Gastrointestinal sistemi taklit etmek ve canlı domuzlarla karşılaştırmak için organoid tabanlı bir model geliştirmeyi ve karakterize etmeyi ve taşıma özelliklerine odaklanmayı amaçlıyoruz. Klasik bir hayvan deneyinden geçiş. Gastrointestinal fizyoloji alanımızda bir.
İn vivo durumu taklit eden organoid tabanlı in-vitro model. Modelimizi organoidlerin ince ve kalın bağırsağı ile birleştirdik. Modelimizin ve canlı domuz durumunun karşılaştırılmasına izin vermek için taşıma özelliklerini gerçek zamanlı olarak araştırmak için kullanılabilir.
Özellikle hayvancılıkla ilgili araştırmalar alanında, klasik hayvan deneylerine alternatif modeller nadirdir. Domuz bağırsak sisteminin organoid tabanlı modelini kullanarak bu sınırlamanın üstesinden geliyoruz. Domuz patojenik bakterilerinin etkilerini incelemek için organoid bazlı bağırsak modelimizi kullanmayı planlıyoruz.
Bu, bu bakterilerin patojenite mekanizmalarını anlamayı amaçlar. Başlamak için, taze çözülmüş bazal membranı konik bir tüpte buz gibi soğuk steril PBS ile 1:40 oranında karıştırın. Bu karışımdan 200 mikrolitreyi steril plakalar içindeki her bir ekin apikal bölmesine ekleyin.
Kuyu plakasının kapağını değiştirin ve% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede en az 1,5 saat inkübe edin. İnkübasyondan sonra, zara dokunmadan çözeltiyi dikkatlice aspire edin. Organoid ortamı, üç boyutlu kript organoidleri içeren kuyulardan çıkarın.
Bodrum zarını çözmek için, kuyuya bir mililitre buz gibi soğuk PBS ekleyin ve bir P1000 ucu ile yukarı ve aşağı pipetleyin. Tüm çözünmüş organoidleri 10 mililitre buz gibi soğuk PBS ile önceden doldurulmuş 15 mililitrelik bir tüpte toplayın. Tüpü 250 G'de dört santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin.
Süpernatanı aspire ettikten sonra, peleti bir mililitre ılık% 0.05 tripsin EDTA içinde tekrar süspanse edin. Tüpü bir su banyosunda 37 santigrat derecede beş dakika inkübe edin ve ardından reaksiyonu durdurmak için buzun üzerine yerleştirin. Bir P1000 ucuyla, organoidleri tamamen yeniden askıya almak için 20 kez yukarı ve aşağı pipetleyin ve ardından, üstüne bir P15 ucu takılı bir P1000 ucu kullanarak 200 kez daha tekrarlayın.
Şimdi, %10 fetal buzağı serumu veya FCS ile desteklenmiş 10 mililitre buz gibi DMEM ekleyin. Tüpü 1000 G'de dört santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı attıktan sonra, peleti bir mililitre tek katmanlı ortamda yeniden askıya alın.
Bir Neubauer odası kullanarak, mililitre başına canlı hücre sayısını belirlemek için üreticinin talimatlarını izleyin. Şimdi, kaplama çözeltisini apikal bölmeden 37 santigrat derecede temperlenmiş 500 mikrolitre tek katmanlı ortamla değiştirin ve bazal yan bölmeye üç mililitre tek katmanlı ortam ekleyin. Apikal tek tabakalı ortamı çıkarın.
2D kültür için, her bir transwell'in apikal odasına uygun miktarda hücre içeren 500 mikrolitre tek katmanlı ortam ekleyin ve hücreleri inkübe edin. Transepitelyal elektrik direnci veya TEAR ölçümü için çubuk elektrodu %70 etanol ile temizleyin ve tamamen kurumasını bekleyin. Çubuk elektrodun kısa kolunu apikal bölmeye ve uzun kolu eklerin bazal yan bölmesine sokun.
Ardından, açın ve izin verin. Kararlı bir ölçüm için metre dengesi, ardından TEAR değerlerini kaydetmek için sakla düğmesine tıklayın. Son kuyuyu ölçtükten sonra, verileri bir USB cihazında saklamak için kaydet'e tıklayın.
Her plakadan sonra ve ölçümün sonunda elektrodu temizleyin. Saklamadan önce elektrotun tamamen kurumasını bekleyin. Hücreleri tohumlamadan önce belirlenen boş TEAR değerlerini ölçülen hücresel değerlerden çıkarın.
Ortamı değiştirin ve her iki ila üç günde bir TEAR'ı ölçün, ortam değiştirilmeden önce TEAR'ın ölçüldüğünden emin olun. Apikal ve bazal bölmelere dikkatlice 500 mikrolitre veya üç mililitre taze, ılık farklılaşma ortamı ekleyin. Jejunal organoidler için 18. günde veya kolonik organoidler için dokuzuncu günde, tohumlamadan sonra fonksiyonel deneylere devam edin.
Mukozal ve serozal tampon çözeltilerini 37 santigrat dereceye ısıtın ve karbojen ile havalandırın. Her bir oda için boş bir ek kullanarak tek bölmeleri birleştirin ve transwell'lerin apikal taraflarının hepsinin aynı yöne baktığından emin olun. Tüm odaları beş mililitre önceden ısıtılmış mukozal tampon çözeltisi ile doldurun.
Voltajdan gelen tüm elektrotları bağlayınamp üreticinin talimatlarını izleyerek ayrı bölmelere. Ussing haznesi yazılımını kalibre etmek için, voltaj kelepçesi yazılımındaki RFDPI düğmesine tıklayın. Tüm boş eklerin direncinin yaklaşık 70 ohm olduğunu ve akımın sıfır milivolt civarında olduğunu onaylayın.
Tüm elektrotları çıkarın ve kullanılmış tampon çözeltisini atın. Tek tek odaları açın, boş ekleri çıkarın ve odaların sırasını koruyun. Şimdi, güvenlik kabininin altında, bazolateral ve apikal ortamı plakadan dikkatlice aspire edin.
Hücreleri apikal haznede 500 mikrolitre ılık mukozal tampon ile ve bazolateral haznede üç mililitre serozal tampon ile yıkayın. Ekleri plakadan çıkarın ve desteklerini yavaşça çıkarın. Yönlendirmenin kalibrasyon aşamasına uygun olduğundan emin olarak ekleri Ussing odalarına yerleştirin.
Tek tek odaları monte ettikten sonra, hücrelerin bazolateral tarafına bakan odaları beş mililitre serozal tampon ile ve apikal tarafa bakan odaları beş mililitre mukozal tampon ile doldurun. Elektrotları ve havalandırma tüplerini her bir odaya bağlayın ve ölçümü Ussing yazılımında başlatın. Yazılımdaki koşulları açık devreden kısa devre moduna değiştirin.
Beş ila 10 dakikalık dengelemeden sonra, serozal odaya 10 mikromolar forskolin ekleyin. 15 dakika sonra ölçümü durdurun, havalandırma tüplerini ve elektrotları odalardan çıkarın ve odaları sökün. Trans-epitelyal elektrik direnç değerleri, ekim sırasında kademeli olarak artmış, 18 gün sonra jejunum için 150 ohm çarpı santimetre karede ve dokuz gün sonra kolon organoidleri için 200 ohm santimetre karede zirve yapmıştır.
Bazal kısa devre akımı değerleri jejunum organoidlerinde kolon organoidlerine göre anlamlı derecede düşüktü, bazal direnç değerleri ise anlamlı bir fark göstermedi. Forskolin tedavileri, jejunal organoidlerde bazal kısa devre akımı değerlerini santimetre kare başına 0.86 ila 27.78 mikroamper ve kolonik organoidlerde santimetre kare başına 3.83 ila 28.78 mikroamper arasında önemli ölçüde artırdı.
