L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di isolare e caratterizzare il tessuto adiposo rosso, le cellule staminali mesenchimali essiccate e differenziarle verso le cellule produttrici di insulina utilizzando metodi semplici. Le cellule staminali mesenchimali hanno trovato la strada nel campo della genetica. Possono essere isolati da varie fonti come il midollo osseo, il tessuto adiposo e il tessuto perinatale.
Accettano eccellenti caratteristiche culturali. Sono multi potenti e possono potenzialmente trattare varie malattie. Il tessuto adiposo fornisce una ricca fonte di cellule staminali mesenchimali.
Queste MSC adipose possono essere isolate facilmente dagli aspirati lipo con alta resa rispetto ad altre fonti come il midollo osseo. E possono fornire una buona fonte sia per il trapianto autologo che allogenico. In questo video vengono presentati un semplice protocollo per l'isolamento e la caratterizzazione di cellule staminali mesenchimali adipose da grasso epididimale di ratto.
Questa procedura è un metodo semplice e altamente efficiente per l'isolamento. Dopo l'isolamento, sopporteremo la differenziazione di queste cellule staminali mesenchimali adipose in cellule produttrici di insulina utilizzando un protocollo semplice e relativamente breve. Inizieremo con l'isolamento delle cellule staminali mesenchimali adipose mediante digestione collagenosa del grasso epididimale per ottenere una frazione vascolare più forte.
Quindi le cellule staminali mesenchimali saranno caratterizzate dalla loro aderenza plastica, nonché dall'espressione di marcatori CD e dalla differenziazione in più lignaggi mesodermici. Anaesthise l'animale, quindi eutanasia usando la lussazione cervicale. Spruzzare su tutto il corpo con etanolo al 70% e iniziare con l'escissione della pelle e dei muscoli nella parte inferiore dell'addome.
Quindi esporre i testicoli con il grasso epididimale. Tagliare delicatamente il grasso epididimale. Fare attenzione a non tagliare i vasi sanguigni con i grassi.
In un armadietto di sicurezza bio, tagliare il tessuto adiposo in piccoli pezzi usando pinze e bisturi. Trasferire il tessuto adiposo in tubo centrifugo contenente 10 millilitri di PBS sterile. Inizia il lavaggio inclinando il tubo Falcon per 45 secondi.
Quindi tenere il tubo in piedi per cinque minuti per separarlo in due strati. Rimuovere il PBS infranato utilizzando una siringa da 10 millilitri. Ripeti questa procedura di lavaggio da quattro a cinque volte fino a quando PBS non è chiaro.
Dopo il lavaggio, sospendere nuovamente il tessuto adiposo in soluzione collagenosa, quindi incubare a bagno d'acqua tremante fino a quando il tessuto è quasi omogeneo. Successivamente, ruotare la miscela collagenosa tissutale per 15 secondi, quindi centrifugare successivamente per cinque minuti. Dopo la centrifugazione, avrai tre strati.
Scartare con attenzione il surnatante sulla frazione vascolare stromale. Per prima cosa scartare con attenzione lo strato di olio nella parte superiore, seguito dallo strato di echi senza disturbare il pellet della frazione vascolare stromale. Sospendere nuovamente la frazione vascolare stromale in BSA sterile e ricentrare per cinque minuti.
Centrifugazione intera, posizionare il supporto DMEM F-12 completo in un pallone quadrato di 25 centimetri. Dopo la centrifugazione, scartare il surnatante e sospendere nuovamente il pellet vascolare stromale in un mezzo DMEM F-12 completo. E trasferisci al pallone di coltura.
Posizionare in 37 gradi 5% incubatore di anidride carbonica. Il giorno successivo, rimuovere le celle non attaccate e sostituire il supporto con un supporto nuovo. A partire dal giorno successivo di isolamento, le cellule simili ai fibroblasti inizieranno ad apparire.
Poi gradualmente con il passare del tempo aumenteranno di numero e dimensioni. Passando, le cellule diventeranno più omogenee. Queste cellule presentano tutti i criteri di caratterizzazione delle cellule staminali mesenchimali.
Queste cellule sono state differenziate verso le cellule produttrici di insulina utilizzando questo semplice protocollo contenente nicotinamide beta mercaptoetanolo ed Exendin-4. Durante le fasi di differenziazione, le cellule iniziano a perdere la loro forma fibroblastica e penso che la morfologia sia simile a un cluster. Quando le cellule produttrici di insulina utilizzate mostrano una colorazione positiva del disitone rosso cremisi, quindi le cellule produttrici di insulina utilizzate esprimono vari marcatori delle cellule beta come Pdx-1, mafA e insulina.
Inoltre, le cellule produttrici di insulina indotte secernono livelli più elevati di insulina nel surnatante quando sfidate con una maggiore concentrazione di glucosio. Abbiamo fornito un protocollo dettagliato e graduale per l'isolamento e la caratterizzazione delle cellule staminali mesenchimali adipose. Forniamo anche qui un protocollo relativamente breve, semplice ed efficiente per la differenziazione delle cellule staminali mesenchimali adipose in cellule produttrici di insulina.
Ciò fornisce un gateway per il ricercatore per entrare nel campo delle cellule staminali mesenchimali e studiare la loro differenziazione in cellule produttrici di insulina.
