Il nostro protocollo può essere utilizzato per testare rapidamente e facilmente il ruolo di qualsiasi gene candidato nella colonizzazione metastatica e nella crescita. Il protocollo consente anche il monitoraggio in tempo reale della metastasi, della formazione e della crescita, nonché la quantificazione del numero e delle dimensioni della metastasi negli stessi animali senza la necessità di resezione o colorazione istologica. Placca quattro celle T1 a 150.000 cellule per pozzo in una piastra da 12 po 'in un supporto di crescita completo.
Incubare a 37 gradi Celsius 5% di anidride carbonica durante la notte. Il giorno dopo, aspira i mezzi di crescita dalle cellule. Aggiungere 500 microlitri di supernatante virale luciferasi e 500 microlitri di proteina fluorescente supernatante virale per infettare simultaneamente le cellule con i supernatanti virali della luciferasi e della proteina fluorescente.
Quindi, aggiungere un microlitro di otto milligrammi per bromuro di esadimetrina millilitro e incubare a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per 24-48 ore. Tripinare le quattro cellule T1 con 500 microlitri di tripina. Dopo due o cinque minuti, trasferire tutte le cellule su un piatto di sei centimetri in quattro millilitri di mezzi di selezione, spegnendo così la tripina.
Al termine della selezione, confermare che le quattro cellule T1 infette esprimono la proteina fluorescente ZsGreen utilizzando un microscopio fluorescente invertito a 50-100 volte l'ingrandimento. Confermare inoltre che le quattro cellule T1 infette esprimono luciferasi utilizzando un kit di attività luciferasi disponibile in commercio. Procedere all'ottimizzazione del progetto sperimentale in vivo come descritto nel protocollo di testo.
Aspirare il supporto e sciacquare le piastre cellulari con 1X PBS. Tripinare le cellule con cinque millilitri di tripside per piastra di 15 centimetri per due o cinque minuti e trasferire tutte le cellule in un tubo conico. Lavare le cellule rimanenti dal piatto di coltura tissutale con mezzi di crescita completi sufficienti per temprare la tripina.
Aggiungere il lavaggio allo stesso tubo conico. Contare le celle utilizzando un contatore di celle automatico per determinare il numero di cella totale. Quindi, centrifugare le cellule a 122 volte G per tre minuti e aspirare il supernatante.
Sospendere di nuovo le celle in 1X PBS alla concentrazione desiderata. Qui, 25.000 cellule vengono iniettate in ogni topo e 100 microlitri di PBS. Quindi le cellule ri-sospese sono a 250.000 cellule per millilitro.
Mantenere le sospensioni cellulari sul ghiaccio fino all'iniezione. Lavorando in un cappuccio presso la struttura animale, mescolare delicatamente ma accuratamente le cellule invertendo il tubo o usando una siringa millilitro per assicurarsi che siano uniformemente sospese. Ora, carica una siringa Luer Lock da un millilitro con la sospensione cellulare ed espello le bolle d'aria in eccesso.
Posizionare un ago calibro 30 da mezzo pollice sulla siringa con la smussatura ed espellere le bolle d'aria. Posizionare delicatamente il mouse in un limitatore di roditori. La vena laterale della coda dovrebbe essere visibile e dilatata.
In caso meno, pizzicare delicatamente la base della coda e immergere la coda in acqua calda del rubinetto per dilatare le vene. Utilizzare una salvietta alcolica per pulire la coda, quindi inserire l'ago nella vena della coda, smussare lateralmente e iniettare 100 microlitri di sospensione cellulare. Se l'ago è inserito correttamente nella vena, dovrebbe facilmente scivolare leggermente in avanti e indietro e non dovrebbe esserci resistenza quando lo stantuffo viene spinto.
Le iniezioni di successo dovrebbero anche comportare un lavaggio in cui il colore blu della vena diventa bianco per alcuni secondi dopo l'iniezione. Rimuovere lentamente l'ago e, utilizzando una garza sterile, applicare pressione sul sito di iniezione per fermare qualsiasi sanguinamento. Riportare il mouse nella gabbia e monitorare per 15 minuti per garantire il pieno recupero.
Accendi il dispositivo di imaging animale vivo in vivo, apri il software di immagine e accedi. Fare clic sul pulsante di inizializzazione e attendere l'inizializzazione del computer. Modificare il campo visivo in D.Per il primo utilizzo, modificare le impostazioni di esposizione facendo clic su modifica, preferenze, acquisizione ed esposizione automatica.
Modificare il tempo massimo di esposizione da 60 secondi a 300 secondi predefiniti e fare clic su OK. Caricare una siringa da un millilitro con D-luciferina, quindi aggiungere un ago calibro 30 da mezzo pollice alla siringa ed espellere le bolle d'aria. Misurare e registrare la massa di un mouse anestetizzato.
Trattenere il mouse pizzicando la tracolla del collo usando il pollice e le dita del puntatore e afferrando la coda tra il mignolo e la base della mano. Invertire il mouse con un angolo di 45 gradi con la testa rivolta verso il basso. Inserire l'ago, smussare lateralmente verso l'alto, nello spazio IP sinistro del mouse.
Confermare l'ingresso nello spazio IP disegnando un piccolo volume. Non dovrebbe esserci colore alla base dell'ago quando si disegna di nuovo nello spazio IP. Iniettare il volume appropriato di D-luciferina per una dose di 150 milligrammi per chilogrammo.
Immediatamente dopo l'amministrazione della D-luciferina, avviare un timer. Posizionare il mouse piatto sulla schiena nel dispositivo di imaging con il naso nel cono del naso e assicurarsi che venga somministrato un isoflurane da metà a due punti e mezzo per cento. Fare clic sulle caselle luminescenti e fotografie.
Modificare il tempo di esposizione in automatico e quindi fare clic su acquisisci nel pannello di controllo di acquisizione. Dopo l'imaging, riportare il mouse nella gabbia e monitorare per 15 minuti per garantire il pieno recupero. Dopo l'eutanasia, come descritto nel protocollo di testo, isolare e rimuovere i polmoni da ogni topo e risciacquare in 1X PBS per rimuovere il sangue in eccesso.
Acquisire immagini di metastasi ZsGreen nei lobi a 10X a Brightfield e fluorescenza utilizzando uno stereoscopio fluorescente con un filtro a banda larga GFP. Utilizzare il software di analisi delle immagini per quantificare le dimensioni e il numero di metastasi dalle immagini. Per elaborare e analizzare i dati delle immagini acquisite con il dispositivo di imaging animale vivo in vivo, aprire tutti i file di immagine per ogni mouse nel software di immagine.
Assicurarsi che le unità siano in luminosità per i dati bioluminescenti e l'efficienza per i dati fluorescenti facendo clic sulla freccia in alto a sinistra della finestra dell'immagine e cambiandola nell'unità appropriata. Usa l'immagine dall'ultimo punto di tempo per creare un'area di interesse, o ROI, facendo prima clic su Strumenti ROI nella finestra della tavolozza degli strumenti. Quindi, inserire un ROI facendo clic sulla freccia e selezionandone uno.
Fare clic sul bordo del ROI e spostarlo sul petto del mouse. Regolare le dimensioni del ROI in modo che copra il torace del mouse e non escluda il segnale. Quindi, fare clic su Misura ROM e copiare o digitare il numero non elaborati in un foglio di Excel.
Tracciare e analizzare i dati come descritto nel protocollo di testo. Fare clic con il pulsante destro del mouse nel file di immagine per copiare il ROI, quindi incollarlo nei file di immagine dagli altri punti di tempo e fare clic su misura ROI. Il vettore retrovirale che esprime shRNA basati su tandem miR-30 rivolti sia a YAP che a TAZ riduce l'espressione yap e la tassare l'espressione proteica e l'attività trascrizionale in quattro cellule T1.
Quattro cellule di luciferasi T1 sono state trasmissibili stabilmente con una versione zsgreen che esprimeva questo vettore shRNA YAP/TAZ tandem o un shRNA controllato basato su miR-30. Le immagini bioluminescenti mostrano che la velocità con cui il carico metastatico è aumentato è stata significativamente più veloce nei topi iniettati con cellule di controllo rispetto ai topi iniettati con cellule knockdown YAP / TAZ. Un grafico del segnale luciferasi trasformato log10 misurato per ogni mouse nel corso dell'esperimento mostra anche che la velocità era più veloce nei topi iniettati con le cellule di controllo rispetto ai topi iniettati con cellule knockdown YAP / TAZ.
Significativamente meno metastasi formate nei topi iniettati con le cellule di abbattimento YAP / TAZ rispetto ai topi con cellule di controllo se contate manualmente. La stessa tendenza è stata osservata quando si utilizza il software di analisi delle immagini. Non solo si formavano molte più metastasi nei topi di controllo, ma erano generalmente più grandi.
Costantemente, anche il carico metastatico nei polmoni è stato drasticamente ridotto dal knockdown YAP /TAZ. Un'iniezione riuscita di un numero uguale di cellule sane in ogni mouse è fondamentale per garantire dati di alta qualità. Ricordarsi di usare cautela e seguire le linee guida di sicurezza quando si lavora con retrovirus infettivi e lentivirus, in particolare se i virus sono infettivi per l'uomo.
Questa tecnica ci ha permesso di illustrare i ruoli dei geni candidati e della colonizzazione e crescita metastatica, fornendo un modo per identificare e testare nuovi target terapeutici per il trattamento della malattia metastatica. Seguendo questa procedura, le metastasi contenenti polmoni possono essere ulteriormente analizzate mediante colorazione immunofluorescente o istologica per indagare come il gene alterato sta influenzando le metastasi e identificare altre proteine che possono essere coinvolte.
