Il nostro obiettivo è quello di sviluppare e caratterizzare un modello basato su organoidi per imitare il tratto gastrointestinale e confrontarlo con i suini vivi, e di concentrarci sulle caratteristiche di trasporto. Il passaggio da un classico esperimento animale a. Nel nostro campo della fisiologia gastrointestinale a un.
Modello in vitro basato su organoidi, che imita la situazione in vivo. Abbiamo combinato il nostro modello dell'intestino tenue e crasso degli organoidi con. Che può essere utilizzato per indagare le caratteristiche di trasporto in tempo reale per consentire un confronto tra il nostro modello e la situazione dei suini vivi.
Soprattutto nel campo della ricerca sull'allevamento, i modelli alternativi ai classici esperimenti sugli animali sono rari. Superiamo questa limitazione utilizzando il nostro modello basato su organoidi del tratto intestinale suino. Abbiamo in programma di utilizzare il nostro modello intestinale basato su organoidi per studiare gli effetti dei batteri patogeni dei suini.
Questo ha lo scopo di comprendere i meccanismi di patogenicità di questi batteri. Per iniziare, mescolare la membrana basale appena scongelata in un rapporto di 1:40 con PBS sterile ghiacciato in un tubo conico. Aggiungere 200 microlitri di questa miscela nello scomparto apicale di ciascun inserto all'interno delle piastre sterili.
Riposizionare il coperchio della piastra a pozzetti e incubare per almeno 1,5 ore a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica. Dopo l'incubazione, aspirare accuratamente la soluzione senza toccare la membrana. Rimuovere il mezzo organoidrico dai pozzetti contenenti organoidi tridimensionali della cripta.
Per sciogliere la membrana basale, aggiungere un millilitro di PBS ghiacciato al pozzetto e pipettare su e giù con un puntale P1000. Raccogli tutti gli organoidi disciolti in una provetta da 15 millilitri preriempita con 10 millilitri di PBS ghiacciato. Centrifugare la provetta a 250 G per 10 minuti a quattro gradi Celsius.
Dopo aver aspirato il surnatante, risospendere il pellet in un millilitro di tripsina EDTA calda allo 0,05%. Incubare la provetta per cinque minuti a 37 gradi Celsius a bagnomaria, quindi posizionarla sul ghiaccio per fermare la reazione. Con un puntale P1000, pipettare su e giù 20 volte per risospendere completamente gli organoidi, quindi ripetere per altre 15 volte utilizzando un puntale P1000 con un puntale P200 attaccato sulla parte superiore.
Ora, aggiungi 10 millilitri di DMEM ghiacciato integrato con il 10% di siero fetale di vitello, o FCS. Centrifugare la provetta a 1000 G per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Dopo aver scartato il surnatante, risospendere il pellet in un millilitro di terreno monostrato.
Utilizzando una camera Neubauer, seguire le istruzioni del produttore per determinare il numero di cellule viventi per millilitro. Ora, sostituire la soluzione di rivestimento dallo scomparto apicale con 500 microlitri di terreno monostrato, temperato a 37 gradi Celsius, e aggiungere tre millilitri di terreno monostrato allo scomparto laterale basale. Rimuovere il mezzo monostrato apicale.
Per la coltura 2D, aggiungere 500 microlitri di terreno monostrato contenente una quantità appropriata di cellule alla camera apicale di ciascun pozzetto e incubare le cellule. Per la misurazione della resistenza elettrica transepiteliale, o TEAR, pulire l'elettrodo della bacchetta con etanolo al 70% e lasciarlo asciugare completamente. Introdurre il braccio corto dell'elettrodo a bacchetta nel compartimento apicale e il braccio lungo nel compartimento laterale basale degli inserti.
Quindi, accendi e lascia il. Il misuratore si equilibra per una misurazione stabile, quindi fare clic sul pulsante di memorizzazione per registrare i valori TEAR. Dopo aver misurato l'ultimo pozzetto, fare clic su Salva per memorizzare i dati su un dispositivo USB.
Pulire l'elettrodo dopo ogni piastra e al termine della misurazione. Lasciare asciugare completamente l'elettrodo prima di riporlo. Sottrarre i valori TEAR del bianco determinati prima della semina delle cellule dai valori cellulari misurati.
Cambiare il mezzo e misurare lo STRAPPO ogni due o tre giorni, assicurandosi che lo STRAPPO venga misurato prima che il mezzo venga cambiato. Aggiungere con cura 500 microlitri, o tre millilitri, di terreno di differenziazione fresco e caldo ai compartimenti apicale e basale. Il giorno 18 per gli organoidi digiunali, o il giorno nove per gli organoidi del colon, dopo la semina, procedere con gli esperimenti funzionali.
Riscaldare le soluzioni tampone mucose e sierose a 37 gradi Celsius e aerare con carbogena. Assemblare le singole camere utilizzando un inserto vuoto per ogni singola camera, assicurandosi che i lati apicali dei pozzetti siano tutti rivolti nella stessa direzione. Riempire tutte le camere con cinque millilitri di soluzione tampone per mucosa preriscaldata.
Collegare tutti gli elettrodi della pinza di tensione alle singole camere seguendo le istruzioni del produttore. Per calibrare il software della camera di Ussing, fare clic sul pulsante RFDPI nel software di morsetto di tensione. Verificare che la resistenza di tutti gli inserti vuoti sia di circa 70 ohm e che la corrente sia di circa zero millivolt.
Rimuovere tutti gli elettrodi ed eliminare la soluzione tampone usata. Aprire le singole camere, rimuovere gli inserti vuoti e mantenere l'ordine delle camere. Ora, sotto l'armadio di sicurezza, aspirare con cura il mezzo basolaterale e apicale dalla piastra.
Lavare le cellule con 500 microlitri di tampone mucoso caldo nella camera apicale e con tre millilitri di tampone sieroso nella camera basolaterale. Rimuovere gli inserti dalla piastra e rimuovere delicatamente i loro supporti. Posizionare gli inserti nelle camere di Ussing, assicurandosi che l'orientamento corrisponda alla fase di calibrazione.
Dopo aver assemblato le singole camere, riempire le camere rivolte verso il lato basolaterale delle celle con cinque millilitri di tampone sieroso e quelle rivolte verso il lato apicale con cinque millilitri di tampone mucoso. Collegare gli elettrodi e i tubi di aerazione a ogni singola camera e avviare la misurazione nel software Ussing. Modificare le condizioni dalla modalità a circuito aperto a quella di cortocircuito nel software.
Dopo 5-10 minuti di equilibrio, aggiungere 10 micromolari di forskolina nella camera sierosa. Dopo 15 minuti, interrompere la misurazione, rimuovere i tubi di aerazione e gli elettrodi dalle camere e smontare le camere. I valori di resistenza elettrica transepiteliale sono aumentati progressivamente durante la coltivazione, raggiungendo un picco di 150 ohm per centimetro quadrato per digiuno dopo 18 giorni e 200 ohm centimetri quadrati per gli organoidi del colon dopo nove giorni.
I valori basali della corrente di cortocircuito erano significativamente più bassi negli organoidi digiuno rispetto agli organoidi del colon, mentre i valori di resistenza basale non mostravano differenze significative. I trattamenti con forskolina hanno aumentato significativamente i valori della corrente di cortocircuito basale negli organoidi digiunali da 0,86 a 27,78 microampere per centimetro quadrato e negli organoidi del colon da 3,83 a 28,78 microampere per centimetro quadrato.
