Die Isolierung und Proliferation von Stammzellen aus Fett erzeugt eine große Anzahl von Stammzellen, die für verschiedene nachgelagerte Anwendungen und experimentelle Techniken verwendet werden können. Ein Hauptverwendungszweck für differenzierte Adipozyten in diesem Protokoll sind metabolische Assays wie insulinstimulierte Glukoseaufnahme, Lipogenese und stimulierte Lipolyse. Schaffen Sie zunächst eine sterile Arbeitsumgebung, indem Sie die Biosicherheitshaube und alle Werkzeuge desinfizieren.
Pipettieren Sie etwa 10 Milliliter von fünf PBS-Puffern in vier 100-Millimeter-Zellkulturschalen. Eine 50-Gramm-Fettprobe in eines der Schalen geben und viermal waschen, indem Sie sie nacheinander auf die anderen Schalen mit fünf PBS übertragen. Anschließend wird das gewaschene Fettgewebe in eine saubere 100-Millimeter-Kulturschale gegeben und mit einer Schere oder einer sterilen Pinzette gründlich zerkleinert.
Übertragen Sie einen ein bis drei Zentimeter großen Abschnitt des Hackfleischgewebes in ein 50 Milliliter konisches Röhrchen, das 13 Milliliter Kollagenasepuffer enthält. Spülen Sie das restliche Gewebe aus der Kulturschale mit zwei Milliliter Kollagenasepuffer, um ein Gesamtvolumen von 15 Milliliter zu gewährleisten. Mischen Sie die Probe gründlich mit einer 25-Milliliter-serologischen Pipette und inkubieren Sie das Röhrchen bei 37 Grad Celsius auf einer Wippe für 30 bis 60 Minuten.
Um die Enzymaktivität zu neutralisieren, geben Sie nach der Inkubation 10 Milliliter ADSC-Wachstumsmedium in das Röhrchen und mischen Sie es gut mit einer Pipette, um eventuelle Gewebeaggregate zu trennen. Übertragen Sie den flüssigen Teil in ein neues steriles 50-Milliliter-Konusröhrchen und verlassen Sie das feste Gewebe. Waschen Sie das Gewebe dreimal mit sieben Milliliter von zwei PBS und übertragen Sie die Flüssigkeit in das neue Röhrchen.
Als nächstes zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 500 mal G für fünf Minuten und entfernen Sie vorsichtig so viel Überstand wie möglich, ohne das Pellet zu stören. Resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter 1X roter Blutkörperchen oder RBC-Lysepuffer und inkubieren Sie es bei Raumtemperatur für 10 Minuten. Dann waschen Sie die Zellen zweimal, indem Sie fünf Milliliter ADSC-Wachstumsmedium in das Röhrchen geben und zentrifugieren, um den Überstand zu entfernen.
Nach der letzten Wäsche das Pellet in zwei Milliliter ADSC-Wachstumsmedium resuspendieren und durch ein 70-Mikron-Zellsieb in ein steriles 50-Milliliter-Konusröhrchen filtrieren. Spülen Sie das Sieb mit zusätzlichen zwei Milliliter des Mediums ab und geben Sie vier Milliliter der Suspension in eine sterile 100-Milliliter-Kulturschale. Spülen Sie das konische Röhrchen zweimal mit drei Milliliter Medium aus, um ein Gesamtvolumen von 10 Milliliter in der Kulturschale zu sammeln.
Beobachten Sie die gesammelten Zellen unter einem inversen Mikroskop bei 10-facher Vergrößerung, um nach schwebenden Zellen zu suchen. Inkubieren Sie die Zellen für 24 Stunden in einem Kohlendioxid-Inkubator bei 37 Grad Celsius, 5% Kohlendioxid und 100% relativer Luftfeuchtigkeit. Um die Sterilität der Nährmedien zu gewährleisten, fügen Sie eine Platte nur mit Medien hinzu.
Nach 24 Stunden betrachten Sie die Zellen unter dem inversen Mikroskop, um die Zelladhärenz zu überprüfen. Entfernen Sie das Medium und ersetzen Sie es alle 48 Stunden durch warmes Medium, bis die Zellen zu 80 bis 90% konfluiert sind. Zur Proliferation das Wachstumsmedium aus den konfluierenden ADSC-Zellen entfernen und zweimal mit zwei Milliliter sterilem PBS bei Raumtemperatur waschen.
Das PBS wird abgesaugt und zwei Milliliter 0,25% Trypsin EDTA in jede Kulturplatte gegeben, wobei die gesamte Oberfläche der Platte abgedeckt wird. Inkubieren Sie die Platte für sieben Minuten bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid und entfernen Sie dann mechanisch die trypsinisierten Zellen durch kraftvolles Pipettieren. Fügen Sie zwei Milliliter ADSC-Wachstumsmedium hinzu und mischen Sie die Zellen vorsichtig.
Übertragen Sie die Zellen in ein 50-Milliliter-konisches Röhrchen und spülen Sie die Schale mit zusätzlichen zwei Milliliter Medium ab, um eine maximale Zellerholung von der Platte zu gewährleisten. Als nächstes zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 500 mal G für fünf Minuten bei Raumtemperatur und dekantieren Sie den Überstand, um das Zellpellet zu erhalten. Resuspendieren Sie das Zellpellet in fünf bis sechs Milliliter ADSC-Wachstumsmedium pro Million Zellen.
Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer und legen Sie sie wie im Textmanuskript beschrieben vor. Sobald die Zellen eine Konfluenz von 80 bis 90% erreicht haben, saugen Sie das Wachstumsmedium an und spülen Sie die Zellen mit steriler Raumtemperatur PBS und fügen Sie dann 10 Milliliter ADSC-Differenzierungsmedium hinzu. Ersetzen Sie das Medium alle drei Tage für ca. 14 bis 21 Tage.
Beobachten Sie die Zellen auf das Vorhandensein von Lipidtröpfchen unter dem inversen Mikroskop bei 40-facher Vergrößerung. Reife Adipozyten werden in der Regel nach 14 Tagen beobachtet. Am Tag der Beschichtung waren die ADSCs nicht konform und schwebten in Kultur.
Die Zellen wurden nach 72 Stunden zu 80% konfluent und waren bereit für die Adipozytendifferenzierung. Nach 14 Tagen ADSC-Differenzierung zeigten reife Adipozyten starke adipogene Eigenschaften, die unter 40-facher Vergrößerung beobachtet wurden. Am Tag 14 wurden die Zellen gefärbt und mit Oil Red O und BODIPY zur Visualisierung von Lipidtröpfchen fixiert.
Differenzierte Adipozyten konnten unter 20-facher Vergrößerung beobachtet werden. Wenn Sie dieses Protokoll versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, dass eine sterile Arbeitsumgebung für eine gesunde Isolierung, angemessene Expansion und effiziente Differenzierung von Fettstammzellen entscheidend ist. Nach diesem Verfahren können diese Zellen für verschiedene metabolische Assays wie Glukoseaufnahme, Lipogenese und Lipolyse verwendet werden, was ein Schwerpunkt unserer Forschung ist.
Mit dieser Technik kann untersucht werden, wie sich chronischer Alkohol und SIV auf die Stoffwechselkapazität der Adipozyten auswirken.
