نحن نهدف إلى تطوير وتوصيف نموذج قائم على العضوية لتقليد الجهاز الهضمي ومقارنته بالخنازير الحية ، والتركيز على خصائص النقل. التغيير من تجربة حيوانية كلاسيكية إلى. في مجالنا من فسيولوجيا الجهاز الهضمي ل.
نموذج مختبري قائم على العضويات ، والذي يحاكي الوضع في الجسم الحي. قمنا بدمج نموذجنا للأمعاء الدقيقة والغليظة للعضيات مع. والتي يمكن استخدامها للتحقيق في خصائص النقل في الوقت الفعلي للسماح بمقارنة نموذجنا وحالة الخنازير الحية.
خاصة في مجال البحوث المتعلقة بالثروة الحيوانية ، فإن النماذج البديلة للتجارب الحيوانية الكلاسيكية نادرة. نتغلب على هذا القيد باستخدام نموذجنا القائم على العضوية للأمعاء الخنازيرية. نخطط لاستخدام نموذجنا المعوي القائم على العضوية لدراسة آثار البكتيريا المسببة للأمراض للخنازير.
يهدف هذا إلى فهم آليات الإمراض لهذه البكتيريا. للبدء ، امزج الغشاء القاعدي المذاب حديثا بنسبة 1:40 مع PBS المعقم المثلج في أنبوب مخروطي الشكل. أضف 200 ميكرولتر من هذا المزيج إلى المقصورة القمية لكل ملحق داخل الألواح المعقمة.
استبدل غطاء لوح البئر واحتضنه لمدة 1.5 ساعة على الأقل عند 37 درجة مئوية ب 5٪ ثاني أكسيد الكربون. بعد الحضانة ، قم بشفط المحلول بعناية دون لمس الغشاء. قم بإزالة الوسط العضوي من الآبار التي تحتوي على عضيات سرداب ثلاثية الأبعاد.
لإذابة الغشاء القاعدي ، أضف ملليلترا واحدا من PBS المثلج إلى البئر والماصة لأعلى ولأسفل باستخدام طرف P1000. اجمع جميع العضيات الذائبة في أنبوب سعة 15 مليلتر مملوء مسبقا ب 10 مل من PBS المثلج. قم بالطرد المركزي للأنبوب عند 250 جم لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية.
بعد شفط المادة الطافية ، أعد تعليق الحبيبات في مليلتر واحد من 0.05٪ التربسين EDTA الدافئ. احتضن الأنبوب لمدة خمس دقائق عند 37 درجة مئوية في حمام مائي، ثم ضعه على الجليد لإيقاف التفاعل. باستخدام طرف P1000، قم بتحريك الماصة لأعلى ولأسفل 20 مرة لإعادة تعليق العضيات تماما، ثم كرر ذلك لمدة 15 مرة أخرى باستخدام طرف P1000 مع طرف P200 متصل في الأعلى.
الآن ، أضف 10 ملليلتر من DMEM المثلج المكمل بمصل ربلة الساق الجنينية بنسبة 10٪ ، أو FCS. قم بالطرد المركزي للأنبوب عند 1000 جم لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية. بعد التخلص من المادة الطافية ، أعد تعليق الحبيبات في مليلتر واحد من وسط أحادي الطبقة.
باستخدام غرفة Neubauer ، اتبع تعليمات الشركة المصنعة لتحديد عدد الخلايا الحية لكل مليلتر. الآن ، استبدل محلول الطلاء من المقصورة القمية ب 500 ميكرولتر من الوسط أحادي الطبقة ، مقسى عند 37 درجة مئوية ، وأضف ثلاثة ملليلتر من الوسط أحادي الطبقة إلى المقصورة الجانبية القاعدية. قم بإزالة الوسط القمي أحادي الطبقة.
بالنسبة للثقافة ثنائية الأبعاد ، أضف 500 ميكرولتر من وسط أحادي الطبقة يحتوي على كمية مناسبة من الخلايا إلى الغرفة القمية لكل بئر واحتضان الخلايا. للمقاومة الكهربائية عبر الظهارة ، أو قياس TEAR ، قم بتنظيف قطب عود تناول الطعام بنسبة 70٪ من الإيثانول واتركه يجف تماما. أدخل الذراع القصير لقطب عود تناول الطعام إلى المقصورة القمية ، والذراع الطويلة في المقصورة الجانبية القاعدية للإدخالات.
بعد ذلك ، قم بتشغيله ودع. قم بتوازن العداد للحصول على قياس مستقر ، ثم انقر فوق زر المتجر لتسجيل قيم TEAR. بعد قياس البئر الأخير ، انقر فوق حفظ لتخزين البيانات على جهاز USB.
نظف القطب بعد كل لوحة وفي نهاية القياس. اترك القطب يجف تماما قبل التخزين. اطرح قيم TEAR الفارغة المحددة قبل زرع الخلايا من القيم الخلوية المقاسة.
قم بتغيير الوسيط وقياس TEAR كل يومين إلى ثلاثة أيام ، مما يضمن قياس TEAR قبل تغيير الوسيط. أضف بعناية 500 ميكرولتر ، أو ثلاثة ملليلتر ، من وسط التمايز الدافئ والطازج إلى المقصورات القمية والقاعدية. في اليوم 18 للعضيات الصائمية ، أو اليوم التاسع للعضيات القولونية ، بعد البذر ، تابع التجارب الوظيفية.
قم بتسخين المحاليل العازلة المخاطية والمصلية إلى 37 درجة مئوية وتهويتها بالكربوجين. قم بتجميع الغرف المفردة باستخدام ملحق فارغ لكل غرفة على حدة ، مع التأكد من أن الجوانب القمية للآبار كلها تواجه في نفس الاتجاه. املأ جميع الغرف بخمسة ملليلتر من محلول الغشاء المخاطي الدافئ مسبقا.
قم بتوصيل جميع الأقطاب الكهربائية من مشبك الجهد إلى الغرف الفردية باتباع تعليمات الشركة المصنعة. لمعايرة برنامج غرفة Ussing ، انقر فوق الزر RFDPI في برنامج مشبك الجهد. تأكد من أن مقاومة جميع الإدخالات الفارغة تبلغ حوالي 70 أوم وأن التيار حوالي صفر مللي فولت.
قم بإزالة جميع الأقطاب الكهربائية وتخلص من محلول المخزن المؤقت المستخدم. افتح الغرف الفردية ، وقم بإزالة الإدخالات الفارغة ، وحافظ على ترتيب الغرف. الآن ، تحت خزانة الأمان ، استنشق بعناية الوسط القاعدي الوحشي والقمي من اللوحة.
اغسل الخلايا ب 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت المخاطي الدافئ في الغرفة القمية ، وبثلاثة ملليلتر من العازلة المصلية في الغرفة القاعدية الجانبية. قم بإزالة الإدخالات من اللوحة وقم بإزالة دعاماتها برفق. ضع الإدخالات في غرف Ussing ، مع التأكد من أن الاتجاه يطابق مرحلة المعايرة.
بعد تجميع الغرف الفردية ، املأ الغرف التي تواجه الجانب القاعدي الجانبي للخلايا بخمسة ملليلتر من العازلة المصلية ، وتلك التي تواجه الجانب القمي بخمسة ملليلتر من العازلة المخاطية. قم بتوصيل الأقطاب الكهربائية وأنابيب التهوية بكل غرفة على حدة ، وابدأ القياس في برنامج Ussing. قم بتغيير الظروف من وضع الدائرة المفتوحة إلى وضع ماس كهربائى في البرنامج.
بعد خمس إلى 10 دقائق من التوازن, إضافة 10 فورسكولين ميكرومولار إلى الغرفة المصلية. بعد 15 دقيقة ، أوقف القياس ، وقم بإزالة أنابيب التهوية والأقطاب الكهربائية من الغرف ، وقم بتفكيك الغرف. زادت قيم المقاومة الكهربائية عبر الظهارة تدريجيا أثناء الزراعة ، وبلغت ذروتها عند 150 أوم مرة في السنتيمتر المربع للصائم بعد 18 يوما ، و 200 أوم مربع لعضويات القولون بعد تسعة أيام.
كانت قيم تيار ماس كهربائى القاعدية أقل بكثير في عضيات الصائم منها في عضيات القولون ، بينما لم تظهر قيم المقاومة القاعدية أي اختلافات ذات دلالة إحصائية. علاجات فورسكولين زيادة كبيرة القيم الحالية ماس كهربائى القاعدية في العضيات الصائمية من 0.86 إلى 27.78 ميكروأمبير لكل سنتيمتر مربع, وفي العضيات القولون من 3.83 إلى 28.78 ميكروأمبير لكل سنتيمتر مربع.
