지방 유래 줄기 세포 분리 및 증식은 여러 다운스트림 응용 분야 및 실험 기술에 사용할 수 있는 많은 수의 줄기 세포를 생성합니다. 이 프로토콜에서 분화된 지방세포의 주요 의도된 용도는 인슐린 자극 포도당 흡수, 지방 생성 및 자극 지방 분해와 같은 대사 분석입니다. 시작하려면 생물 안전 후드와 모든 도구를 소독하여 멸균 작업 환경을 조성하십시오.
약 10 밀리리터의 5 PBS 버퍼를 4 개의 100 밀리미터 세포 배양 접시에 피펫팅합니다. 50g의 지방 샘플을 접시 중 하나에 옮기고 5 개의 PBS가 들어있는 다른 접시에 순차적으로 옮겨 4 번 씻습니다. 그런 다음 씻은 지방 조직을 깨끗한 100mm 배양 접시에 옮기고 가위 또는 멸균 집게를 사용하여 철저히 말하십시오.
다진 조직의 1-3cm 섹션을 13ml의 콜라게나제 완충액이 들어있는 50 밀리리터의 원추형 튜브로 옮깁니다. 배양 접시에서 남은 조직을 2 밀리리터의 콜라게나제 완충액으로 헹구어 총 부피가 15 밀리리터가되도록합니다. 25 밀리리터 혈청 학적 피펫을 사용하여 샘플을 철저히 혼합하고 로커에서 섭씨 37도에서 튜브를 30-60 분 동안 배양합니다.
효소 활성을 중화시키기 위해 배양 후 ADSC 성장 배지 10ml를 튜브에 넣고 피펫으로 잘 혼합하여 조직 응집체를 분리하십시오. 액체 부분을 새로운 멸균 50 밀리리터 원추형 튜브로 옮겨 고체 조직을 남깁니다. 7 밀리리터의 2 PBS를 사용하여 조직을 3 번 씻고 액체를 새 튜브로 옮깁니다.
다음으로, 튜브를 500 배 G에서 5 분 동안 원심 분리하고 펠릿을 방해하지 않고 가능한 한 많은 상청액을 조심스럽게 제거합니다. 펠릿을 1X 적혈구 또는 RBC 용해 완충액 1ml에 재현탁하고 실온에서 10분 동안 배양합니다. 그런 다음 5 밀리리터의 ADSC 성장 배지를 튜브에 첨가하고 원심 분리하여 상청액을 제거하여 세포를 두 번 세척하십시오.
마지막 세척 후 펠릿을 ADSC 성장 배지 2ml에 다시 현탁하고 70미크론 세포 스트레이너를 통해 멸균 50밀리리터 원추형 튜브에 여과합니다. 여과기를 추가 2 밀리리터의 배지로 헹구고 4 밀리리터의 현탁액을 멸균 된 100 밀리리터 배양 접시에 옮깁니다. 원추형 튜브를 3 밀리리터의 배지로 두 번 헹구어 배양 접시에 총 10 밀리리터의 부피를 모으십시오.
수집된 세포를 도립 현미경으로 10X 배율로 관찰하여 부유 세포를 확인합니다. 섭씨 37도, 5 % 이산화탄소 및 100 % 상대 습도의 이산화탄소 인큐베이터에서 24 시간 동안 세포를 배양합니다. 배양 배지의 무균성을 보장하려면 배지만 있는 플레이트를 포함하십시오.
24시간 후 도립 현미경으로 세포를 관찰하여 세포 부착을 확인합니다. 세포를 제거하고 48시간마다 따뜻한 배지로 교체하여 세포가 80-90% 합류할 때까지 합니다. 증식을 위해, 합류성 ADSC 세포로부터 성장 배지를 제거하고, 2 밀리리터의 멸균 실온 PBS로 이들을 2회 세척한다.
PBS를 흡인하고 각 배양 플레이트에 0.25% 트립신 EDTA 2밀리리터를 추가하여 플레이트의 전체 표면적을 덮습니다. 플레이트를 섭씨 37도 및 5%이산화탄소에서 7분 동안 배양한 다음 강제 피펫팅으로 트립신화된 세포를 기계적으로 제거합니다. 2 밀리리터의 ADSC 성장 배지를 넣고 세포를 부드럽게 혼합하십시오.
세포를 50 밀리리터 원추형 튜브로 옮기고 접시에서 최대 세포 회복을 보장하기 위해 추가 2 밀리리터의 배지로 접시를 헹굽니다. 다음으로, 튜브를 실온에서 5분 동안 500배 G로 원심분리하고 상층액을 따라 따라 세포 펠렛을 얻었다. 세포 펠렛을 백만 세포 당 5 내지 6 밀리리터의 ADSC 성장 배지에 재현탁시킨다.
혈구계를 사용하여 세포를 세고 텍스트 원고에 설명 된대로 플레이트하십시오. 세포가 80 90% confluency에 도달하면, 성장 배지를 흡인하고 멸균 실온 PBS로 세포를 헹구고, 그 후에 ADSC 분화 배지의 10 밀리리터를 추가하십시오. 약 14-21일 동안 3일마다 배지를 교체하십시오.
40X 배율로 도립 현미경으로 지질 방울이 있는지 세포를 관찰합니다. 성숙한 지방 세포는 일반적으로 14 일 후에 관찰됩니다. 도금 당일, ADSC는 고착되지 않았고 문화에 떠 다녔습니다.
세포는 72시간 후에 80%합류가 되었고 지방세포 분화 준비가 되었습니다. ADSC 분화 14일 후, 성숙한 지방세포는 40X 배율 하에서 관찰되는 강한 지방생성 특성을 나타냈다. 14일째에, 세포를 염색하고, 지질 액적 시각화를 위해 Oil Red O 및 BODIPY로 고정시켰다.
분화된 지방세포는 20X 배율 하에서 관찰될 수 있었다. 이 프로토콜을 시도할 때 멸균 작업 환경이 건강한 분리, 적절한 확장 및 지방 유래 줄기 세포의 효율적인 분화에 중요하다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 이러한 세포는 포도당 섭취, 지방 생성 및 우리 연구의 주요 초점인 지방 분해와 같은 여러 대사 분석에 사용될 수 있습니다.
이 기술은 만성 알코올과 SIV가 지방 세포 대사 능력에 어떻게 영향을 미치는지에 대한 조사를 허용합니다.
