私たちは、消化管を模倣して生きたブタと比較するオルガノイドベースのモデルを開発および特性評価し、輸送特性に焦点を当てることを目指しています。古典的な動物実験からへの変更。私たちの分野では、胃腸生理学に。
オルガノイドベースのin-vitroモデルで、in-vivoの状況を模倣しています。オルガノイドの小腸と大腸のモデルを組み合わせました。これは、当社のモデルと生きている豚の状況を比較するために、リアルタイムで輸送特性を調査するために使用できます。
特に畜産関連の研究では、古典的な動物実験に代わるモデルは稀です。この制限を克服するには、オルガノイドベースのブタ腸管モデルを使用します。今後は、オルガノイドを用いた腸内モデルを用いて、ブタの病原菌の影響を研究する予定です。
これは、これらの細菌の病原性メカニズムを理解することを目的としています。まず、解凍したばかりの基底膜を1:40の比率で、円錐形のチューブ内で氷冷した滅菌PBSと混合します。この混合物の200マイクロリットルを滅菌プレート内の各インサートの頂端コンパートメントに加えます。
ウェルプレートの蓋を元に戻し、5%二酸化炭素と摂氏37度で少なくとも1.5時間インキュベートします。インキュベーション後、メンブレンに触れずに溶液を慎重に吸引します。三次元陰窩オルガノイドを含むウェルからオルガノイド培地を取り出します。
基底膜を溶解するには、1ミリリットルの氷冷PBSをウェルに加え、P1000チップで上下にピペットで動かします。溶解したすべてのオルガノイドを、10ミリリットルの氷冷PBSをあらかじめ充填した15ミリリットルのチューブに集めます。チューブを250Gで摂氏4度で10分間遠心分離します。
上清を吸引した後、ペレットを温かい0.05%トリプシンEDTAの1ミリリットルに再懸濁します。.チューブを37°Cの水浴で5分間インキュベートし、氷の上に置いて反応を止めます。P1000チップでは、ピペットを20回上下させてオルガノイドを完全に再懸濁し、その後、P200チップを上部に取り付けたP1000チップを使用してさらに15回繰り返します。
次に、10%子牛胎児血清(FCS)を補充した氷冷DMEMを10ミリリットル加えます。チューブを1000Gで4°Cで10分間遠心分離します。上清を捨てた後、ペレットを1ミリリットルの単層培地に再懸濁します。
ノイバウアーチャンバーを使用して、製造元の指示に従って、ミリリットルあたりの生細胞数を決定します。次に、頂端コンパートメントからのコーティング溶液を、摂氏37度で焼き戻した500マイクロリットルの単層媒体に交換し、3ミリリットルの単層媒体を基底側コンパートメントに追加します。頂端単分子膜培地を取り出します。
2D培養の場合は、各トランズウェルの頂端チャンバーに、適切な量の細胞を含む500マイクロリットルの単層培地を加え、細胞をインキュベートします。経上皮電気抵抗、またはTEAR測定の場合は、箸電極を70%エタノールで洗浄し、完全に乾燥させます。箸電極の短いアームを頂端コンパートメントに導入し、長いアームをインサートの基底外側コンパートメントに導入します。
次に、電源を入れてさせてください。安定した測定のためにメーター平衡化し、保存ボタンをクリックしてTEAR値を記録します。最後のウェルを測定したら、[保存]をクリックしてデータをUSBデバイスに保存します。
各プレートの後と測定の最後に電極を清掃します。電極を完全に乾かしてから保管してください。測定された細胞値から、細胞を播種する前に決定された空白のTEAR値を差し引きます。
培地を交換し、2〜3日ごとにTEARを測定し、培地を交換する前にTEARが測定されるようにします。500マイクロリットル、または3ミリリットルの新鮮で温かい分化培地を頂端および基底コンパートメントに慎重に追加します。空腸オルガノイドの場合は18日目、結腸オルガノイドの場合は9日目に、播種後、機能実験を進めます。
粘膜および漿膜緩衝液を摂氏37度に温め、カルボゲンで曝気します。個々のチャンバーごとに空のインサートを使用して単一のチャンバーを組み立て、トランズウェルの頂端側がすべて同じ方向を向いていることを確認します。すべてのチャンバーに5ミリリットルの予熱した粘膜緩衝液を充填します。
電圧からのすべての電極を接続しますamp 製造元の指示に従って、個々のチャンバーに。Ussingチャンバーソフトウェアを校正するには、電圧クランプソフトウェアのRFDPIボタンをクリックします。すべての空のインサートの抵抗が約70オームで、電流が約0ミリボルトであることを確認します。
すべての電極を取り外し、使用済みの緩衝液を廃棄します。個々のチャンバーを開き、空のインサートを取り外し、チャンバーの順序を維持します。次に、安全キャビネットの下で、プレートから基底外側と頂端媒体を慎重に吸引します。
頂端チャンバー内で500マイクロリットルの温かい粘膜緩衝液で細胞を洗浄し、基底外側チャンバーで3ミリリットルの漿膜バッファーで細胞を洗浄します。インサートをプレートから取り外し、サポートをそっと取り外します。インサートをUssingチャンバーにセットし、向きがキャリブレーションフェーズと一致することを確認します。
個々のチャンバーを組み立てた後、細胞の基底外側側に面したチャンバーに5ミリリットルの漿液緩衝液を充填し、頂端側に面したチャンバーに5ミリリットルの粘膜緩衝液を充填します。電極とエアレーションチューブを各チャンバーに接続し、Ussingソフトウェアで測定を開始します。ソフトウェアで条件を開回路モードから短絡モードに変更します。
5〜10分間の平衡化後、10マイクロモルのフォルスコリンを漿膜チャンバーに加えます。.15分後、測定を停止し、チャンバーからエアレーションチューブと電極を取り外し、チャンバーを分解します。経上皮電気抵抗値は培養中に徐々に増加し、18日後には空腸で150Ω×センチメートル二乗、9日後には結腸オルガノイドで200Ωセンチメートル四方でピークに達しました。
基礎短絡電流値は、結腸オルガノイドよりも空腸オルガノイドで有意に低かったが、基礎抵抗値は有意差を示さなかった。フォルスコリン治療により、空腸オルガノイドでは基礎短絡電流値が0.86から27.78マイクロアンペア/平方センチメートルに、結腸オルガノイドでは3.83マイクロアンペア/平方センチメートルに大幅に増加しました。
