L'isolamento e la proliferazione delle cellule staminali derivate dall'adiposio producono un gran numero di cellule staminali che possono essere utilizzate per diverse applicazioni a valle e tecniche sperimentali. Un importante uso previsto per gli adipociti differenziati in questo protocollo sono i saggi metabolici come l'assorbimento del glucosio stimolato dall'insulina, la lipogenesi e la lipolisi stimolata. Per iniziare, creare un ambiente di lavoro sterile disinfettando la cappa di biosicurezza e tutti gli strumenti.
Pipettare circa 10 millilitri di cinque tamponi PBS in quattro piastre di coltura cellulare da 100 millimetri. Trasferire un campione adiposo di 50 grammi in uno dei piatti e lavarlo quattro volte trasferendolo in sequenza attraverso gli altri piatti contenenti cinque PBS. Quindi trasferire il tessuto adiposo lavato in un piatto di coltura pulito da 100 millimetri e tritarlo accuratamente usando forbici o pinze sterili.
Trasferire una sezione da uno a tre centimetri del tessuto tritato in un tubo conico da 50 millilitri contenente 13 millilitri di tampone collagenasi. Risciacquare il tessuto rimanente dal piatto di coltura con due millilitri di tampone collagenasi per garantire un volume totale di 15 millilitri. Mescolare accuratamente il campione utilizzando una pipetta sierologica da 25 millilitri e incubare il tubo a 37 gradi Celsius su un bilanciere per 30-60 minuti.
Per neutralizzare l'attività enzimatica, aggiungere 10 millilitri di terreno di crescita ADSC nel tubo dopo l'incubazione e mescolarlo bene con una pipetta per separare eventuali aggregati tissutali. Trasferire la porzione liquida in un nuovo tubo conico sterile da 50 millilitri, lasciando il tessuto solido. Lavare il tessuto tre volte utilizzando sette millilitri di due PBS e trasferire il liquido nel nuovo tubo.
Quindi, centrifugare il tubo a 500 volte G per cinque minuti e rimuovere con cura il più surnatante possibile senza disturbare il pellet. Risospendere il pellet in un millilitro di globuli rossi 1X o tampone di lisi RBC e incubarlo a temperatura ambiente per 10 minuti. Quindi lavare le cellule due volte aggiungendo cinque millilitri di mezzo di crescita ADSC al tubo e centrifugando per rimuovere il surnatante.
Dopo l'ultimo lavaggio, risospendere il pellet in due millilitri di terreno di coltura ADSC e filtrarlo attraverso un filtro cellulare da 70 micron in un tubo conico sterile da 50 millilitri. Risciacquare il colino con altri due millilitri del mezzo e trasferire quattro millilitri della sospensione in un piatto di coltura sterile da 100 millilitri. Risciacquare il tubo conico due volte con tre millilitri di mezzo per raccogliere un volume totale di 10 millilitri nel piatto di coltura.
Osservare le cellule raccolte al microscopio invertito con un ingrandimento 10X per verificare la presenza di cellule galleggianti. Incubare le cellule per 24 ore in un incubatore di anidride carbonica a 37 gradi Celsius, 5% anidride carbonica e 100% umidità relativa. Per garantire la sterilità dei terreni di coltura, includere una piastra con i soli terreni.
Dopo 24 ore, visualizzare le cellule al microscopio invertito per verificare l'aderenza cellulare. Rimuovere e sostituire il mezzo con mezzo caldo ogni 48 ore fino a quando le celle sono dall'80 al 90% confluenti. Per la proliferazione, rimuovere il terreno di crescita dalle cellule ADSC confluenti e lavarle due volte con due millilitri di PBS sterile a temperatura ambiente.
Aspirare il PBS e aggiungere due millilitri di tripsina EDTA allo 0,25% in ciascuna piastra di coltura, coprendo l'intera superficie della piastra. Incubare la piastra per sette minuti a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica, quindi rimuovere meccanicamente le cellule tripsinizzate mediante pipettaggio forzato. Aggiungere due millilitri di terreno di coltura ADSC e mescolare delicatamente le cellule.
Trasferire le celle in un tubo conico da 50 millilitri, risciacquando il piatto con altri due millilitri di mezzo per garantire il massimo recupero della cella dalla piastra. Quindi, centrifugare il tubo a 500 volte G per cinque minuti a temperatura ambiente e decantare il surnatante per ottenere il pellet cellulare. Risospendere il pellet cellulare in cinque-sei millilitri di terreno di crescita ADSC per milione di cellule.
Contare le cellule usando un emocitometro e placcarle come descritto nel manoscritto di testo. Una volta che le cellule raggiungono l'80-90% di confluenza, aspirare il terreno di crescita e sciacquare le cellule con PBS sterile a temperatura ambiente, quindi aggiungere 10 millilitri di mezzo di differenziazione ADSC. Sostituire il mezzo ogni tre giorni per circa 14-21 giorni.
Osservare le cellule per la presenza di goccioline lipidiche al microscopio invertito con ingrandimento 40X. Gli adipociti maturi sono generalmente osservati dopo 14 giorni. Il giorno della placcatura, gli ADSC non erano aderenti e galleggiavano nella cultura.
Le cellule sono diventate confluenti all'80% dopo 72 ore ed erano pronte per la differenziazione degli adipociti. Dopo 14 giorni di differenziazione ADSC, gli adipociti maturi hanno mostrato forti caratteristiche adipogeniche che sono state osservate con un ingrandimento 40X. Il giorno 14, le cellule sono state colorate e fissate con Oil Red O e BODIPY per la visualizzazione delle goccioline lipidiche.
Gli adipociti differenziati potrebbero essere osservati con un ingrandimento 20X. Quando si tenta questo protocollo, è importante ricordare che un ambiente di lavoro sterile è fondamentale per un sano isolamento, un'adeguata espansione e un'efficiente differenziazione delle cellule staminali derivate dal tessuto adiposo. Seguendo questa procedura, queste cellule possono essere utilizzate per diversi test metabolici come l'assorbimento del glucosio, la lipogenesi e la lipolisi, che è un obiettivo importante della nostra ricerca.
Questa tecnica consente di studiare come l'alcol cronico e la SIV influiscono sulla capacità metabolica degli adipociti.
