恒河猴脂肪干细胞的分离、增殖和分化

脂肪来源的干细胞分离和增殖产生大量干细胞，可用于多种下游应用和实验技术。该方案中分化脂肪细胞的主要预期用途是代谢测定，例如胰岛素刺激的葡萄糖摄取，脂肪生成和刺激的脂肪分解。首先，通过对生物安全罩和所有工具进行消毒来创造一个无菌的工作环境。

将大约10毫升的5个PBS缓冲液移液到四个100毫米细胞培养皿中。将50克脂肪样品转移到其中一个培养皿中，并通过在含有五个PBS的其他培养皿上依次转移来洗涤四次。然后将洗净的脂肪组织转移到干净的100毫米培养皿中，并用剪刀或无菌镊子将其彻底切碎。

将切碎组织的一到三厘米部分转移到含有13毫升胶原酶缓冲液的50毫升锥形管中。用两毫升胶原酶缓冲液冲洗培养皿中的剩余组织，以确保总体积为15毫升。使用 25 毫升血清移液管彻底混合样品，并将试管在 37 摄氏度的摇臂上孵育 30 至 60 分钟。

为了中和酶活性，在孵育后将10毫升ADSC生长培养基加入试管中，并与移液管充分混合以分离任何组织聚集体。将液体部分转移到新的无菌50毫升锥形管中，离开固体组织。使用七毫升两个PBS洗涤纸巾三次，然后将液体转移到新管中。

接下来，以500倍G离心管五分钟，并小心地除去尽可能多的上清液，而不会干扰沉淀。将沉淀重悬于一毫升1X红细胞或RBC裂解缓冲液中，并在室温下孵育10分钟。然后通过向管中加入五毫升ADSC生长培养基并离心除去上清液来洗涤细胞两次。

最后一次洗涤后，将沉淀重悬于两毫升ADSC生长培养基中，并通过70微米细胞过滤器将其过滤到无菌的50毫升锥形管中。用另外两毫升培养基冲洗过滤器，并将四毫升悬浮液转移到无菌的100毫升培养皿中。用三毫升培养基冲洗锥形管两次，以在培养皿中收集总体积为10毫升。

在倒置显微镜下以10X放大倍率观察收集的细胞，以检查漂浮细胞。将细胞在37摄氏度，5%二氧化碳和100%相对湿度的二氧化碳培养箱中孵育24小时。为确保培养基的无菌性，请包括一个单独带有培养基的板。

24小时后，在倒置显微镜下观察细胞以检查细胞粘附性。每48小时取出并用温热培养基替换培养基，直到细胞汇合80%至90%。为了增殖，从汇合的ADSC细胞中取出生长培养基，并用两毫升无菌室温PBS洗涤两次。

吸出PBS并将两毫升0.25%胰蛋白酶EDTA加入每个培养板中，覆盖板的整个表面积。将板在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育 7 分钟，然后通过强制移液机械地移开胰蛋白酶消化的细胞。加入两毫升ADSC生长培养基，轻轻混合细胞。

将细胞转移到50毫升锥形管中，用另外两毫升培养基冲洗培养皿，以确保从平板中最大程度地回收细胞。接下来，在室温下以500倍G离心管5分钟，并倒出上清液以获得细胞沉淀。将细胞沉淀重悬于每百万个细胞五至六毫升ADSC生长培养基中。

使用血细胞计数器计数细胞，并按照文本手稿中的说明进行铺板。一旦细胞达到80%至90%汇合度，吸出生长培养基并用无菌室温PBS冲洗细胞，然后加入10毫升ADSC分化培养基。每三天更换一次培养基，持续约 14 至 21 天。

在倒置显微镜下以40X放大倍率观察细胞是否存在脂滴。成熟脂肪细胞通常在 14 天后观察到。在电镀当天，ADSCs不粘附并漂浮在培养物中。

细胞在72小时后变得80%汇合，并准备进行脂肪细胞分化。经过14天的ADSC分化，成熟脂肪细胞表现出强烈的脂肪生成特征，在40X放大镜下观察到。在第14天，对细胞进行染色并用油红O和BODIPY固定以进行脂滴可视化。

在20X放大镜下可以观察到分化的脂肪细胞。在尝试此方案时，重要的是要记住，无菌的工作环境对于脂肪来源干细胞的健康分离，充分扩增和有效分化至关重要。遵循此过程后，这些细胞可用于多种代谢测定，例如葡萄糖摄取，脂肪生成和脂肪分解，这是我们研究的主要焦点。

该技术允许研究慢性酒精和SIV如何影响脂肪细胞代谢能力。