Name: acellular and cellular lung model to study tumor metastasis
Uploaded: 2018-08-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
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Min P. Kim recebeu apoio de concessão o segundo John W. Kirklin bolsa de pesquisa, associação americana para torácica cirurgia, Graham Research Foundation, Houston Metodista especialidade médico grupo Grant e Michael M. e Joann H. Cone Research Award. Agradecemos a Ann Saikin para o idioma de edição do manuscrito.

Protocolos para experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê de uso no Instituto de pesquisa de Metodista de Houston e institucional Cuidado Animal e efectuados em conformidade com todos os regulamentos, leis, diretrizes e políticas.
1. colheita de pulmão do rato
<ol><li>Anestesia um rato Sprague-Dawley masculino de 4 a 6 semanas de idade por uma injeção intraperitoneal de (IP) da cetamina (100 mg/kg) e xilazina (10mg/kg) em seu flanco. Certifique-se de anestesia, verificando-se uma ausência de movimento quando o dedo do pé do membro posterior é comprimido com fórceps.</li>
	<li>Depois de 10 min, depilar o peito e abdômen e limpe a pele com um cotonete de clorexidina.</li>
	<li>Retire a pele por pegá-la com a pinça e por isso incisão com um bisturi descartável. Após a abertura da cavidade torácica por incisão com bisturi, realizar uma toracotomia bilateral por um corte do lado anterior da caixa torácica à esquerda e à direita do diafragma com uma tesoura. Nota: Esta é uma cirurgia não-sobrevivência.</li>
	<li>Sustenha a caixa torácica e injetar 2 mL de heparina (1 000 unidades/mL) no ventrículo direito do coração batendo usando uma agulha 27G. Nota: Isto impedirá qualquer formação de coágulos de sangue no pulmão.</li>
	<li>Completamente, retire a caixa torácica com uma tesoura e coloque uma agulha de 18 G no ventrículo esquerdo como um respiradouro, até que o sangue sai. Em seguida, injete 15 mL de tampão fosfato soro fisiológico heparinizado (12,5 unidades/mL; heparinizada PBS) do ventrículo direito, usando uma agulha de 25 G.</li>
	<li>Corte o superior e inferior veia cava, duas grandes veias do lado direito do coração e liberar os pulmões com um adicional de 10 mL de PBS heparinizado no ventrículo direito, usando uma agulha 27G. Nota: A veia cava inferior é visualizada sob o fundo do coração como um grande navio cheio de sangue vermelho. Da mesma forma, a veia cava superior é visualizado na parte superior do coração como um grande navio.</li>
	<li>Corte da traqueia na base da tireoide. Remova cuidadosamente a aorta descendente, ao nível da veia hemiazygos e ramificações da aorta no arco.</li>
	<li>Retire o bloco de coração-pulmão da cavidade torácica e o resto do corpo do rato.</li>
	<li>Executar ventriculostomia cortando metade dos ventrículos direito e esquerdos e coloque uma cânula de agulha de aço inoxidável sob medida pré-carregadas 18g através do ventrículo direito para a artéria pulmonar (PA).</li>
	<li>Fixar a cânula com uma gravata de seda 2-0 e expor cuidadosamente o ventrículo direito e o átrio.</li>
	<li>Coloque um anteparo Luer fêmea no ventrículo esquerdo e fixe-a com um laço de seda 2-0.</li>
	<li>Liberar o bloco de coração-pulmão com 20 mL de PBS heparinizada através da cânula de PA e colocá-lo em um tubo de 50 mL contendo meios de cultura ou PBS heparinizada. Nota: Para um modelo de celular, vá para o passo 3.1 para configurar o biorreator. Para um modelo acelular, siga para o passo 2.1 para o decellularization.</li>
</ol>2. pulmão Decellularization
<ol><li>
Preparação da unidade de decellularization
	<ol>
<li>Prepare cada câmara decellularization/bottle, piercing dois furos na tampa de garrafa e encaixe um Luer fêmea nos furos (figura 1A e 1B). Fixe-a com um anel de nylon preto do outro lado. Da mesma forma, faça um único furo na outra tampa de garrafa para o acessório de conjunto por via venosa (Figura 1). Nota: Figura 1A e 1B têm as tampas de garrafa mesmo dos dois lados diferentes. Figura 1 é de um tampão diferente com um único furo, como dito acima, na etapa 2.1.1.</li>
		<li>Anexe um tubo de 0,5 polegadas (na artéria pulmonar ou final do PA) e tubos de 6 polegadas (Figura 1J) para um fêmea Luer de dentro as tampas dos frascos (figura 1A e 1B) e anexar um conector Luer-lock macho nas extremidades. Defina o bloqueio com uma garrafa de 500 mL como a câmara de decellularization/garrafa.</li>
		<li>Conecte uma extremidade de dois tubos de 2 ft (que são conectados com um conector Luer-lock macho) ou extremidades do tubo da bomba (Figura 1-H), que é anexado a cabeça da bomba (Figura 1E e 1F) por um cartucho (Figura 1), com um conector Luer fêmea bloqueio (Figura 1I).</li>
		<li>Ligue as outras extremidades dos pés 2 tubos (da etapa 2.1.3) cada para uma cabeça de bloqueio Luer fêmea na tampa da câmara/frasco de decellularization (Figura 1 L).</li>
		<li>Configurar um 250ml heparinizado garrafa de PBS (com 200 mL de PBS) pendurando um frasco invertido em um carrinho com a extremidade proximal de um conjunto por via venosa (Figura 1) inserido na tampa da garrafa e a extremidade distal, substituir o tubo de 2ft ligado ao c decellularization HAMBER/garrafa no final PA (figura 1B). Este tubo de 2ft Conecte o frasco de descarte. Nota: As garrafas são definidas no cartão, como mostrado na Figura 1 K. Os tubos intravenosos saem as garrafas de suspensão para dispensar os reagentes o andaime do pulmão.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Processo de decellularization de pulmão
	<ol>
<li>Executar a PBS heparinizada sob uma pressão de perfusão fisiológica de 30 mm Hg (Figura 1 K) até que flui livremente na câmara decellularization/garrafa e, em seguida, coloque o coração-pulmão de final através da cânula de PA PA.</li>
		<li>Continua a correr a bomba continuamente, para que qualquer excesso/solução-tampão no interior da câmara de decellularization/garrafa fica descartada.</li>
		<li>Execute a PBS heparinizada através do PA por 15 min a uma pressão de perfusão de 30 mm Hg para a lavagem inicial (Figura 1 K).</li>
		<li>Substitua a garrafa de PBS heparinizada 0,1% Dodecil sulfato de sódio (SDS) em água desionizada e perfundir o pulmão para 2h para o decellularization.</li>
		<li>Após o decellularization, perfundir deionizada esterilizada através do andaime de pulmão por 15 min.</li>
		<li>Em seguida, perfundir 1% de detergente não-iônico em água desionizada para 10 min.</li>
		<li>Substitua a câmara de decellularization/garrafa com 500 mL de PBS autoclavado suplementadas com antibióticos de x 1 (penicilina-estreptomicina anfotericina), mantendo o pulmão de suspensão intacta com a tampa no interior da garrafa.</li>
		<li>Descarte a intravenosa definido, colocar o tubo de 2ft anexado ao contêiner descartando volta para o final de artéria pulmonar da câmara de decellularization e ligar a bomba em 6 mL/min (Figura 1 L).</li>
		<li>Perfundir os pulmões para 72 h e muda a PBS com antibióticos cada 12 h. Nota: O pulmão acelular está pronto para uso imediato. Pode ser armazenado no-80 ˚ c Membros até que seja necessário. Se manchas rosa ou coágulos de sangue pode ser visualizados claramente dos lóbulos pulmonares, descarte o pulmão. É possível testar aleatoriamente para DNA ou histopatologia. Um pulmão completo acelular não mostrará as células e 99,9% do DNA lavagem. Nota: Quando estiver trabalhando com um modelo de celular do pulmão, ignore a decellularization. O pulmão colhido (etapa 1) pode ser definido diretamente no bioreator.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. biorreator set-up
<ol><li>Prepare a garrafa de biorreator e os itens necessários para a instalação.<ol>
<li>Faça três furos em uma tampa de garrafa de 500 mL, a uma distância igual e corrigir um Luer fêmea em todos os três furos, usando anéis de nylon preto (Figura 2A e 2B). Nota: Em dois furos, conector Luer lock termina cara fora, enquanto uma extremidade faces dentro da garrafa.</li>
		<li>Corte um 6 no tubo da bomba, de 2 em tubo, um 6 no tubo, um tubo de 1,5 ft, um tubo de 2 ft e um tubo de oxigenador de 10 pés por biorreator.</li>
		<li>Uma agulha de aço inoxidável de 18 G e, novamente, ligar as extremidades com tubos biocompatíveis para uma cânula traqueal.</li>
		<li>Enrole o tubo oxigenador, com conectores Luer lock nas extremidades, em um engranzamento de fio do solenoide usando fitas de autoclave (Figura 2).</li>
		<li>Autoclave a acima mencionado itens e mantê-los em UV luz por 10 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Configurar a bomba dentro da incubadora de cultura de célula normal (37 ° C, 5% CO2), com espaçamento adequado entre as bandejas para caber facilmente uma garrafa de 500 mL.</li>
	<li>Pulverizar o etanol a 70% no cartucho da bomba e conecte o tubo da bomba com conectores de fêmea Luer lock em ambas as extremidades da bomba.</li>
	<li>Configure o oxigenador enrolado o engranzamento de fio do solenoide dentro da incubadora de cultura celular, conectando-se uma extremidade (vazão) do oxigenador para o tubo da bomba e a outra extremidade com o tubo de 1,5 ft em bioreator.</li>
	<li>Configure a garrafa de biorreator em Biossegurança uma armário com condições assépticas.<ol>
<li>Anexar uma torneira de 3 vias (amarela) à cabeça de um do Luers feminino para controlar o fluxo através de PA.</li>
		<li>Conecte a uma torneira de passagem só de ida (azul) para outro anteparo de bloqueio Luer fêmea para célula propagação através da traqueia (Figura 2F).</li>
		<li>Ligue 2 na tubulação do lado de fora (branco) e 6 na tubagem no interior da garrafa para circular com a mídia para fora. Encaixar um conector Luer-lock macho para um tubo de 2 ft e anexar um estilo de talão Luer fêmea Tee para fornecer acessibilidade para adicionar ou remover qualquer coisa.</li>
		<li>Anexe uma torneira de passagem só de ida para uma das aberturas do conector de três vias (feminino estilo Luer talão Tee).</li>
		<li>Anexe um conector Luer-lock macho e uma fêmea Luer-lock para tubos de 2 ft.</li>
		<li>Adicionar 200 mL de RPMI1640 com 10% FBS e 1% antibióticos meio de cultura celular (varia como pela exigência de célula) e transferir o biorreator para a incubadora. Conecte o tubo oxigenador para as duas extremidades abertas (válvula unidirecional e conector Tee) para torná-lo um biorreator de loop fechado.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pre-funcionar a bomba em 6 mL/min dentro da incubadora de cultura celular com meio de cultura celular para preencher o oxigenador e tubos, para que nenhuma bolha de ar existe no tubo.</li>
	<li>Uma vez que os tubos são preenchidos com mídia, fechar a torneira e retire a garrafa de biorreator a incubadora desconectando os oxigenadores de ambos os lados da garrafa biorreator.</li>
	<li>Coloque a garrafa de biorreator na biossegurança do armário, passar de meios de cultura através da torneira e anexar a cânula de PA de cadafalso pulmão (acelular ou celular) para a válvula de passagem através do conector Luer macho. Nota: Aqui é possível usar o modelo acelular (após o processo de decellularization) ou um bloco de coração-pulmão recém-colhidas (ou seja, o modelo de celular, que mantém as células de rato nativo).</li>
	<li>Passe de meios de cultura, através de uma torneira de passagem só de ida para remover todo o ar e amarre a cânula traqueal por um fio de seda para a traqueia.</li>
	<li>Certifique-se de evitar qualquer torção do PA e traqueia. Fechar a tampa do frasco de biorreator com o pulmão andaime dentro e, novamente, assepticamente transferir o biorreator para a incubadora e ligue a bomba a uma velocidade de 6 mL/min.</li>
	<li>Meios de cultura para 10-15 min certificar-se de executar todos os lóbulos se inflado e o pulmão parece em boa forma (Figura 2).</li>
</ol>4. metástase modelo e propagação de células
Nota: Proceda à semeadura com o modelo de pulmão acima para um estudo de crescimento de tumor primário de célula. Modifica o andaime de pulmão (acelular ou celular) da seguinte forma para o modelo metastático.
<ol><li>Retire o biorreator com o andaime de pulmão da incubadora e colocá-lo na biossegurança do armário.</li>
	<li>Use uma seringa de Luer lock para passar 5 mL de meios de cultura através da traqueia e abra a tampa do biorreator com o enforcamento andaime de pulmão (Figura 2F).</li>
	<li>Neste passo, mais uma pessoa é necessário para ajudar na modificação do pulmão para um modelo metastático.</li>
	<li>Obter seda 2-0 pronto e usar fórceps angular para fazer um passe através da traqueia no ponto de bifurcação.</li>
	<li>Amarre a traqueia para o pulmão direito no ponto de bifurcação e verificar o livre fluxo de mídia através da traqueia para o pulmão esquerdo, passando de meios de cultura. Nota: Uma vez que a traqueia está ligada no ponto de bifurcação, células semeadas através da traqueia serão automaticamente direcionadas para semente para o lóbulo esquerdo. Ele possa ser testado antes da semeadura das células por meios de cultura empurrando através da traqueia. No modelo metastático, a mídia irá mover para os lobos esquerdos apenas, que inflará, e não os lóbulos certo10.</li>
	<li>Definir uma seringa de lock 20ml Luer em cima da cânula traqueal e adicionar células de câncer de pulmão ATCC (A549, H1299) em 50 mL de meios de cultura RPMI1640 completo (Figura 2F).</li>
	<li>Execute a célula semeadura no armário a biossegurança. Adicionar 15 mL de células na seringa e deixá-lo passar os lóbulos pulmonares pela gravidade. Adicione o restante das células antes que quaisquer bolhas de ar passam.</li>
	<li>No pulmão acelular semeadura, recolher a mídia perfundida escorrendo da garrafa de biorreator e deixá-la passar através da traqueia novamente 3x. Nota: A mídia perfundida, às vezes, tem as células cancerosas semeadas. Portanto, para a propagação eficiente, recolocada a mídia na traqueia através da seringa.</li>
	<li>Uma vez semeado, remova a seringa, esperar 15 min, adicionar mídia fresca e retornar o biorreator volta para uma incubadora. Remova quaisquer bolhas de ar na tubulação.</li>
	<li>Ligue a bomba para perfundir os meios de comunicação em 6 mL/min.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+Statistics,+2017.">Cancer Statistics, 2017.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 67 (1), 7-30 (2017).</li><li>Torre, L. A., Siegel, R. L., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+Cancer+Statistics.">Lung Cancer Statistics.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 893, 1-19 (2016).</li><li>Lallo, A., Schenk, M. W., Frese, K. 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K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Lung+Fibroblasts+Inhibit+Non-Small+Cell+Lung+Cancer+Metastasis+in+Ex+Vivo+4D+Model.">Human Lung Fibroblasts Inhibit Non-Small Cell Lung Cancer Metastasis in Ex Vivo 4D Model.</a> The Annals of Thoracic Surgery. 100 (4), 1167-1174 (2015).</li><li>Mishra, D. K., Miller, R. A., Pence, K. A., Kim, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+cell+and+non+small+cell+lung+cancer+form+metastasis+on+cellular+4D+lung+model.">Small cell and non small cell lung cancer form metastasis on cellular 4D lung model.</a> BMC Cancer. 18 (1), 441 (2018).</li></ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

O pulmão ex vivo 4-D fornece uma oportunidade para estudar o crescimento do tumor e metástases em uma configuração de laboratório. Uma matriz de pulmão nativo é um sistema complexo que oferece suporte ao tecido normal e mantém interações célula-célula, interações célula-matriz, diferenciação celular e organização do tecido. Ele fornece uma oportunidade para adicionar quaisquer componentes de microambiente do tumor para estudar seus efeitos sobre o crescimento do tumor e a interação com outra...

Metástase do cancro é o culpado por trás da maioria das mortes relacionadas ao câncer e representa o desafio final no esforço para combater o câncer. O objetivo geral deste método é desenhar um protocolo para uma cultura de quadridimensional (4D) de celular que tem uma dimensão de fluxo, além do crescimento tridimensional (3D) celular. Ele representa as três fases distintas do processo de metástase [isto é, o tumor primário, circulam células tumorais (CTC) e lesões metastáticas].
Nas últimas três décadas, os cientistas ao redor do mundo gerou uma riqueza incomparável de informações para entender os mecanismos subjacentes a progressão metastática em diferentes tipos de câncer que melhorou a perspectiva de uma cura ou sobrevivência livre de progressão. O manejo clínico de alguns tipos de câncer, como câncer de mama, melhorou significativamente a1; no entanto, alguns tipos de câncer, como câncer de pulmão, ainda têm uma sobrevivência pobre2. Modelos animais in vitro e in vivo têm sido fundamentais para gerar novos insights sobre os mecanismos que sustentam o desenvolvimento da doença. Nos últimos anos, linha-derivado xenografts (CDX) de célula e paciente-derivado xenografts (PDX) tem sido de mais interesse como preservam muitas características relevantes do tumor primário humano3, tais como a cinética de crescimento, características histológicas, comportamentais características e a resposta à terapia. No entanto, cada modelo tem suas limitações para entender o mecanismo de formação do CTC e metástases de um órgão distante4,5,6.
Recentemente, desenvolvemos um modelo de câncer de pulmão 4-D, ex vivo , utilizando o conceito de reengenharia de órgão e cultura de células com base em perfusão. Ele imita o crescimento do câncer de pulmão humano através da formação de nódulos de tumor perfusable que crescem ao longo do tempo com um semelhante humano câncer-secretada proteína produção7. Ele representa a assinatura de expressão do gene que prevê pobre sobrevida em pacientes com câncer e também mostra uma resposta terapêutica pela regressão do tumor com cisplatina tratamento8,9. O modelo de pulmão mais foi modificado para que ele possa formar lesões metastáticas. O CTC desenvolver a partir de um tumor primário e intravasate na vasculatura e extravasate para o pulmão contralateral para formar lesões metastáticas10. Estudos de expressão do gene sugerem um perfil de expressão distintas do tumor primário, o CTC e as lesões metastáticas e o upregulation do subconjunto de genes necessários para o fenótipo10. Este processo metastático ocorre devido à presença de condições biológicas, visto em pacientes com câncer. A vantagem desse modelo é a presença de uma matriz natural e arquitetura e uma perfusão de nutrientes que leva à formação de nódulos de tumor. Além disso, ele também fornece uma oportunidade para estudar os efeitos dos diferentes componentes do microambiente do tumor ou drogas na progressão do tumor ao longo do tempo. Este modelo pode ser usado para crescer um intervalo de células de câncer (câncer de pulmão, câncer de mama, sarcoma, etc.) em uma configuração de laboratório.

<table><tbody><tr><td>Sprague Dowley rat</td><td>Harlan</td><td>206M</td><td>Male</td></tr><tr><td>Chlorhexidine swab</td><td>Prevantics, NY, USA</td><td>NDC 10819-1080-1</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sagent Pharmaceuticals, Schaumburg, IL, USA</td><td>NDC 25021-400-10</td><td></td></tr><tr><td>18-gauge needle</td><td>McMaster Carr, USA</td><td>75165A249</td><td></td></tr><tr><td>2-0 silk tie</td><td>Ethicon, San Angelo, TX, USA</td><td>A305H</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S pump</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>EW-07554-80</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S pump head</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>EW-07519-05</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S pump cartridge</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>EW-07519-70</td><td></td></tr><tr><td>Tygon Tube</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>14171211</td><td></td></tr><tr><td>MasterFlex Pump tube</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>06598-16</td><td></td></tr><tr><td>Female luer lock connectors</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>45508-34</td><td>75165A249</td></tr><tr><td>Male luer lock connectors</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>45513-04</td><td></td></tr><tr><td>black nylon ring</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>EW-45509-04</td><td></td></tr><tr><td>Intravenous set</td><td>CareFusion</td><td>41134E</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>CAS151-21-3</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-1L</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotics</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>Silicone oxygenator</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>ABW00011</td><td>Saint-GoBain-</td></tr><tr><td>Wire mesh</td><td>1164610105</td><td>Lowes</td><td>New York Wire</td></tr><tr><td>Female luer Lug Style TEE</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>45508-56</td><td></td></tr><tr><td>Male luer integral lock ring to 200series Barb</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>45518-08</td><td></td></tr><tr><td>Female luer thread style coupler</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>45508-22</td><td></td></tr><tr><td>Clave connector</td><td>ICU Medical</td><td>11956</td><td></td></tr><tr><td>Hi-Flo &amp;trade;4-way Stopcock w/swivel male luer lock</td><td>smith Medical</td><td>MX9341L</td><td></td></tr><tr><td>MasterFlex Pump tube</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>06598-13</td><td>for cannula</td></tr></tbody></table>

acellular and cellular lung model to study tumor metastasis

É difícil isolar células tumorais em diferentes pontos da progressão do tumor. Criamos um ex vivo modelo de pulmão que pode mostrar a interação de células tumorais com uma matriz natural e contínuo fluxo de nutrientes, bem como um modelo que mostra a interação de células tumorais com componentes celulares normais e uma matriz natural. O modelo de pulmão acelular ex vivo é criado, isolando um bloco de coração-pulmão de rato e removendo todas as células usando o processo de decellularization. O brônquio principal direito é amarrado e células tumorais são colocadas na traqueia por uma seringa. As células se mover e preenchem o pulmão esquerdo. O pulmão é então colocado em um bioreator onde a artéria pulmonar recebe um fluxo contínuo de mídia em circuito fechado. O tumor crescido no pulmão esquerdo é o tumor primário. As células do tumor que são isoladas nos meios circulantes circulam células tumorais e as células do tumor no pulmão direito são lesões metastáticas. O modelo de pulmão celular ex vivo é criado por ignorar o processo de decellularization. Cada modelo pode ser usado para responder a perguntas de pesquisa diferente.

O pulmão de rato colhido mantém intacta vasculatura e alvéolos11 (Figura 3A e 3B). Sobre decellularization, os componentes de matriz extracelular de um pulmão acelular, tais como a fibronectina, colágeno e elastina, conservam-se11 (Figura 3, 3D, 3Ee 3F). O decellularization leva a uma completa remoção das cé...

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Acellular and Cellular Lung Model to Study Tumor Metastasis

Modelo de pulmão acelular e celular para estudar o Tumor metástase

Aqui, apresentamos um protocolo para um ex vivo pulmão câncer modelo que imita as etapas de progressão do tumor e ajuda a isolar um tumor primário, circulam células tumorais e lesões metastáticas.

It is difficult to isolate tumor cells at different points of tumor progression. We created an ex vivo lung model that can show the interaction of tumor ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Cancer Research

7.5K visualizações.  Houston Methodist Hospital Research Institute. Aqui, apresentamos um protocolo para um ex vivo pulmão câncer modelo que imita as etapas de progressão do tumor e ajuda a isolar um tumor primário, circulam células tumorais e lesões metastáticas.

Vídeo: Acellular and Cellular Lung Model to Study Tumor Metastasis

Lung Tumor Cell Recruitment Assay

To investigate the molecular mechanisms governing tumor metastasis, various assays using the mouse as a model animal have been proposed. Here, we demonstrate a simple assay to evaluate tumor cell extravasation or micrometastasis. In this assay, tumor cells were injected through the tail vein, and after a short period, the lungs were dissected and digested to count the accumulated labeled tumor cells. This assay skips the initial step of primary tumor invasion into the blood vessel and facilitates the study of events in the distant organ where tumor metastasis occurs. The number of cells injected into the blood vessel can be optimized to observe a limited number of metastases. It has been reported that stromal cells in the distant organ contribute to metastasis. Thus, this assay could be a useful tool to explore potential therapeutic drugs or devices for prevention of tumor metastasis.

This manuscript describes a method to quantify tumor cell accumulation in the lungs in an animal model of tumor metastasis.

Ensaio de recrutamento de células de Tumor de pulmão

To investigate the molecular mechanisms governing tumor metastasis, various assays using the mouse as a model animal have been proposed. Here, we ...

Pesquisa do câncer

Advanced Animal Model of Colorectal Metastasis in Liver: Imaging Techniques and Properties of Metastatic Clones

Patients with a limited number of hepatic metastases and slow rates of progression can be successfully treated with local treatment approaches1,2. However, little is known about the heterogeneity of liver metastases, and animal models capable of evaluating the development of individual metastatic colonies are needed. Here, we present an advanced model of hepatic metastases that provides the ability to quantitatively visualize the development of individual tumor clones in the liver and estimate their growth kinetics and colonization efficiency. We generated a panel of monoclonal derivatives of HCT116 human colorectal cancer cells stably labeled with luciferase and tdTomato and possessing different growth properties. With a splenic injection followed by a splenectomy, the majority of these clones are able to generate hepatic metastases, but with different frequencies of colonization and varying growth rates. Using the In Vivo&#160;Imaging System (IVIS), it is possible to visualize and quantify metastasis development with in vivo luminescent and ex vivo fluorescent imaging. In addition, Diffuse Luminescent Imaging Tomography (DLIT) provides a 3D distribution of liver metastases in vivo. Ex vivo fluorescent imaging of harvested livers provides quantitative measurements of individual hepatic metastatic colonies, allowing for the evaluation of the frequency of liver colonization and the growth kinetics of metastases. Since the model is similar to clinically observed liver metastases, it can serve as a modality for detecting genes associated with liver metastasis and for testing potential ablative or adjuvant treatments for liver metastatic disease.

The ability of metastatic clones to colonize distant sites depends on their proliferation capacity and/or their ability to survive in the host microenvironment without significant proliferation. Here, we present an animal model that allows quantitative visualization of both types of liver colonization by metastatic clones.

Modelo Animal avançado de Colorectal metástase no fígado: técnicas de imagem e Propriedades de metastáticos Clones

Patients with a limited number of hepatic metastases and slow rates of progression can be successfully treated with local treatment approaches1,2. ...

Experimental Metastasis and CTL Adoptive Transfer Immunotherapy Mouse Model

Experimental metastasis mouse model is a simple and yet physiologically relevant metastasis model. The tumor cells are injected intravenously (i.v) into mouse tail veins and colonize in the lungs, thereby, resembling the last steps of tumor cell spontaneous metastasis: survival in the circulation, extravasation and colonization in the distal organs. From a therapeutic point of view, the experimental metastasis model is the simplest and ideal model since the target of therapies is often the end point of metastasis: established metastatic tumor in the distal organ. In this model, tumor cells are injected i.v into mouse tail veins and allowed to colonize and grow in the lungs. Tumor-specific CTLs are then injected i.v into the metastases-bearing mouse. The number and size of the lung metastases can be controlled by the number of tumor cells to be injected and the time of tumor growth. Therefore, various stages of metastasis, from minimal metastasis to extensive metastasis, can be modeled. Lung metastases are analyzed by inflation with ink, thus allowing easier visual observation and quantification.

An experimental lung metastasis and CTL immunotherapy mouse model for analysis of tumor cells-T cell interaction in vivo.

Metástase experimental e CTL Adoptive Transferência Modelo rato Imunoterapia

Experimental metastasis mouse model is a simple and yet physiologically relevant metastasis model. The tumor cells are injected intravenously (i.v) into ...

Imunologia e Infecção

Practical Considerations in Studying Metastatic Lung Colonization in Osteosarcoma Using the Pulmonary Metastasis Assay

The pulmonary metastasis assay (PuMA) is an ex vivo lung explant and closed cell culture system that permits researchers to study the biology of lung colonization in osteosarcoma (OS) by fluorescence microscopy. This article provides a detailed description of the protocol, and discusses examples of obtaining image data on metastatic growth using widefield or confocal fluorescence microscopy platforms. The flexibility of the PuMA model permits researchers to study not only the growth of OS cells in the lung microenvironment, but also to assess the effects of anti-metastatic therapeutics over time. Confocal microscopy allows for unprecedented, high-resolution imaging of OS cell interactions with the lung parenchyma. Moreover, when the PuMA model is combined with fluorescent dyes or fluorescent protein genetic reporters, researchers can study the lung microenvironment, cellular and subcellular structures, gene function, and promoter activity in metastatic OS cells. The PuMA model provides a new tool for osteosarcoma researchers to discover new metastasis biology and assess the activity of novel anti-metastatic, targeted therapies.

The goal of this article is to provide a detailed description of the protocol for the pulmonary metastasis assay (PuMA). This model permits researchers to study metastatic osteosarcoma (OS) cell growth in lung tissue using a widefield fluorescence or confocal laser-scanning microscope.

Considerações práticas em estudar a colonização de pulmão metastático em osteossarcoma usando o ensaio de metástase pulmonar

The pulmonary metastasis assay (PuMA) is an ex vivo lung explant and closed cell culture system that permits researchers to study the biology of lung ...

The Establishment of a Lung Colonization Assay for Circulating Tumor Cell Visualization in Lung Tissues

Metastasis is the major cause of cancer death. The role of circulating tumor cells (CTCs) in promoting cancer metastasis, in which lung colonization by CTCs critically contributes to early lung metastatic processes, has been vigorously investigated. As such, animal models are the only approach that captures the full systemic process of metastasis. Given that problems occur in previous experimental designs for examining the contributions of CTCs to blood vessel extravasation, we established an in vivo lung colonization assay in which a long-term-fluorescence cell-tracer, carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE), was used to label suspended tumor cells and lung perfusion was performed to clear non-specifically trapped CTCs prior to lung removal, confocal imaging, and quantification. Polymeric fibronectin (polyFN) assembled on CTC surfaces has been found to mediate lung colonization in the final establishment of metastatic tumor tissues. Here, to specifically test the requirement of polyFN assembly on CTCs for lung colonization and extravasation, we performed short term lung colonization assays in which suspended Lewis lung carcinoma cells (LLCs) stably expressing FN-shRNA (shFN) or scramble-shRNA (shScr) and pre-labeled with 20 &#956;M of CFSE were intravenously inoculated into C57BL/6 mice. We successfully demonstrated that the abilities of shFN LLC cells to colonize the mouse lungs were significantly diminished in comparison to shScr LLC cells. Therefore, this short-term methodology may be widely applied to specifically demonstrate the ability of CTCs within the circulation to colonize the lungs.

An animal model is needed to decipher the role of circulating tumor cells (CTCs) in promoting lung colonization during cancer metastasis. Here, we established and successfully performed an in vivo assay to specifically test the requirement of polymeric fibronectin (polyFN) assembly on CTCs for lung colonization.

O estabelecimento de um ensaio de colonização de pulmão para visualização de células de Tumor nos tecidos do pulmão de circulação

Metastasis is the major cause of cancer death. The role of circulating tumor cells (CTCs) in promoting cancer metastasis, in which lung colonization by ...

Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs

Metastasis is the main cause of cancer-related deaths and there are limited therapeutic options for patients with metastatic disease. The identification and testing of novel therapeutic targets that will facilitate the development of better treatments for metastatic disease requires preclinical in vivo models. Demonstrated here is a syngeneic mouse model for assaying breast cancer metastatic colonization and subsequent growth. Metastatic cancer cells are stably transduced with viral vectors encoding firefly luciferase and ZsGreen proteins. Candidate genes are then stably manipulated in luciferase/ZsGreen-expressing cancer cells and then the cells are injected into mice via the lateral tail vein to assay metastatic colonization and growth. An in vivo imaging device is then used to measure the bioluminescence or fluorescence of the tumor cells in the living animals to quantify changes in metastatic burden over time. The expression of the fluorescent protein allows the number and size of metastases in the lungs to be quantified at the end of the experiment without the need for sectioning or histological staining. This approach offers a relatively quick and easy way to test the role of candidate genes in metastatic colonization and growth, and provides a great deal more information than traditional tail vein metastasis assays. Using this approach, we show that simultaneous knockdown of Yes associated protein (YAP) and transcriptional co-activator with a PDZ-binding motif (TAZ) in breast cancer cells leads to reduced metastatic burden in the lungs and that this reduced burden is the result of significantly impaired metastatic colonization and reduced growth of metastases.

The described approach combines experimental tail vein metastasis assays with in vivo live animal imaging to allow real-time monitoring of breast cancer metastasis formation and growth in addition to the quantification of metastasis number and size in the lungs.

Uso combinado de ensaios de metástase de veia de cauda e imagens in vivo em tempo real para quantificar a colonização metastática do câncer de mama e carga nos pulmões

Metastasis is the main cause of cancer-related deaths and there are limited therapeutic options for patients with metastatic disease. The identification ...

Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous metastasis models are available. Thus, the experimental metastasis model involving tail-vein injection of suitable cell lines is a mainstay of metastasis research. When cancer cells are injected into the lateral tail-vein, the lung is their preferred site of colonization. A potential limitation of this technique is the accurate quantification of the metastatic lung tumor burden. While some investigators count macrometastases of a pre-defined size and/or include micrometastases following sectioning of tissue, others determine the area of metastatic lesions relative to normal tissue area. Both of these quantification methods can be exceedingly difficult when the metastatic burden is high. Herein, we demonstrate an intravenous injection model of lung metastasis followed by an advanced method for quantifying metastatic tumor burden using image analysis software. This process allows for investigation of multiple end-point parameters, including average metastasis size, total number of metastases, and total metastasis area, to provide a comprehensive analysis. Furthermore, this method has been reviewed by a veterinary pathologist board-certified by the American College of Veterinary Pathologists (SEK) to ensure accuracy.

Intravenous injection of cancer cells is often used in metastasis research, but the metastatic tumor burden can be difficult to analyze. Herein, we demonstrate a tail-vein injection model of metastasis and include a novel approach to analyze the resulting metastatic lung tumor burden.

Análise patológica da metástase pulmonar após injeção lateral de cauda-veia de células tumorais

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous ...

A Permanent Window for Investigating Cancer Metastasis to the Lung

Metastasis, accounting for ~90% of cancer-related mortality, involves the systemic spread of cancer cells from primary tumors to secondary sites such as the bone, brain, and lung. Although extensively studied, the mechanistic details of this process remain poorly understood. While common imaging modalities, including computed tomography (CT), positron emission tomography (PET), and magnetic resonance imaging (MRI), offer varying degrees of gross visualization, each lacks the temporal and spatial resolution necessary to detect the dynamics of individual tumor cells. To address this, numerous techniques have been described for intravital imaging of common metastatic sites. Of these sites, the lung has proven especially challenging to access for intravital imaging owing to its delicacy and critical role in sustaining life. Although several approaches have previously been described for single-cell intravital imaging of the intact lung, all involve highly invasive and terminal procedures, limiting the maximum possible imaging duration to 6-12 h. Described here is an improved technique for the permanent implantation of a minimally invasive thoracic optical Window for High-Resolution Imaging of the Lung (WHRIL). Combined with an adapted approach to microcartography, the innovative optical window facilitates serial intravital imaging of the intact lung at single-cell resolution across multiple imaging sessions and spanning multiple weeks. Given the unprecedented duration of time over which imaging data can be gathered, the WHRIL can facilitate the accelerated discovery of the dynamic mechanisms underlying metastatic progression and numerous additional biologic processes within the lung.

Here, we present a protocol for the surgical implantation of a permanently indwelling optical window for the murine thorax, which enables high-resolution, intravital imaging of the lung. The permanence of the window makes it well-suited to the study of dynamic cellular processes in the lung, especially those that are slowly evolving, such as metastatic progression of disseminated tumor cells.

Uma janela permanente para investigar metástase do câncer no pulmão

Metastasis, accounting for ~90% of cancer-related mortality, involves the systemic spread of cancer cells from primary tumors to secondary sites such as ...

In Vivo Imaging to Measure Spontaneous Lung Metastasis of Orthotopically-injected Breast Tumor Cells

Metastasis remains the primary cause of cancer-related death. The succession of events that characterize the metastatic cascade presents multiple opportunities for therapeutic intervention, and the ability to accurately model them in mice is critical to evaluate their effects. Here, a step-by-step protocol is presented for the establishment of orthotopic primary breast tumors and the subsequent monitoring of the establishment and growth of metastatic lesions in the lung using in vivo bioluminescence imaging. This methodology allows for the evaluation of treatment or its biological effects along the entire range of metastatic development, from primary tumor escape to outgrowth in the lungs. Breast orthotopic tumors are generated in mice via injection of a luciferase-labeled cell suspension in the 4th mammary gland. Tumors are allowed to grow and disseminate for a specific amount of time and are then surgically resected. Upon resection, spontaneous lung metastasis is detected, and the growth over time is monitored using in vivo bioluminescence imaging. At the desired experimental endpoint, lung tissue can be collected for downstream analysis. The treatment of established, clinically evident metastasis is critical to improve outcomes for stage IV cancer patients, and it can be evaluated through tail vein models of experimental lung metastasis. However, metastatic dissemination occurs early in breast cancer, and many patients have latent, subclinical disseminated disease after surgery. Utilization of spontaneous models such as this one provides the opportunity to study the whole spectrum of the disease, especially the systemic effects driven by treatment of the primary tumor such as pre-metastatic niche priming, and evaluate treatments on dormant and subclinical disease after surgery.

<meta charset="utf8"></head><body>Imagem in vivo para medir metástases pulmonares espontâneas de células tumorais de mama injetadas ortotopicamente

The manuscript describes a methodology for the establishment as well as longitudinal growth monitoring of spontaneous lung metastasis from orthotopically-injected breast tumors, amenable to intervention at all stages of the metastatic cascade.