Questo protocollo viene utilizzato per studiare le qualità di trasporto di giunzioni strette. Utilizzando i potenziali di diluizione, è possibile misurare la permselectivity e ottenere una comprensione delle giunzioni strette in un tessuto. Questa tecnica è specifica e utilizza tessuti nativi per studi funzionali degli epiteli.
Inoltre, questa tecnica misura le proprietà fisiologiche in tempo reale di un tessuto, il che è molto utile. La sfida più grande è la preparazione dei tessuti. Praticare la tecnica, così come guardare questo video aiuterà.
per confermare la vitalità dei tessuti è anche un passo importante. Per iniziare, posizionare i segmenti desiderati di tessuto intestinale raccolti da topi knockout claudin-15 nella soluzione di Ringer a bolle ghiacciate e tagliare via il grasso e il tessuto connettivo. Dopo aver tagliato via il grasso e il tessuto connettivo, tagliare lungo gli attacchi mesenterici per aprire longitudinalmente ogni segmento, quindi riportare i segmenti alla soluzione di Ringer ghiacciata e lavare accuratamente i pezzi.
Per rimuovere lo strato muscolare, versare da due a tre millilitri di soluzione di Ringer fresca ghiacciata in una piastra di dissezione ricoperta di gomma siliconica sotto un microscopio di dissezione e utilizzare i perni per fissare le estremità di un segmento di tessuto intestinale nel piatto con il lato della mucosa rivolto verso il basso. Usando una pinza fine, sezionare senza mezzi termini lo strato muscolare dalla mucosa sottostante, facendo attenzione a non strappare o introdurre buchi nel tessuto. Una volta rimosso lo strato muscolare, tagliare un pezzo abbastanza grande per un'apertura di cinque millimetri di diametro e posizionare il tessuto su un pezzo di carta da filtro perforata da cinque millimetri bagnato con la soluzione mucosale di Ringer verso il basso usando uno sfondo nero per garantire che l'apertura nella carta da filtro sia completamente coperta dal tessuto senza rughe.
Per montare i preparati intestinali in una camera di Ussing, rimuovere prima qualsiasi soluzione dalla camera prima di dissimularla. Posare la carta da filtro con la mucosa intestinale di preparazione verso il basso sulla camera laterale della mucosa usando i segni neri per allineare la finestra della camera con il foro nella carta da filtro. Collegare con attenzione la camera laterale sierosa alla camera laterale della mucosa senza spostare il foglio intestinale.
Riempire rapidamente entrambe le camere con il tampone HEPES e posizionare quelle gorgoglianti all'estremità opposta di ciascuna camera lontano dalla membrana. Ricollegare i ponti di sale e verificare se la tensione è stabile, quindi pulsare la corrente per assicurarsi che le connessioni siano a posto prima di consentire al sistema di equilibrarsi per circa 15 minuti. Per eseguire un esperimento di potenziale di diluizione, lavare prima entrambi i lati della camera con cinque millilitri di tampone HEPES preriscaldato fresco per lato.
Accendere il sistema di registrazione e impostare l'intervallo su 250 millivolt. Impostare le posizioni dei marcatori, impostare il sistema di registrazione su misura e impostare i sistemi di camera Ussing in modalità morsetto. Una volta che il potenziale di misurazione si è stabilizzato, utilizzare i dati per le misurazioni.
Sostituire rapidamente il tampone HEPES dal lato della mucosa della camera con cinque millilitri di tampone HEPES a diluizione riscaldata integrato con cloruro di sodio 75 millimolare. Una volta che il potenziale di membrana ha raggiunto il picco, sostituire il tampone di diluizione dal lato della mucosa con un tampone HEPES fresco. Per garantire che il tessuto sia vitale, aggiungere 10 Forskolin micromolari al lato sieroso.
Una volta che la differenza di potenziale di membrana ha raggiunto un picco e sta iniziando a diminuire, l'esperimento è finito. Per misurare la conduttanza elettrica transepiteliale e la corrente di cortocircuito di base, dopo aver lavato entrambi i lati della camera come dimostrato, aggiungere cinque millilitri di soluzione di Ringer a bolle fresche su ciascun lato e impostare la portata del sistema di registrazione a 2,5 volt. Impostare le posizioni dei marcatori, impostare il sistema di registrazione su misura e impostare il sistema a camera Ussing in modalità morsetto.
Una volta che la corrente di cortocircuito e la conduttanza si sono stabilizzate, utilizzare i dati per le misurazioni di base. Per garantire che il tessuto sia vitale, aggiungere Forskolin al lato sieroso come dimostrato. Una volta che la differenza di potenziale di membrana ha raggiunto un picco e ha iniziato a diminuire, l'esperimento è finito.
In questa analisi rappresentativa, la conduttanza transmucosa al basale del segmento medio dell'intestino piccolo era inferiore nei topi knockout claudin-15 in condizioni di cortocircuito rispetto a quella osservata nei topi wild-type, mentre la corrente di cortocircuito al basale era più alta. Dopo la diluizione luminale del cloruro di sodio, è stata osservata una differenza di potenziale positiva rispetto al lato sieroso nei topi wild-type, ma la differenza è diminuita nei topi knockout claudin-15. Allo stesso modo, la permeabilità relativa del cloruro di sodio è diminuita anche negli animali knockout.
Il calcolo delle permeabilità assolute ha rivelato che la permeabilità assoluta del sodio è diminuita nei topi knockout claudin-15, mentre la permeabilità assoluta del cloruro no, suggerendo che la diminuzione della permeabilità relativa è dovuta a una diminuzione della permeabilità del sodio. Come previsto, l'aggiunta di Forskolin al lato sieroso della camera non ha causato una differenza significativa nel cambiamento della corrente di cortocircuito tra i topi knockout e wild-type. Poiché i segmenti intestinali hanno dimostrato una risposta abbastanza ampia alla forskolina, i preparati di membrana sono stati considerati vitali.
È importante eseguire un'appropriata rimozione dello strato muscolare e garantire che il tessuto sia vitale. Si prega di risciacquare la sezione di dissezione dei topi se la preparazione è fattibile.
