Min P. Kim ha ricevuto sovvenzioni dal secondo John W. Kirklin borsa di ricerca, associazione americana per Grant toracico chirurgia, Graham Foundation, Houston Methodist specialità medico gruppo di ricerca e Michael M. e Joann H. cono Research Award. Grazie Ann Saikin per la modifica della lingua del manoscritto.

I protocolli per gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal comitato di utilizzo presso il Methodist Research Institute di Houston e istituzionali Animal Care ed effettuati secondo tutte le norme, leggi, linee guida e politiche.
1. ratto polmone Harvest
<ol><li>Anestetizzare un ratto Sprague-Dawley maschio a 6-week-old 4 tramite un'iniezione intraperitoneale (IP) di ketamina (100 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg) nel suo fianco. Garantire l'anestesia controllando per un'assenza di movimento quando la punta dell'arto viene pizzicata con il forcipe.</li>
	<li>Dopo 10 min, radere il torace e l'addome e pulire la pelle con un batuffolo di clorexidina.</li>
	<li>Togliere la pelle raccoglierlo con il forcipe e incidendo esso con un bisturi monouso. Dopo l'apertura della cavità toracica di incisione con bisturi, eseguire una toracotomia bilaterale tagliando il lato anteriore della gabbia toracica a sinistra e destra del diaframma con le forbici. Nota: Questo è un intervento chirurgico non-sopravvivenza.</li>
	<li>Tenere la gabbia toracica e iniettare 2 mL di eparina (1.000 unità/mL) nel ventricolo destro del cuore usando un ago da 27 G. Nota: Questo impedirà qualsiasi formazione di coaguli di sangue nel polmone.</li>
	<li>Completamente rimuovere la gabbia toracica con le forbici e inserire un ago da 18 G nel ventricolo sinistro come uno sfogo, fino a quando esce il sangue. Quindi, iniettare 15 mL di tampone fosfato soluzione fisiologica eparinizzata (12,5 unità/mL; eparinizzata PBS) nel ventricolo di destra usando un ago 25 G.</li>
	<li>Taglio inferiore e superiore della vena cava, due grandi vene sul lato destro del cuore e svuotare i polmoni con un ulteriore 10 mL di PBS eparinizzata nel ventricolo di destra utilizzando un ago da 27 G. Nota: La vena cava inferiore è visualizzata sotto il fondo del cuore come un grande vaso pieno di sangue rosso. Allo stesso modo, la vena cava superiore è visualizzata nella parte superiore del cuore come una grande nave.</li>
	<li>Tagliare la trachea alla base della tiroide. Rimuovere con cautela l'aorta discendente a livello della vena emiazygos e rami dell'aorta all'arco.</li>
	<li>Estrarre il blocco cuore-polmoni dalla cavità toracica e il resto del corpo del ratto.</li>
	<li>Eseguire ventriculotomy tagliando la metà dei ventricoli destro e sinistro e inserire una cannula di ago in acciaio inox su misura preriempita di 18 G attraverso il ventricolo destro nell'arteria polmonare principale (PA).</li>
	<li>Fissare la cannula con una cravatta di seta 2-0 e attentamente esporre il ventricolo destro e l'atrio.</li>
	<li>Posizionare una paratia Luer femmina nel ventricolo sinistro e fissarlo con una cravatta di seta 2-0.</li>
	<li>Svuotare il blocco cuore-polmoni con 20 mL di PBS eparinizzata attraverso la cannula di PA e metterlo in una provetta da 50 mL contenenti terreni di coltura o PBS eparinizzata. Nota: Per un modello di cellulare, andare al punto 3.1 per impostare il bioreattore. Per un modello acellulare, procedere al punto 2.1 per il decellularizzati.</li>
</ol>2. polmone decellularizzazione
<ol><li>
Preparazione dell'unità decellularizzazione
	<ol>
<li>Preparare ogni camera/bottiglia di decellularizzazione piercing due fori nel tappo della bottiglia e facendo scattare un Luer femmina nei fori (Figura 1A e 1B). Fissarlo con un anello di nylon nero sul lato opposto. Allo stesso modo, un foro singolo in un altro tappo di bottiglia per il fissaggio set endovenoso (Figura 1). Nota: Figura 1A e 1B sono lo stessa di tappi di bottiglia da due lati diversi. Figura 1 è di un tappo diversi con un unico foro come indicato sopra al punto 2.1.1.</li>
		<li>Fissare un tubo di 0,5 pollici (all'arteria polmonare o alla fine di PA) e tubi di 6 pollici (Figura 1J) un raccordo luer femmina da dentro i tappi di bottiglia (Figura 1A e 1B) e un maschio Luer lock alle estremità. Impostare il blocco con una bottiglia di 500 mL come la camera di decellularizzazione/bottiglia.</li>
		<li>Collegare un'estremità dei due tubi 2 ft (che sono collegati con un maschio Luer lock) a entrambe le estremità del tubo pompa (Figura 1 H), che è attaccato alla testa della pompa (Figura 1E e 1F) da una cartuccia (Figura 1) con un raccordo Luer blocco (Figura 1I).</li>
		<li>Collegare le altre estremità dei 2 ft tubi (dal punto 2.1.3) ciascuna per una testa femminile di Luer lock sul cappuccio decellularizzazione camera/bottiglia (Figura 1 L).</li>
		<li>Impostare un 250ml eparinizzato bottiglia di PBS (con 200 mL di PBS) appendendo una bottiglia rovesciata su un supporto con l'estremità prossimale di un set per via endovenosa (Figura 1) inserito nel tappo della bottiglia e l'estremità distale, sostituire il tubo di 2 ft collegato alla c di decellularizzazione hamber/bottiglia alla fine PA (Figura 1B). Collegare questo tubo di 2 ft alla bottiglia di scartare. Nota: Le bottiglie sono impostate in cartone, come mostrato in Figura 1 K. I tubi endovenosa vengono fuori le bottiglie di impiccagione di dispensare i reagenti nell'impalcatura del polmone.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Processo di decellularizzazione di polmone
	<ol>
<li>Eseguire il PBS eparinizzato ad una pressione di aspersione fisiologica di 30 mm Hg (Figura 1 K) fino a quando non scorre liberamente in decellularizzazione camera/bottiglia e, quindi, collegare il blocco cuore-polmoni fino alla fine di PA attraverso la cannula di PA.</li>
		<li>Mantenere continuamente, in funzione la pompa in modo che qualsiasi soluzione/tampone in eccesso all'interno della camera/bottiglia di decellularizzazione ottiene scartato.</li>
		<li>Eseguire il PBS eparinizzato attraverso il PA per 15 min a una pressione di aspersione di 30 mm Hg per il lavaggio iniziale (Figura 1 K).</li>
		<li>Sostituire la bottiglia eparinizzata PBS con 0,1% sodio dodecil solfato (SDS) in acqua deionizzata e irrorare il polmone per 2 h per il decellularizzati.</li>
		<li>Dopo il decellularizzazione, irrorare acqua deionizzata in autoclave attraverso l'impalcatura del polmone per 15 min.</li>
		<li>Quindi, irrorare il detergente non ionico 1% in acqua deionizzata per 10 min.</li>
		<li>Sostituire la camera/bottiglia di decellularizzazione con 500 mL di PBS in autoclave completati con antibiotici di x 1 (penicillina-streptomicina amfotericina), mantenendo intatto con il tappo del polmone appeso all'interno della bottiglia.</li>
		<li>Gettare il dispositivo di venipunzione insieme, messo il tubo 2 ft attaccato al contenitore scartando alla fine della sezione decellularizzazione, arteria polmonare e far funzionare la pompa a 6 mL/min (Figura 1 L).</li>
		<li>Irrorare i polmoni per 72 h e mantenere cambiando il PBS con antibiotici ogni 12 h. Nota: Il polmone acellulare è pronto per l'uso immediato. Esso può essere conservato a-80 ˚ fino a quando necessario. Se macchie rosa o coaguli di sangue può essere visualizzati chiaramente nei lobi del polmone, scartare il polmone. È possibile testare in modo casuale per DNA o l'istopatologia. Un polmone completo acellulare non mostrerà le cellule e il 99,9% del DNA saranno lavati. Nota: Quando si lavora con un modello cellulare del polmone, saltare il decellularizzati. Il polmone raccolto (passaggio 1) impostabile direttamente nel bioreattore.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. bioreattore set-up
<ol><li>Preparare la bottiglia di bioreattore e gli elementi necessari per il set-up.<ol>
<li>Praticare tre fori in un tappo di bottiglia 500 mL a uguale distanza e difficoltà un Luer femmina in tutti e tre i fori, utilizzando anelli di nylon nero (Figura 2A e 2B). Nota: Nei due fori, Luer lock finisce volto all'esterno, mentre un'estremità sia rivolto verso l'interno della bottiglia.</li>
		<li>Tagliare un 6 nel tubo della pompa, un 2 in tubo, un 6 in tubo, un tubo di 1,5 ft, un tubo di 2 ft e un tubo di 10 ft ossigenatore a bioreattore.</li>
		<li>Tagliare un ago da 18 G in acciaio inox e, ancora una volta, collegare le estremità con tubo biocompatibile per una cannula trachea.</li>
		<li>Avvolgere il tubo di ossigenatore, con connettori Luer lock alle estremità, su una rete metallica solenoide utilizzando nastri autoclave (Figura 2).</li>
		<li>Autoclave le suddette voci e tenerli in UV luce per 10 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Impostare la pompa all'interno dell'incubatrice di cultura delle cellule regolari (37 ° C, 5% CO2) con la corretta spaziatura tra i vassoi per adattarsi facilmente una bottiglia da 500 mL.</li>
	<li>Spruzzare etanolo al 70% della cartuccia della pompa e collegare il tubo della pompa con connettori di tipo Luer femminile su entrambe le estremità della pompa.</li>
	<li>Impostare l'ossigenatore avvolto intorno il solenoide metallica all'interno dell'incubatrice di cultura cellulare collegando un'estremità (il deflusso) dell'ossigenatore per il tubo della pompa e l'altra estremità con il tubo di 1,5 ft nel bioreattore.</li>
	<li>Impostare la bottiglia di bioreattore in una biosicurezza armadietto con condizioni asettiche.<ol>
<li>Collegare un rubinetto a 3 vie (giallo) alla testa di uno del luer femmina per controllare il flusso attraverso il PA.</li>
		<li>Collegare un rubinetto d'arresto unidirezionale (blu) a un'altra paratia di blocco Luer femmina per semina attraverso la trachea (Figura 2F) cellulare.</li>
		<li>Collegare 2 in tubazione all'esterno (bianco) e 6 in tubi all'interno della bottiglia per far circolare i mezzi fuori. Montare un maschio Luer lock per un tubo di 2 ft e associare uno stile di aletta Luer femmina Tee per fornire accessibilità per aggiungere o rimuovere nulla.</li>
		<li>Collegare un rubinetto unidirezionale a una delle aperture del tre vie connettore (Luer aletta stile femminile Tee).</li>
		<li>Allegare un Luer lock maschio e una femmina Luer lock per tubi 2 ft.</li>
		<li>Aggiungere 200 mL di RPMI1640 con 10% FBS e 1% antibiotici mezzo di coltura cellulare (varia secondo il requisito di cella) e trasferire il bioreattore per l'incubatrice. Collegare il tubo di ossigenatore a due estremità aperte (rubinetto unidirezionale e raccordo a t) per renderlo un bioreattore a circuito chiuso.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pre-eseguire la pompa a 6 mL/min all'interno dell'incubatrice di cultura cellulare con terreni di coltura cellulare per riempire l'ossigenatore e tubi, in modo che bolle d'aria non presenti nella tubazione.</li>
	<li>Una volta che i tubi sono riempiti di media, chiudere il rubinetto e rimuovere la bottiglia di bioreattore dall'incubatrice scollegando gli ossigenatori da entrambe le estremità della bottiglia bioreattore.</li>
	<li>Mettere la bottiglia di bioreattore nella biosicurezza mobile, passare i contenuti multimediali di cultura attraverso il rubinetto di arresto e collegare la cannula di PA dell'impalcatura del polmone (acellulare o cellulare) al rubinetto attraverso il connettore Luer maschio. Nota: Qui è possibile utilizzare il modello acellulare (seguendo il processo di decellularizzazione) o un blocco cuore-polmoni appena raccolte (cioè, il modello di cellulare, come esso mantiene le cellule di ratto nativo).</li>
	<li>Passare i contenuti multimediali di cultura attraverso un rubinetto unidirezionale per eliminare l'aria e legare la cannula trachea da un filo di seta alla trachea.</li>
	<li>Assicurarsi di evitare qualsiasi torsione della PA e della trachea. Nelle vicinanze il tappo del flacone di bioreattore con il polmone dell'impalcatura all'interno e, ancora una volta, asetticamente trasferire il bioreattore per l'incubatore e avviare la pompa ad una velocità di 6 mL/min.</li>
	<li>Mezzi di coltura per 10-15 min per assicurarsi di eseguire tutti i lobi ottenere gonfiati e polmone sembra in buona forma (Figura 2).</li>
</ol>4. metastasi modello e semina delle cellule
Nota: Procedere alla cella semina con il modello precedente del polmone per uno studio di crescita del tumore primario. Modificare l'impalcatura del polmone (acellulare o cellulare) come indicato di seguito per il modello metastatico.
<ol><li>Estrarre il bioreattore con l'impalcatura del polmone dall'incubatrice e metterlo nella biosicurezza armadietto.</li>
	<li>Utilizzare una siringa Luer lock per passare 5 mL di terreno di coltura attraverso la trachea e aprire il tappo del bioreattore con l'impiccagione dell'impalcatura del polmone (Figura 2F).</li>
	<li>A questo punto, una persona in più è necessaria per aiutare nella modifica del polmone ad un modello metastatico.</li>
	<li>Ottenere la seta 2-0 pronto e utilizzare pinze angolari per fare un passaggio attraverso la trachea sul punto di biforcazione.</li>
	<li>Legare la trachea fara ' il polmone di destra nel punto di biforcazione e controllare il libero flusso dei media attraverso la trachea per il polmone di sinistra passando terreni di coltura. Nota: Una volta la trachea è legata al punto di biforcazione, cellule seminate attraverso la trachea automaticamente saranno diretto alle sementi ai lobi sinistro. Può essere testato prima della semina delle cellule di coltura che spinge attraverso la trachea. Nel modello metastatico, i media si sposterà i lobi sinistro solo, che si gonfiano, e non i lobi destro10.</li>
	<li>Impostare una siringa da 20 mL Luer lock in cima la cannula trachea e aggiungere le cellule di cancro del polmone ATCC (A549, H1299) in 50 mL di RPMI1640 completa di coltura (Figura 2F).</li>
	<li>Eseguire la semina nella biosicurezza di cellulare. Aggiungere 15 mL di cellule nella siringa e farlo passare attraverso i lobi del polmone dalla forza di gravità. Aggiungere il resto delle cellule prima che eventuali bolle d'aria di passare attraverso.</li>
	<li>Nella semina del polmone acellulare, raccogliere i media irrorati colano in bottiglia bioreattore e farlo passare attraverso la trachea nuovamente 3x. Nota: I media irrorato ha a volte le cellule tumorali senza semi. Pertanto, per il seeding efficiente, rimettere i media nella trachea attraverso la siringa.</li>
	<li>Una volta seminato, rimuovere la siringa, aspettare 15 minuti, aggiungere media fresco e tornare il bioreattore in un'incubatrice. Rimuovere eventuali bolle d'aria nel tubo.</li>
	<li>Avviare la pompa per irrorare i media a 6 mL/min.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+Statistics,+2017.">Cancer Statistics, 2017.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 67 (1), 7-30 (2017).</li><li>Torre, L. A., Siegel, R. L., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+Cancer+Statistics.">Lung Cancer Statistics.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 893, 1-19 (2016).</li><li>Lallo, A., Schenk, M. W., Frese, K. K., Blackhall, F., Dive, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+cells+and+CDX+models+as+a+tool+for+preclinical+drug+development.">Circulating tumor cells and CDX models as a tool for preclinical drug development.</a> Translational Lung Cancer Research. 6 (4), 397-408 (2017).</li><li>Yang, S., Zhang, J. J., Huang, X. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+for+tumor+metastasis.">Mouse models for tumor metastasis.</a> Methods in Molecular Biology. 928, 221-228 (2012).</li><li>Bissell, M. J., Hines, W. 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K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+lung+cancer+cells+grown+in+an+ex+vivo+3D+lung+model+produce+matrix+metalloproteinases+not+produced+in+2D+culture.">Human lung cancer cells grown in an ex vivo 3D lung model produce matrix metalloproteinases not produced in 2D culture.</a> PloS One. 7 (9), e45308 (2012).</li><li>Vishnoi, M., Mishra, D. K., Thrall, M. J., Kurie, J. M., Kim, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+cells+from+a+4-dimensional+lung+cancer+model+are+resistant+to+cisplatin.">Circulating tumor cells from a 4-dimensional lung cancer model are resistant to cisplatin.</a> The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 148 (3), 1056-1063 (2014).</li><li>Mishra, D. 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K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+lung+cancer+cells+grown+on+acellular+rat+lung+matrix+create+perfusable+tumor+nodules.">Human lung cancer cells grown on acellular rat lung matrix create perfusable tumor nodules.</a> The Annals of Thoracic Surgery. 93 (4), 1075-1081 (2012).</li><li>Pence, K. A., Mishra, D. K., Thrall, M., Dave, B., Kim, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+cancer+cells+form+primary+tumors+on+ex+vivo+four-dimensional+lung+model.">Breast cancer cells form primary tumors on ex vivo four-dimensional lung model.</a> Journal of Surgical Research. 210, 181-187 (2017).</li><li>Mishra, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Lung+Fibroblasts+Inhibit+Non-Small+Cell+Lung+Cancer+Metastasis+in+Ex+Vivo+4D+Model.">Human Lung Fibroblasts Inhibit Non-Small Cell Lung Cancer Metastasis in Ex Vivo 4D Model.</a> The Annals of Thoracic Surgery. 100 (4), 1167-1174 (2015).</li><li>Mishra, D. K., Miller, R. A., Pence, K. A., Kim, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+cell+and+non+small+cell+lung+cancer+form+metastasis+on+cellular+4D+lung+model.">Small cell and non small cell lung cancer form metastasis on cellular 4D lung model.</a> BMC Cancer. 18 (1), 441 (2018).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Il polmone di 4D ex vivo fornisce un'opportunità per studiare la crescita del tumore e metastasi in un setup del laboratorio. Una matrice di polmone nativo è un sistema complesso che fornisce il supporto al tessuto normale e mantiene le interazioni cellula-cellula, interazioni cellula-matrice, differenziazione cellulare e organizzazione del tessuto. Fornisce l'opportunità di aggiungere qualsiasi componente del microambiente del tumore per studiare gli effetti sulla crescita del tumore e l'interazione con altr...

Metastasi del cancro è il colpevole dietro la maggior parte delle morti legate al cancro e la sfida finale nel tentativo di combattere il cancro. L'obiettivo generale di questo metodo è quello di progettare un protocollo per una coltura quadridimensionale (4D) cellulare che ha una dimensione di flusso, oltre alla crescita di cellula tridimensionale (3D). Rappresenta le tre fasi del processo di metastasi [cioè, il tumore primario, fare circolare le cellule del tumore (CTCs) e le lesioni metastatiche].
Negli ultimi tre decenni, gli scienziati di tutto il mondo hanno reso un'ineguagliabile ricchezza di informazioni per comprendere i meccanismi alla base della progressione metastatica in diversi tipi di cancro che ha migliorato la prospettiva di una cura o la sopravvivenza libera da progressione. La gestione clinica di alcuni tumori, come il cancro al seno, è migliorato significativamente1; Tuttavia, alcuni tipi di cancro, come il cancro del polmone, hanno ancora una scarsa sopravvivenza2. Modelli animali in vitro e in vivo sono stati strumentali nel generare nuove visioni dei meccanismi che sottendono lo sviluppo della malattia. Negli ultimi anni, cella linea-derivato xenotrapianti (CDX) e paziente-derivato xenotrapianti (PDX) sono stati di maggiore interesse come conservano molte caratteristiche rilevanti del tumore umano primario3, come la cinetica di crescita, le caratteristiche istologiche, comportamentale caratteristiche e la risposta alla terapia. Tuttavia, ogni modello ha i suoi limiti per comprendere il meccanismo di formazione di CTC e la metastasi ad un organo distante4,5,6.
Recentemente, abbiamo sviluppato un modello di cancro del polmone 4D ex vivo utilizzando il concetto di organo reengineering e coltura cellulare basato su aspersione. Imita la crescita del cancro del polmone umano formando noduli del tumore perfusable che crescono nel tempo con un essere umano simile cancro-secernuto proteina produzione7. Rappresenta la firma di espressione genica che predice la sopravvivenza difficile in pazienti con cancro e Mostra una risposta terapeutica di regressione del tumore su cisplatino trattamento8,9. Il modello del polmone è stato ulteriormente modificato in modo che può formare le lesioni metastatiche. Il CTCs sviluppare da un tumore primario e intravasate nel sistema vascolare e importante nel polmone controlaterale per formare le lesioni metastatiche10. Studi di espressione genica suggeriscono un profilo di espressione distinta del tumore primario, il CTCs e le lesioni metastatiche e il upregulation del sottoinsieme dei geni richiesti per il fenotipo10. Questo processo metastatico si verifica a causa della presenza di condizioni biologiche visto in pazienti con cancro. Il vantaggio di questo modello è la presenza di una matrice naturale e architettura e una perfusione di nutrienti che porta alla formazione di noduli del tumore. Inoltre, fornisce anche l'opportunità di studiare gli effetti delle diverse componenti del microambiente tumorale o farmaci sulla progressione del tumore nel tempo. Questo modello può essere utilizzato per crescere una gamma di cellule tumorali (cancro al polmone, cancro al seno, sarcoma ecc.) in un set-up di laboratorio.

<table><tbody><tr><td>Sprague Dowley rat</td><td>Harlan</td><td>206M</td><td>Male</td></tr><tr><td>Chlorhexidine swab</td><td>Prevantics, NY, USA</td><td>NDC 10819-1080-1</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sagent Pharmaceuticals, Schaumburg, IL, USA</td><td>NDC 25021-400-10</td><td></td></tr><tr><td>18-gauge needle</td><td>McMaster Carr, USA</td><td>75165A249</td><td></td></tr><tr><td>2-0 silk tie</td><td>Ethicon, San Angelo, TX, USA</td><td>A305H</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S pump</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>EW-07554-80</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S pump head</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>EW-07519-05</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S pump cartridge</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>EW-07519-70</td><td></td></tr><tr><td>Tygon Tube</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>14171211</td><td></td></tr><tr><td>MasterFlex Pump tube</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>06598-16</td><td></td></tr><tr><td>Female luer lock connectors</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>45508-34</td><td>75165A249</td></tr><tr><td>Male luer lock connectors</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>45513-04</td><td></td></tr><tr><td>black nylon ring</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>EW-45509-04</td><td></td></tr><tr><td>Intravenous set</td><td>CareFusion</td><td>41134E</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>CAS151-21-3</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-1L</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotics</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>Silicone oxygenator</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>ABW00011</td><td>Saint-GoBain-</td></tr><tr><td>Wire mesh</td><td>1164610105</td><td>Lowes</td><td>New York Wire</td></tr><tr><td>Female luer Lug Style TEE</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>45508-56</td><td></td></tr><tr><td>Male luer integral lock ring to 200series Barb</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>45518-08</td><td></td></tr><tr><td>Female luer thread style coupler</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>45508-22</td><td></td></tr><tr><td>Clave connector</td><td>ICU Medical</td><td>11956</td><td></td></tr><tr><td>Hi-Flo &amp;trade;4-way Stopcock w/swivel male luer lock</td><td>smith Medical</td><td>MX9341L</td><td></td></tr><tr><td>MasterFlex Pump tube</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>06598-13</td><td>for cannula</td></tr></tbody></table>

acellular and cellular lung model to study tumor metastasis

È difficile isolare le cellule del tumore in diversi punti della progressione del tumore. Abbiamo creato un ex vivo modello del polmone che può mostrare l'interazione delle cellule del tumore con una matrice naturale e continuo flusso di sostanze nutritive, così come un modello che mostra l'interazione delle cellule del tumore con componenti cellulari normali e una matrice naturale. Isolando un blocco cuore-polmoni del ratto e rimuovendo tutte le celle utilizzando il processo di decellularizzazione viene creato il modello di polmone acellulare ex vivo . Il bronco principale destro è legato al largo e le cellule del tumore sono collocate nella trachea di una siringa. Le cellule muovono e popolano il polmone di sinistra. Il polmone viene poi collocato in un bioreattore dove l'arteria polmonare riceve un flusso continuo di media in un circuito chiuso. Il tumore cresciuto il polmone di sinistra è il tumore primario. Le cellule del tumore che sono isolate nei mezzi circolanti sono in circolazione le cellule del tumore e le cellule del tumore nel polmone di destra sono lesioni metastatiche. Saltando il processo di decellularizzazione viene creato il modello di polmone cellulare ex vivo . Ogni modello consente di rispondere alle domande di ricerca differenti.

Il polmone raccolto da rat mantiene intatto sistema vascolare e gli alveoli11 (Figura 3A e 3B). Al momento di decellularizzazione, i componenti della matrice extracellulare di un polmone acellulare, quali collagene, fibronectina ed elastina, sono conservati11 (Figura 3, 3D, 3Ee 3F). Il decellularizzazione conduce ad...

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Acellular and Cellular Lung Model to Study Tumor Metastasis

Modello del polmone acellulare e cellulari per lo studio di metastasi del tumore

Qui, presentiamo un protocollo per un ex vivo del polmone cancro modello che imita le fasi della progressione del tumore e aiuta a isolare un tumore primario, fare circolare le cellule del tumore e le lesioni metastatiche.

It is difficult to isolate tumor cells at different points of tumor progression. We created an ex vivo lung model that can show the interaction of tumor ...

acellular-and-cellular-lung-model-to-study-tumor-metastasis

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Cancer Research

7.5K Views.  Houston Methodist Hospital Research Institute. Qui, presentiamo un protocollo per un ex vivo del polmone cancro modello che imita le fasi della progressione del tumore e aiuta a isolare un tumore primario, fare circolare le cellule del tumore e le lesioni metastatiche.

Video: Acellular and Cellular Lung Model to Study Tumor Metastasis

Lung Tumor Cell Recruitment Assay

To investigate the molecular mechanisms governing tumor metastasis, various assays using the mouse as a model animal have been proposed. Here, we demonstrate a simple assay to evaluate tumor cell extravasation or micrometastasis. In this assay, tumor cells were injected through the tail vein, and after a short period, the lungs were dissected and digested to count the accumulated labeled tumor cells. This assay skips the initial step of primary tumor invasion into the blood vessel and facilitates the study of events in the distant organ where tumor metastasis occurs. The number of cells injected into the blood vessel can be optimized to observe a limited number of metastases. It has been reported that stromal cells in the distant organ contribute to metastasis. Thus, this assay could be a useful tool to explore potential therapeutic drugs or devices for prevention of tumor metastasis.

This manuscript describes a method to quantify tumor cell accumulation in the lungs in an animal model of tumor metastasis.

Analisi di reclutamento delle cellule di tumore del polmone

To investigate the molecular mechanisms governing tumor metastasis, various assays using the mouse as a model animal have been proposed. Here, we ...

Ricerca

Ricerca sul cancro

Advanced Animal Model of Colorectal Metastasis in Liver: Imaging Techniques and Properties of Metastatic Clones

Patients with a limited number of hepatic metastases and slow rates of progression can be successfully treated with local treatment approaches1,2. However, little is known about the heterogeneity of liver metastases, and animal models capable of evaluating the development of individual metastatic colonies are needed. Here, we present an advanced model of hepatic metastases that provides the ability to quantitatively visualize the development of individual tumor clones in the liver and estimate their growth kinetics and colonization efficiency. We generated a panel of monoclonal derivatives of HCT116 human colorectal cancer cells stably labeled with luciferase and tdTomato and possessing different growth properties. With a splenic injection followed by a splenectomy, the majority of these clones are able to generate hepatic metastases, but with different frequencies of colonization and varying growth rates. Using the In Vivo&#160;Imaging System (IVIS), it is possible to visualize and quantify metastasis development with in vivo luminescent and ex vivo fluorescent imaging. In addition, Diffuse Luminescent Imaging Tomography (DLIT) provides a 3D distribution of liver metastases in vivo. Ex vivo fluorescent imaging of harvested livers provides quantitative measurements of individual hepatic metastatic colonies, allowing for the evaluation of the frequency of liver colonization and the growth kinetics of metastases. Since the model is similar to clinically observed liver metastases, it can serve as a modality for detecting genes associated with liver metastasis and for testing potential ablative or adjuvant treatments for liver metastatic disease.

The ability of metastatic clones to colonize distant sites depends on their proliferation capacity and/or their ability to survive in the host microenvironment without significant proliferation. Here, we present an animal model that allows quantitative visualization of both types of liver colonization by metastatic clones.

Avanzato modello animale di colorettale Metastasi nel fegato: tecniche di imaging e di proprietà di metastatici cloni

Patients with a limited number of hepatic metastases and slow rates of progression can be successfully treated with local treatment approaches1,2. ...

Experimental Metastasis and CTL Adoptive Transfer Immunotherapy Mouse Model

Experimental metastasis mouse model is a simple and yet physiologically relevant metastasis model. The tumor cells are injected intravenously (i.v) into mouse tail veins and colonize in the lungs, thereby, resembling the last steps of tumor cell spontaneous metastasis: survival in the circulation, extravasation and colonization in the distal organs. From a therapeutic point of view, the experimental metastasis model is the simplest and ideal model since the target of therapies is often the end point of metastasis: established metastatic tumor in the distal organ. In this model, tumor cells are injected i.v into mouse tail veins and allowed to colonize and grow in the lungs. Tumor-specific CTLs are then injected i.v into the metastases-bearing mouse. The number and size of the lung metastases can be controlled by the number of tumor cells to be injected and the time of tumor growth. Therefore, various stages of metastasis, from minimal metastasis to extensive metastasis, can be modeled. Lung metastases are analyzed by inflation with ink, thus allowing easier visual observation and quantification.

An experimental lung metastasis and CTL immunotherapy mouse model for analysis of tumor cells-T cell interaction in vivo.

Metastasi sperimentale e CTL adottivi Immunoterapia modello di trasferimento del mouse

Experimental metastasis mouse model is a simple and yet physiologically relevant metastasis model. The tumor cells are injected intravenously (i.v) into ...

Immunologia e infezioni

Practical Considerations in Studying Metastatic Lung Colonization in Osteosarcoma Using the Pulmonary Metastasis Assay

The pulmonary metastasis assay (PuMA) is an ex vivo lung explant and closed cell culture system that permits researchers to study the biology of lung colonization in osteosarcoma (OS) by fluorescence microscopy. This article provides a detailed description of the protocol, and discusses examples of obtaining image data on metastatic growth using widefield or confocal fluorescence microscopy platforms. The flexibility of the PuMA model permits researchers to study not only the growth of OS cells in the lung microenvironment, but also to assess the effects of anti-metastatic therapeutics over time. Confocal microscopy allows for unprecedented, high-resolution imaging of OS cell interactions with the lung parenchyma. Moreover, when the PuMA model is combined with fluorescent dyes or fluorescent protein genetic reporters, researchers can study the lung microenvironment, cellular and subcellular structures, gene function, and promoter activity in metastatic OS cells. The PuMA model provides a new tool for osteosarcoma researchers to discover new metastasis biology and assess the activity of novel anti-metastatic, targeted therapies.

The goal of this article is to provide a detailed description of the protocol for the pulmonary metastasis assay (PuMA). This model permits researchers to study metastatic osteosarcoma (OS) cell growth in lung tissue using a widefield fluorescence or confocal laser-scanning microscope.

Considerazioni pratiche nello studio di colonizzazione del polmone metastatico nell'Osteosarcoma usando l'analisi di metastasi polmonare

The pulmonary metastasis assay (PuMA) is an ex vivo lung explant and closed cell culture system that permits researchers to study the biology of lung ...

The Establishment of a Lung Colonization Assay for Circulating Tumor Cell Visualization in Lung Tissues

Metastasis is the major cause of cancer death. The role of circulating tumor cells (CTCs) in promoting cancer metastasis, in which lung colonization by CTCs critically contributes to early lung metastatic processes, has been vigorously investigated. As such, animal models are the only approach that captures the full systemic process of metastasis. Given that problems occur in previous experimental designs for examining the contributions of CTCs to blood vessel extravasation, we established an in vivo lung colonization assay in which a long-term-fluorescence cell-tracer, carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE), was used to label suspended tumor cells and lung perfusion was performed to clear non-specifically trapped CTCs prior to lung removal, confocal imaging, and quantification. Polymeric fibronectin (polyFN) assembled on CTC surfaces has been found to mediate lung colonization in the final establishment of metastatic tumor tissues. Here, to specifically test the requirement of polyFN assembly on CTCs for lung colonization and extravasation, we performed short term lung colonization assays in which suspended Lewis lung carcinoma cells (LLCs) stably expressing FN-shRNA (shFN) or scramble-shRNA (shScr) and pre-labeled with 20 &#956;M of CFSE were intravenously inoculated into C57BL/6 mice. We successfully demonstrated that the abilities of shFN LLC cells to colonize the mouse lungs were significantly diminished in comparison to shScr LLC cells. Therefore, this short-term methodology may be widely applied to specifically demonstrate the ability of CTCs within the circulation to colonize the lungs.

An animal model is needed to decipher the role of circulating tumor cells (CTCs) in promoting lung colonization during cancer metastasis. Here, we established and successfully performed an in vivo assay to specifically test the requirement of polymeric fibronectin (polyFN) assembly on CTCs for lung colonization.

L'istituzione di un'analisi di colonizzazione del polmone per la visualizzazione di cellule del tumore nei tessuti polmonari di circolazione

Metastasis is the major cause of cancer death. The role of circulating tumor cells (CTCs) in promoting cancer metastasis, in which lung colonization by ...

Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs

Metastasis is the main cause of cancer-related deaths and there are limited therapeutic options for patients with metastatic disease. The identification and testing of novel therapeutic targets that will facilitate the development of better treatments for metastatic disease requires preclinical in vivo models. Demonstrated here is a syngeneic mouse model for assaying breast cancer metastatic colonization and subsequent growth. Metastatic cancer cells are stably transduced with viral vectors encoding firefly luciferase and ZsGreen proteins. Candidate genes are then stably manipulated in luciferase/ZsGreen-expressing cancer cells and then the cells are injected into mice via the lateral tail vein to assay metastatic colonization and growth. An in vivo imaging device is then used to measure the bioluminescence or fluorescence of the tumor cells in the living animals to quantify changes in metastatic burden over time. The expression of the fluorescent protein allows the number and size of metastases in the lungs to be quantified at the end of the experiment without the need for sectioning or histological staining. This approach offers a relatively quick and easy way to test the role of candidate genes in metastatic colonization and growth, and provides a great deal more information than traditional tail vein metastasis assays. Using this approach, we show that simultaneous knockdown of Yes associated protein (YAP) and transcriptional co-activator with a PDZ-binding motif (TAZ) in breast cancer cells leads to reduced metastatic burden in the lungs and that this reduced burden is the result of significantly impaired metastatic colonization and reduced growth of metastases.

The described approach combines experimental tail vein metastasis assays with in vivo live animal imaging to allow real-time monitoring of breast cancer metastasis formation and growth in addition to the quantification of metastasis number and size in the lungs.

Uso combinato dei saggi di metastasi della vena della coda e dell'imaging in vivo in tempo reale per quantificare la colonizzazione metastatica del cancro al seno e il carico nei polmoni

Metastasis is the main cause of cancer-related deaths and there are limited therapeutic options for patients with metastatic disease. The identification ...

Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous metastasis models are available. Thus, the experimental metastasis model involving tail-vein injection of suitable cell lines is a mainstay of metastasis research. When cancer cells are injected into the lateral tail-vein, the lung is their preferred site of colonization. A potential limitation of this technique is the accurate quantification of the metastatic lung tumor burden. While some investigators count macrometastases of a pre-defined size and/or include micrometastases following sectioning of tissue, others determine the area of metastatic lesions relative to normal tissue area. Both of these quantification methods can be exceedingly difficult when the metastatic burden is high. Herein, we demonstrate an intravenous injection model of lung metastasis followed by an advanced method for quantifying metastatic tumor burden using image analysis software. This process allows for investigation of multiple end-point parameters, including average metastasis size, total number of metastases, and total metastasis area, to provide a comprehensive analysis. Furthermore, this method has been reviewed by a veterinary pathologist board-certified by the American College of Veterinary Pathologists (SEK) to ensure accuracy.

Intravenous injection of cancer cells is often used in metastasis research, but the metastatic tumor burden can be difficult to analyze. Herein, we demonstrate a tail-vein injection model of metastasis and include a novel approach to analyze the resulting metastatic lung tumor burden.

Analisi patologica delle metastasi polmonari a seguito di iniezione laterale della vena della coda di cellule tumorali

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous ...

A Permanent Window for Investigating Cancer Metastasis to the Lung

Metastasis, accounting for ~90% of cancer-related mortality, involves the systemic spread of cancer cells from primary tumors to secondary sites such as the bone, brain, and lung. Although extensively studied, the mechanistic details of this process remain poorly understood. While common imaging modalities, including computed tomography (CT), positron emission tomography (PET), and magnetic resonance imaging (MRI), offer varying degrees of gross visualization, each lacks the temporal and spatial resolution necessary to detect the dynamics of individual tumor cells. To address this, numerous techniques have been described for intravital imaging of common metastatic sites. Of these sites, the lung has proven especially challenging to access for intravital imaging owing to its delicacy and critical role in sustaining life. Although several approaches have previously been described for single-cell intravital imaging of the intact lung, all involve highly invasive and terminal procedures, limiting the maximum possible imaging duration to 6-12 h. Described here is an improved technique for the permanent implantation of a minimally invasive thoracic optical Window for High-Resolution Imaging of the Lung (WHRIL). Combined with an adapted approach to microcartography, the innovative optical window facilitates serial intravital imaging of the intact lung at single-cell resolution across multiple imaging sessions and spanning multiple weeks. Given the unprecedented duration of time over which imaging data can be gathered, the WHRIL can facilitate the accelerated discovery of the dynamic mechanisms underlying metastatic progression and numerous additional biologic processes within the lung.

Here, we present a protocol for the surgical implantation of a permanently indwelling optical window for the murine thorax, which enables high-resolution, intravital imaging of the lung. The permanence of the window makes it well-suited to the study of dynamic cellular processes in the lung, especially those that are slowly evolving, such as metastatic progression of disseminated tumor cells.

Una finestra permanente per indagare sulle metastasi del cancro al polmone

Metastasis, accounting for ~90% of cancer-related mortality, involves the systemic spread of cancer cells from primary tumors to secondary sites such as ...

In Vivo Imaging to Measure Spontaneous Lung Metastasis of Orthotopically-injected Breast Tumor Cells

Metastasis remains the primary cause of cancer-related death. The succession of events that characterize the metastatic cascade presents multiple opportunities for therapeutic intervention, and the ability to accurately model them in mice is critical to evaluate their effects. Here, a step-by-step protocol is presented for the establishment of orthotopic primary breast tumors and the subsequent monitoring of the establishment and growth of metastatic lesions in the lung using in vivo bioluminescence imaging. This methodology allows for the evaluation of treatment or its biological effects along the entire range of metastatic development, from primary tumor escape to outgrowth in the lungs. Breast orthotopic tumors are generated in mice via injection of a luciferase-labeled cell suspension in the 4th mammary gland. Tumors are allowed to grow and disseminate for a specific amount of time and are then surgically resected. Upon resection, spontaneous lung metastasis is detected, and the growth over time is monitored using in vivo bioluminescence imaging. At the desired experimental endpoint, lung tissue can be collected for downstream analysis. The treatment of established, clinically evident metastasis is critical to improve outcomes for stage IV cancer patients, and it can be evaluated through tail vein models of experimental lung metastasis. However, metastatic dissemination occurs early in breast cancer, and many patients have latent, subclinical disseminated disease after surgery. Utilization of spontaneous models such as this one provides the opportunity to study the whole spectrum of the disease, especially the systemic effects driven by treatment of the primary tumor such as pre-metastatic niche priming, and evaluate treatments on dormant and subclinical disease after surgery.

<meta charset="utf8"></head><body>Imaging in vivo per misurare le metastasi polmonari spontanee di cellule tumorali mammarie iniettate ortotopicamente

The manuscript describes a methodology for the establishment as well as longitudinal growth monitoring of spontaneous lung metastasis from orthotopically-injected breast tumors, amenable to intervention at all stages of the metastatic cascade.