research studies is advantageous but poses the major challenge of keeping the animals calm and stationary to minimize motion artifacts throughout data acquisition. Awake imaging in smaller-sized rodents (e.g., mice) is very common but remains scant in rats as rats are bigger, stronger, and have a greater tendency to oppose movement restraints and head fixation over the long durations required for imaging. A new model of neuroimaging of awake, head-fixed rats using customized hand-sewn slings, 3D-printed head implants, head caps, and a headframe is described. The results acquired following a single trial of single-whisker stimulation suggest an increase in the intensity of the evoked functional response. The acquisition of the evoked functional response from awake, head-fixed rats is faster than that from anesthetized rats, reliable, reproducible, and can be used for repeated longitudinal studies.

A detailed new procedure for functional imaging of awake, head-fixed rats is described.

שתלי ראש לדימות מוחי של חולדות ערות ומקובעות ראש

Anesthetics, commonly used in preclinical and fundamental scientific research, have a depressive influence on the metabolic, neuronal, and vascular ...

מערכת הזרקה בלחץ לחקירת neuropharmacology של עיבוד מידע Awake מתנהג מקוק קוף Cortex

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

רב שכבתיים Ca קליפת המוח