分 p. キム第 2 ジョン ・ w ・ Kirklin 研究奨学金、ジョアン h. コーン研究賞とマイケル ・ m ・胸部手術、グラハム研究財団、ヒューストン メソジスト専門医師グループ許可のためのアメリカ連合から支援助成を受けた。アンについては、原稿の言語編集を感謝いたします。

動物実験のためのプロトコルは、機関動物ケアとヒューストン メソジスト研究所利用委員会によって承認され、すべての規制、法律、ガイドライン、およびポリシーに基づき実施します。
1. ラット肺収穫
<ol><li>ケタミン (100 mg/kg) とその麓のキシラジン (10 mg/kg) の腹腔内 (IP) 投与による 4-6 週齢雄 Sprague-dawley ラットを麻酔します。麻酔と後肢のつま先は、ピンセットでつままれて動きの不在を確認して、確認します。</li>
	<li>10 分後胸部と腹部を剃るし、クロルヘキシジン綿棒で肌を拭いてください。</li>
	<li>鉗子を拾って、使い捨てメスで切開は、皮膚を削除します。メスで切開して胸腔内を開き、左側の肋骨の前方側および横隔膜の右側をハサミで切断することによって両側開胸下を実行します。 注: これは非生存の手術です。</li>
	<li>胸郭をホールド アップし、27 G の針を使用して心臓の右心室にヘパリン (1,000 単位/mL) 2 mL を注入します。 注: これは肺の血栓の形成を防ぐ。</li>
	<li>完全にハサミで胸郭を取り出し、血が出るまでに、通気孔として左心室に 18 G 針を置きます。その後、ヘパリン リン酸緩衝生理食塩水 (12.5 単位/ml; ヘパリン PBS) 15 mL を 25 G 針を使用して右心室に注入します。</li>
	<li>劣ると優れた下大静脈、心臓の右側にある 2 つの大きな静脈を切り取って追加 10 ml ヘパリン PBS 27 G の針を使用して右心室の肺をフラッシュします。 注: 下大静脈は大きな船として心の底の下で視覚化される赤い血でいっぱい。同様に、心臓の上の部分で、上大静脈を視覚化して、大きな船として。</li>
	<li>甲状腺の基地で気管をカットします。半奇静脈とアーチで大動脈の枝のレベルで下行大動脈を慎重に取り外します。</li>
	<li>胸腔内とラットの体の残りの部分から心臓肺ブロックを取り出してください。</li>
	<li>右と左の心室の半分を切断することによって心を実行し、肺動脈 (PA) に右心室を介してカスタム済み 18 G ステンレス鋼針カニューレを配置します。</li>
	<li>2-0 シルク ネクタイでカニューレを固定し、慎重に右心室と心房を公開します。</li>
	<li>左心室内女性ルアー隔壁を置き、2-0 シルク ネクタイで固定します。</li>
	<li>PA カニューレを通じてヘパリン PBS の 20 ml 心臓肺ブロックをフラッシュし、文化メディアまたはヘパリンの PBS を含む 50 の mL の管にそれを置きます。 注: セルラー モデル 3.1 バイオリアクターを設定する手順に進みます。無細胞性モデル、decellularization の 2.1 手順に進みます。</li>
</ol>2. 肺 Decellularization
<ol><li>
Decellularization ユニットの準備
	<ol>
<li>ボトル キャップで 2 つ穴ピアスと穴 (図 1 aと1 b) に女性のルアーをスナップして各 decellularization 商工会議所/ボトルを準備します。それを反対側に黒のナイロン リングで固定します。同様に、静脈内投与セットの添付ファイル (図 1) のための別のボトル キャップで 1 つの穴をドリルします。 注:図 1 aおよび1 bの 2 つの異なる側面から同じペットボトルのキャップです。図 1は、2.1.1 の手順で上記のようの単一の穴と異なるキャップです。</li>
		<li>ボトル キャップ (図 1 aと1 b) の中から女性のルアーに (肺動脈または PA 終了) で 0.5 インチ管と 6 インチ管 (図 1 j) を添付し、両端男性ルアーロックを添付します。Decellularization 商工会議所/ボトルと 500 mL のボトルでロックを設定します。</li>
		<li>女性ルアーのカートリッジ (図 1) によってポンプ ヘッド (図 1Eと1 階) に取り付けられているポンプ チューブ (図 1 H) のどちらかの端に 2 つの 2 フィート チューブ (これは男性ルアーロックで接続されている) の一端を接続します。ロック (図 1I)。</li>
		<li>2 フィートからチューブの (ステップ 2.1.3) 各 decellularization 商工会議所/ボトル キャップ (図 1 L) に女性ルアー ロックの頭に他の端点を接続します。</li>
		<li>250 ml セット ボトル キャップと decellularization c に接続されている 2 フィートのチューブを取り付け、遠位端に挿入されます (図 1) 静脈内投与セットの近位端でスタンドに倒立ボトルを掛けることによって PBS (PBS の 200 mL の) でボトルをヘパリン化先のハンバー/ボトル PA 端 (図 1 b)。廃棄ボトルにこの 2 フィートのチューブを接続します。 注:図 1 Kで示すように、ボトルは段ボールに設定されます。点滴のチューブは肺足場の試薬を分注するハンギング ボトルから出てくる。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
肺 decellularization プロセス
	<ol>
<li>Decellularization 商工会議所/ボトルで自由に流れるまで 30 mm Hg (図 1 K) の生理学的な灌流圧でヘパリンの PBS を実行、その後、PA カニューレを介して PA まで心臓肺ブロックを取り付けます。</li>
		<li>Decellularization 商工会議所/ボトル中余分なバッファー/ソリューションに取得しますので、ポンプを連続的に実行してください。</li>
		<li>最初の洗浄水 (図 1 K) の 30 mm Hg の潅流圧で 15 分の PA のヘパリンの PBS を実行します。</li>
		<li>0.1% ドデシル硫酸ナトリウム (SDS) 脱イオン水とヘパリンの PBS ボトルを交換し、decellularization の 2 h の肺を灌流します。</li>
		<li>Decellularization 後、15 分間肺足場をオートクレーブ処理した純水を灌流します。</li>
		<li>次に、脱イオン水で 10 分間の 1% 非イオン性洗剤を灌流します。</li>
		<li>500 ml ボトル内キャップをそのままハング肺を維持する 1 x 抗生物質 (ペニシリン-ストレプトマイシン アムホテリシン) を添加したオートクレーブの PBS の decellularization の商工会議所/ボトルを交換してください。</li>
		<li>静脈内投与セット、decellularization 室肺動脈末に廃棄容器に接続されている 2 フィートのチューブを入れて、6 mL/分 (図 1 L) ポンプを実行を破棄します。</li>
		<li>72 h の肺灌流し、抗生物質 12 時間間隔で PBS を変え続けます。 注: 無細胞性肺は即時の使用の準備ができて。必要になるまで-80 ° C で保存できます。ピンク色の斑点や血栓は、肺の葉で明確に視覚化することは、肺を破棄します。ランダムに DNA や病理組織学的にテストすることが可能です。細胞や DNA の 99.9% が洗い流されるが、完全な無細胞性肺は表示されません。 注: 細胞肺モデルを操作する場合は、decellularization をスキップします。収穫された肺 (ステップ 1) は、バイオリアクター内で直接設定できます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. バイオリアクター セットアップ
<ol><li>バイオリアクター ボトルとセットアップに必要なアイテムを準備します。<ol>
<li>等距離にある 1 つの 500 mL ボトルのキャップで 3 つの穴をドリルし、黒のナイロン リング (図 2 aおよび2 b) を使用してすべての 3 つの穴で女性ルアーを修正します。 注: 2 つの穴で、ルアーロックでは、一方の端が瓶の内側を向く間「顔、外を終了します。</li>
		<li>バイオリアクターあたりポンプ チューブの 6、管内 2、チューブ、1.5 フィート管、2 フィート管と 10 フィートの人工チューブで 6 をカットします。</li>
		<li>ステンレス鋼、18 G の針をカットし、再度、気管カニューレの生体適合性のチューブの両端を接続します。</li>
		<li>オートクレーブ テープ (図 2) を使用して電磁ワイヤー メッシュ上の両端ルアーロック ロック コネクタを備えた人工チューブをラップします。</li>
		<li>オートクレーブ上記項目し、10 分のために軽い UV でそれらを保ちます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>適切な間隔で簡単に 500 mL のボトルに合わせてトレイの間通常のセル文化のインキュベーター (37 ° C、5% CO2) 内ポンプを設定します。</li>
	<li>ポンプ カートリッジの 70% エタノールをスプレー、ポンプに両端ルアーロック ロックのメスコネクタでポンプのチューブを接続します。</li>
	<li>ポンプ チューブとバイオリアクター内で 1.5 フィートのチューブのもう一方の端に、人工の一端 (流出) を接続して携帯文化のインキュベーター内電磁ワイヤー メッシュを包んだ肺を設定します。</li>
	<li>無菌条件でキャビネット、バイオ セーフティにおけるバイオリアクター ボトルを設定します。<ol>
<li>PA を通して流れを制御する女性ルアーズの一つの頭に三方活栓 (黄色) を添付します。</li>
		<li>別女性ルアー ロックの隔壁細胞 (図 2 f) 気管を通じて播種の一方向バルブ (青) に接続します。</li>
		<li>外側にチューブの 2 を接続 (白) と、メディアを循環するボトルの内側にチューブの 6。2 フィートのチューブに男性ルアーロックを合わせて女性のルアーロック ラグ スタイル追加または何かを削除するへのアクセスを提供するために t シャツを添付してください。</li>
		<li>3 ウェイ コネクタ (女性ルアー ラグ スタイル t シャツ) の開口部のいずれか一方向バルブを取り付けます。</li>
		<li>ルアーロックを男性と女性のルアーロックを 2 フィート管に接続します。</li>
		<li>10 %fbs と 1% 抗生物質細胞培養培地 (セル条件によって異なります) と RPMI1640 の 200 mL を追加し、バイオリアクターをインキュベーターに転送します。2 つの開放端 (一方向バルブとティー コネクタ) に閉ループ型バイオリアクターに人工のチューブを接続します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>チューブに気泡が存在しないので、あらかじめ 6 mL/分肺やチューブ、埋めるための細胞培養媒体の携帯文化のインキュベーター内でポンプを実行します。</li>
	<li>チューブが満ちている一度メディア、活栓を閉じるバイオリアクター ボトルから取り出してインキュベーター バイオリアクター ボトルの両端から、人工肺を切断してください。</li>
	<li>キャビネット、バイオ セーフティにおけるバイオリアクター ボトルを入れて、バルブ、文化メディアを渡す、男性のルアーロック コネクタを介して活栓に肺癌の足場 (無細胞性または細胞) の PA カニューレを取り付けます。 注: ここでそれは無細胞性モデル (decellularization プロセスに続く) または新鮮な収穫心臓肺ブロックを使用することが可能 (ネイティブ ラット細胞はすなわち、細胞モデルをそのまま維持されます)。</li>
	<li>空気を抜くと気管に絹糸によって気管カニューレを結ぶ片道活栓を通じて文化メディアを渡します。</li>
	<li>PA と気管の任意のねじれを避けるためにことを確認します。すぐ肺とバイオリアクターのボトル キャップ内部足場、再び、無菌、バイオリアクターをインキュベーターに転送し、6 mL/分の速度でポンプを起動します。</li>
	<li>すべて葉膨らまされると肺に良い形 (図 2) に見えるように 10-15 分間培地を実行します。</li>
</ol>4. 転移モデルと細胞の播種
メモ: セルのシーディングは原発腫瘍の成長に関する上記の肺モデルに進みます。転移モデルのとおり肺足場 (無細胞性または携帯電話) を変更します。
<ol><li>インキュベーターから肺足場とバイオリアクターを取り出して、キャビネット、バイオ セーフティにおけるそれを置きます。</li>
	<li>気管を通じて培地 5 mL を渡すし、絞首刑とバイオリアクター キャップを開き、ルアーロック注射器を使用して肺の足場 (図 2 f)。</li>
	<li>この段階でもう一人は肺転移モデルの変更のために必要です。</li>
	<li>シルク 2-0 準備し、分岐ポイントで気管を通過する角度鉗子を使用を取得します。</li>
	<li>分岐点で右肺に気管を結ぶ、文化メディアを渡すことにより肺気管を通じてメディアの自由な流れを確認します。 注: 気管分岐時点で結びついている、一度気管を通じて播種された細胞、自動的に左葉にシードします。気管を通じてプッシュの培地で細胞を播種する前にテストできます。転移モデルでメディアは、のみを膨らませるが、左葉と右葉,10に移動します。</li>
	<li>20 mL ルアーロック注射器を気管カニューレの上を設定し、RPMI1640 完全培地 (図 2 f) 50 mL に ATCC 肺癌細胞 (A549、H1299) を追加します。</li>
	<li>バイオ セーフティ キャビネットの播種細胞を実行します。注射器で細胞の 15 の mL を追加し、重力によって肺の葉を通過せてください。空気の泡が通過する前に、セルの残りの部分を追加します。</li>
	<li>無細胞性肺癌播種、バイオリアクター瓶に滴り灌流のメディアを収集して気管を通過するもう一度 3 x みましょう。 注: 灌流のメディアは時々 シードがん細胞にあります。したがって、効率的なシーディングのためメディア再び戻す気管内注射器を介して。</li>
	<li>一度シード、シリンジは、15 分待つ、新鮮なメディアを追加、バイオリアクターをインキュベーターに返します。チューブ内の空気の泡を削除します。</li>
	<li>6 mL/分でメディアを灌流するためにポンプを起動します。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+Statistics,+2017.">Cancer Statistics, 2017.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 67 (1), 7-30 (2017).</li><li>Torre, L. A., Siegel, R. L., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+Cancer+Statistics.">Lung Cancer Statistics.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 893, 1-19 (2016).</li><li>Lallo, A., Schenk, M. W., Frese, K. K., Blackhall, F., Dive, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+cells+and+CDX+models+as+a+tool+for+preclinical+drug+development.">Circulating tumor cells and CDX models as a tool for preclinical drug development.</a> Translational Lung Cancer Research. 6 (4), 397-408 (2017).</li><li>Yang, S., Zhang, J. J., Huang, X. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+for+tumor+metastasis.">Mouse models for tumor metastasis.</a> Methods in Molecular Biology. 928, 221-228 (2012).</li><li>Bissell, M. J., Hines, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+don't+we+get+more+cancer?+A+proposed+role+of+the+microenvironment+in+restraining+cancer+progression.">Why don't we get more cancer? A proposed role of the microenvironment in restraining cancer progression.</a> Nature Medicine. 17 (3), 320-329 (2011).</li><li>Francia, G., Cruz-Munoz, W., Man, S., Xu, P., Kerbel, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+advanced+spontaneous+metastasis+for+experimental+therapeutics.">Mouse models of advanced spontaneous metastasis for experimental therapeutics.</a> Nature Reviews Cancer. 11 (2), 135-141 (2011).</li><li>Mishra, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+lung+cancer+cells+grown+in+an+ex+vivo+3D+lung+model+produce+matrix+metalloproteinases+not+produced+in+2D+culture.">Human lung cancer cells grown in an ex vivo 3D lung model produce matrix metalloproteinases not produced in 2D culture.</a> PloS One. 7 (9), e45308 (2012).</li><li>Vishnoi, M., Mishra, D. K., Thrall, M. J., Kurie, J. M., Kim, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+cells+from+a+4-dimensional+lung+cancer+model+are+resistant+to+cisplatin.">Circulating tumor cells from a 4-dimensional lung cancer model are resistant to cisplatin.</a> The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 148 (3), 1056-1063 (2014).</li><li>Mishra, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+profile+of+A549+cells+from+tissue+of+4D+model+predicts+poor+prognosis+in+lung+cancer+patients.">Gene expression profile of A549 cells from tissue of 4D model predicts poor prognosis in lung cancer patients.</a> International Journal of Cancer. Journal International du Cancer. , (2013).</li><li>Mishra, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+four-dimensional+lung+cancer+model+mimics+metastasis.">Ex vivo four-dimensional lung cancer model mimics metastasis.</a> The Annals of Thoracic Surgery. 99 (4), 1149-1156 (2015).</li><li>Mishra, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+lung+cancer+cells+grown+on+acellular+rat+lung+matrix+create+perfusable+tumor+nodules.">Human lung cancer cells grown on acellular rat lung matrix create perfusable tumor nodules.</a> The Annals of Thoracic Surgery. 93 (4), 1075-1081 (2012).</li><li>Pence, K. A., Mishra, D. K., Thrall, M., Dave, B., Kim, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+cancer+cells+form+primary+tumors+on+ex+vivo+four-dimensional+lung+model.">Breast cancer cells form primary tumors on ex vivo four-dimensional lung model.</a> Journal of Surgical Research. 210, 181-187 (2017).</li><li>Mishra, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Lung+Fibroblasts+Inhibit+Non-Small+Cell+Lung+Cancer+Metastasis+in+Ex+Vivo+4D+Model.">Human Lung Fibroblasts Inhibit Non-Small Cell Lung Cancer Metastasis in Ex Vivo 4D Model.</a> The Annals of Thoracic Surgery. 100 (4), 1167-1174 (2015).</li><li>Mishra, D. K., Miller, R. A., Pence, K. A., Kim, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+cell+and+non+small+cell+lung+cancer+form+metastasis+on+cellular+4D+lung+model.">Small cell and non small cell lung cancer form metastasis on cellular 4D lung model.</a> BMC Cancer. 18 (1), 441 (2018).</li></ol>

著者が明らかに何もありません。

前のヴィヴォ4 D 肺腫瘍の成長と転移研究室のセットアップを勉強する機会を提供します。ネイティブ肺マトリックスは、正常な組織への支援を提供し、組織形成、細胞分化、細胞マトリックス相互作用の細胞間相互作用を維持する複雑なシステムです。それは腫瘍の成長への影響や他の細胞との相互作用を研究する、腫瘍微小環境のコンポーネントを追加する機会を提供します。
<...

がん転移はほとんど癌関連死の背後にある原因、がんと闘うための努力で究極の挑戦を提起します。このメソッドの全体的な目標は、三次元 (3 D) 細胞の増殖だけでなく、流れの次元四次元 (4 D) の細胞培養のプロトコルを設計することです。[すなわち腫瘍、循環腫瘍細胞 (CTCs) と転移巣] 転移プロセスの 3 つの異なるフェーズを表します。
過去 3 年間は、世界中の科学者は、比類のない豊富な治療法や進行自由な存続の見通しを改善した別の癌で転移性進行のメカニズムを理解するための情報を得られました。乳がんなどのいくつかの癌の臨床管理は著しく1;ただし、いくつかの癌、肺癌などまだ貧しい人々 の生存の2があります。In vitroとin vivoの動物モデルは病気の開発を支えるメカニズムに新しい洞察力を生成するのに尽力されています。ここ数年で細胞由来の異種移植片 (CDX) と患者由来の異種移植片 (PDX) もっと興味彼らは人間の腫瘍の3成長カイネティクスなど多くの関連する機能、組織学的特徴、行動を維持するとされています。特性、および療法への応答。ただし、各モデルには、CTC の形成と遠隔臓器4,5,6に転移のメカニズムを理解する限界があります。
最近では、オルガンのリエンジニア リングおよび灌流ベースの細胞培養の概念を用いた 4 D前のヴィヴォ肺の癌モデルを開発しました。がん分泌と同様人間と時間をかけて成長 perfusable 腫瘍結節を形成することによって人間の肺の癌の成長を模倣したタンパク質生産7。それは癌患者の予後を予測するとまたシスプラチン治療8,9時に腫瘍の回帰分析による治療反応を示す遺伝子発現シグネチャを表します。肺のモデルは、それは転移巣を形成することができますので、さらに変更されました。Ctc は、血管系に原発巣および intravasate から開発し、対側肺転移巣10を形成するために extravasate。遺伝子発現の研究では、転移巣、Ctc、原発腫瘍の明確な発現プロファイルと表現型10に必要な遺伝子のサブセットのアップレギュレーションを示唆しています。がんの患者さんで見られる生物学的条件の存在のためにこの転移プロセスが発生します。このモデルの利点は自然行列とアーキテクチャの存在と腫瘍結節の形成につながる栄養素の血流。さらに、それはまた時間をかけて腫瘍進行に及ぼす腫瘍微小環境や薬のさまざまなコンポーネントを勉強する機会を提供します。このモデルは、実験室のセットアップの癌細胞 (肺がん、乳がん、肉腫など) の範囲を拡大する使用できます。

<table><tbody><tr><td>Sprague Dowley rat</td><td>Harlan</td><td>206M</td><td>Male</td></tr><tr><td>Chlorhexidine swab</td><td>Prevantics, NY, USA</td><td>NDC 10819-1080-1</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sagent Pharmaceuticals, Schaumburg, IL, USA</td><td>NDC 25021-400-10</td><td></td></tr><tr><td>18-gauge needle</td><td>McMaster Carr, USA</td><td>75165A249</td><td></td></tr><tr><td>2-0 silk tie</td><td>Ethicon, San Angelo, TX, USA</td><td>A305H</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S pump</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>EW-07554-80</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S pump head</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>EW-07519-05</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S pump cartridge</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>EW-07519-70</td><td></td></tr><tr><td>Tygon Tube</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>14171211</td><td></td></tr><tr><td>MasterFlex Pump tube</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>06598-16</td><td></td></tr><tr><td>Female luer lock connectors</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>45508-34</td><td>75165A249</td></tr><tr><td>Male luer lock connectors</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>45513-04</td><td></td></tr><tr><td>black nylon ring</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>EW-45509-04</td><td></td></tr><tr><td>Intravenous set</td><td>CareFusion</td><td>41134E</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>CAS151-21-3</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-1L</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotics</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>Silicone oxygenator</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>ABW00011</td><td>Saint-GoBain-</td></tr><tr><td>Wire mesh</td><td>1164610105</td><td>Lowes</td><td>New York Wire</td></tr><tr><td>Female luer Lug Style TEE</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>45508-56</td><td></td></tr><tr><td>Male luer integral lock ring to 200series Barb</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>45518-08</td><td></td></tr><tr><td>Female luer thread style coupler</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>45508-22</td><td></td></tr><tr><td>Clave connector</td><td>ICU Medical</td><td>11956</td><td></td></tr><tr><td>Hi-Flo &amp;trade;4-way Stopcock w/swivel male luer lock</td><td>smith Medical</td><td>MX9341L</td><td></td></tr><tr><td>MasterFlex Pump tube</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>06598-13</td><td>for cannula</td></tr></tbody></table>

acellular and cellular lung model to study tumor metastasis

腫瘍の進行のさまざまな時点で腫瘍の細胞を分離することは困難です。自然な行列と腫瘍細胞との相互作用、栄養素の継続的な流れを示すことができる前のヴィヴォ肺モデルだけでなく、腫瘍細胞が通常の細胞成分と相互作用を示し、天然マトリックス モデルを作成しました。前のヴィヴォ無細胞性肺モデルは、ラット心臓肺ブロックを分離し、decellularization プロセスを使用してすべてのセルを削除することによって作成されます。右主気管支は縛し、腫瘍細胞は注射器で気管に格納されます。セルは移動し、左肺を設定します。肺は、肺動脈が、閉回路でメディアの継続的な流れを受け取るバイオリアクターに格納されます。左肺上に成長した腫瘍は、原発腫瘍です。循環のメディアに分離されている腫瘍細胞は循環腫瘍細胞と右肺に腫瘍細胞が転移巣。携帯電話前のヴィヴォ肺モデルが decellularization プロセスをスキップすることにより作成されます。各モデルは、異なる研究の質問に答えるに使用できます。

ラットから採取した肺はそのまま血管と肺胞11 (図 3 aと3 b) を保持しています。Decellularization に無細胞性肺、エラスチン、フィブロネクチン、コラーゲンなどの細胞外マトリックス成分は11 (図 3、 3 D 3 e、 3 f) に保持されます。ヘマトキ?...

Watch this Scientific Journal Video about Acellular and Cellular Lung Model to Study Tumor Metastasis at JoVE.com

Acellular and Cellular Lung Model to Study Tumor Metastasis

無細胞性と細胞の肺転移モデル

ここでは、プロトコルを提案前のヴィヴォ肺がんモデルの腫瘍の進行の手順を模倣し、原発巣を特定するのに役立ちます循環腫瘍細胞と転移巣。

It is difficult to isolate tumor cells at different points of tumor progression. We created an ex vivo lung model that can show the interaction of tumor ...

acellular-and-cellular-lung-model-to-study-tumor-metastasis

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Cancer Research

7.5K ビュー.  Houston Methodist Hospital Research Institute. ここでは、プロトコルを提案前のヴィヴォ肺がんモデルの腫瘍の進行の手順を模倣し、原発巣を特定するのに役立ちます循環腫瘍細胞と転移巣。

ビデオ: Acellular and Cellular Lung Model to Study Tumor Metastasis

Lung Tumor Cell Recruitment Assay

To investigate the molecular mechanisms governing tumor metastasis, various assays using the mouse as a model animal have been proposed. Here, we demonstrate a simple assay to evaluate tumor cell extravasation or micrometastasis. In this assay, tumor cells were injected through the tail vein, and after a short period, the lungs were dissected and digested to count the accumulated labeled tumor cells. This assay skips the initial step of primary tumor invasion into the blood vessel and facilitates the study of events in the distant organ where tumor metastasis occurs. The number of cells injected into the blood vessel can be optimized to observe a limited number of metastases. It has been reported that stromal cells in the distant organ contribute to metastasis. Thus, this assay could be a useful tool to explore potential therapeutic drugs or devices for prevention of tumor metastasis.

This manuscript describes a method to quantify tumor cell accumulation in the lungs in an animal model of tumor metastasis.

肺腫瘍細胞募集試験

To investigate the molecular mechanisms governing tumor metastasis, various assays using the mouse as a model animal have been proposed. Here, we ...

がん研究

Advanced Animal Model of Colorectal Metastasis in Liver: Imaging Techniques and Properties of Metastatic Clones

Patients with a limited number of hepatic metastases and slow rates of progression can be successfully treated with local treatment approaches1,2. However, little is known about the heterogeneity of liver metastases, and animal models capable of evaluating the development of individual metastatic colonies are needed. Here, we present an advanced model of hepatic metastases that provides the ability to quantitatively visualize the development of individual tumor clones in the liver and estimate their growth kinetics and colonization efficiency. We generated a panel of monoclonal derivatives of HCT116 human colorectal cancer cells stably labeled with luciferase and tdTomato and possessing different growth properties. With a splenic injection followed by a splenectomy, the majority of these clones are able to generate hepatic metastases, but with different frequencies of colonization and varying growth rates. Using the In Vivo&#160;Imaging System (IVIS), it is possible to visualize and quantify metastasis development with in vivo luminescent and ex vivo fluorescent imaging. In addition, Diffuse Luminescent Imaging Tomography (DLIT) provides a 3D distribution of liver metastases in vivo. Ex vivo fluorescent imaging of harvested livers provides quantitative measurements of individual hepatic metastatic colonies, allowing for the evaluation of the frequency of liver colonization and the growth kinetics of metastases. Since the model is similar to clinically observed liver metastases, it can serve as a modality for detecting genes associated with liver metastasis and for testing potential ablative or adjuvant treatments for liver metastatic disease.

The ability of metastatic clones to colonize distant sites depends on their proliferation capacity and/or their ability to survive in the host microenvironment without significant proliferation. Here, we present an animal model that allows quantitative visualization of both types of liver colonization by metastatic clones.

肝臓における大腸転移の高度な動物モデル：イメージング技術および転移性クローンのプロパティ

Patients with a limited number of hepatic metastases and slow rates of progression can be successfully treated with local treatment approaches1,2. ...

Experimental Metastasis and CTL Adoptive Transfer Immunotherapy Mouse Model

Experimental metastasis mouse model is a simple and yet physiologically relevant metastasis model. The tumor cells are injected intravenously (i.v) into mouse tail veins and colonize in the lungs, thereby, resembling the last steps of tumor cell spontaneous metastasis: survival in the circulation, extravasation and colonization in the distal organs. From a therapeutic point of view, the experimental metastasis model is the simplest and ideal model since the target of therapies is often the end point of metastasis: established metastatic tumor in the distal organ. In this model, tumor cells are injected i.v into mouse tail veins and allowed to colonize and grow in the lungs. Tumor-specific CTLs are then injected i.v into the metastases-bearing mouse. The number and size of the lung metastases can be controlled by the number of tumor cells to be injected and the time of tumor growth. Therefore, various stages of metastasis, from minimal metastasis to extensive metastasis, can be modeled. Lung metastases are analyzed by inflation with ink, thus allowing easier visual observation and quantification.

An experimental lung metastasis and CTL immunotherapy mouse model for analysis of tumor cells-T cell interaction in vivo.

実験的転移とCTLの養子移入免疫療法のマウスモデル

Experimental metastasis mouse model is a simple and yet physiologically relevant metastasis model. The tumor cells are injected intravenously (i.v) into ...

免疫・感染学

Practical Considerations in Studying Metastatic Lung Colonization in Osteosarcoma Using the Pulmonary Metastasis Assay

The pulmonary metastasis assay (PuMA) is an ex vivo lung explant and closed cell culture system that permits researchers to study the biology of lung colonization in osteosarcoma (OS) by fluorescence microscopy. This article provides a detailed description of the protocol, and discusses examples of obtaining image data on metastatic growth using widefield or confocal fluorescence microscopy platforms. The flexibility of the PuMA model permits researchers to study not only the growth of OS cells in the lung microenvironment, but also to assess the effects of anti-metastatic therapeutics over time. Confocal microscopy allows for unprecedented, high-resolution imaging of OS cell interactions with the lung parenchyma. Moreover, when the PuMA model is combined with fluorescent dyes or fluorescent protein genetic reporters, researchers can study the lung microenvironment, cellular and subcellular structures, gene function, and promoter activity in metastatic OS cells. The PuMA model provides a new tool for osteosarcoma researchers to discover new metastasis biology and assess the activity of novel anti-metastatic, targeted therapies.

The goal of this article is to provide a detailed description of the protocol for the pulmonary metastasis assay (PuMA). This model permits researchers to study metastatic osteosarcoma (OS) cell growth in lung tissue using a widefield fluorescence or confocal laser-scanning microscope.

肺転移アッセイを用いた骨肉腫の肺転移を植民地化の勉強に実用的な考慮事項

The pulmonary metastasis assay (PuMA) is an ex vivo lung explant and closed cell culture system that permits researchers to study the biology of lung ...

The Establishment of a Lung Colonization Assay for Circulating Tumor Cell Visualization in Lung Tissues

Metastasis is the major cause of cancer death. The role of circulating tumor cells (CTCs) in promoting cancer metastasis, in which lung colonization by CTCs critically contributes to early lung metastatic processes, has been vigorously investigated. As such, animal models are the only approach that captures the full systemic process of metastasis. Given that problems occur in previous experimental designs for examining the contributions of CTCs to blood vessel extravasation, we established an in vivo lung colonization assay in which a long-term-fluorescence cell-tracer, carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE), was used to label suspended tumor cells and lung perfusion was performed to clear non-specifically trapped CTCs prior to lung removal, confocal imaging, and quantification. Polymeric fibronectin (polyFN) assembled on CTC surfaces has been found to mediate lung colonization in the final establishment of metastatic tumor tissues. Here, to specifically test the requirement of polyFN assembly on CTCs for lung colonization and extravasation, we performed short term lung colonization assays in which suspended Lewis lung carcinoma cells (LLCs) stably expressing FN-shRNA (shFN) or scramble-shRNA (shScr) and pre-labeled with 20 &#956;M of CFSE were intravenously inoculated into C57BL/6 mice. We successfully demonstrated that the abilities of shFN LLC cells to colonize the mouse lungs were significantly diminished in comparison to shScr LLC cells. Therefore, this short-term methodology may be widely applied to specifically demonstrate the ability of CTCs within the circulation to colonize the lungs.

An animal model is needed to decipher the role of circulating tumor cells (CTCs) in promoting lung colonization during cancer metastasis. Here, we established and successfully performed an in vivo assay to specifically test the requirement of polymeric fibronectin (polyFN) assembly on CTCs for lung colonization.

肺組織に腫瘍のセルの視覚化を循環させるため肺植民地化アッセイの確立

Metastasis is the major cause of cancer death. The role of circulating tumor cells (CTCs) in promoting cancer metastasis, in which lung colonization by ...

Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs

Metastasis is the main cause of cancer-related deaths and there are limited therapeutic options for patients with metastatic disease. The identification and testing of novel therapeutic targets that will facilitate the development of better treatments for metastatic disease requires preclinical in vivo models. Demonstrated here is a syngeneic mouse model for assaying breast cancer metastatic colonization and subsequent growth. Metastatic cancer cells are stably transduced with viral vectors encoding firefly luciferase and ZsGreen proteins. Candidate genes are then stably manipulated in luciferase/ZsGreen-expressing cancer cells and then the cells are injected into mice via the lateral tail vein to assay metastatic colonization and growth. An in vivo imaging device is then used to measure the bioluminescence or fluorescence of the tumor cells in the living animals to quantify changes in metastatic burden over time. The expression of the fluorescent protein allows the number and size of metastases in the lungs to be quantified at the end of the experiment without the need for sectioning or histological staining. This approach offers a relatively quick and easy way to test the role of candidate genes in metastatic colonization and growth, and provides a great deal more information than traditional tail vein metastasis assays. Using this approach, we show that simultaneous knockdown of Yes associated protein (YAP) and transcriptional co-activator with a PDZ-binding motif (TAZ) in breast cancer cells leads to reduced metastatic burden in the lungs and that this reduced burden is the result of significantly impaired metastatic colonization and reduced growth of metastases.

The described approach combines experimental tail vein metastasis assays with in vivo live animal imaging to allow real-time monitoring of breast cancer metastasis formation and growth in addition to the quantification of metastasis number and size in the lungs.

尾静脈転移アッセイとリアルタイムインビボイメージングの併用による乳癌転移性コロニー形成と肺の負担の定量化

Metastasis is the main cause of cancer-related deaths and there are limited therapeutic options for patients with metastatic disease. The identification ...

Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous metastasis models are available. Thus, the experimental metastasis model involving tail-vein injection of suitable cell lines is a mainstay of metastasis research. When cancer cells are injected into the lateral tail-vein, the lung is their preferred site of colonization. A potential limitation of this technique is the accurate quantification of the metastatic lung tumor burden. While some investigators count macrometastases of a pre-defined size and/or include micrometastases following sectioning of tissue, others determine the area of metastatic lesions relative to normal tissue area. Both of these quantification methods can be exceedingly difficult when the metastatic burden is high. Herein, we demonstrate an intravenous injection model of lung metastasis followed by an advanced method for quantifying metastatic tumor burden using image analysis software. This process allows for investigation of multiple end-point parameters, including average metastasis size, total number of metastases, and total metastasis area, to provide a comprehensive analysis. Furthermore, this method has been reviewed by a veterinary pathologist board-certified by the American College of Veterinary Pathologists (SEK) to ensure accuracy.

Intravenous injection of cancer cells is often used in metastasis research, but the metastatic tumor burden can be difficult to analyze. Herein, we demonstrate a tail-vein injection model of metastasis and include a novel approach to analyze the resulting metastatic lung tumor burden.

腫瘍細胞の横尾静脈注入後の肺転移の病理学的解析

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous ...

A Permanent Window for Investigating Cancer Metastasis to the Lung

Metastasis, accounting for ~90% of cancer-related mortality, involves the systemic spread of cancer cells from primary tumors to secondary sites such as the bone, brain, and lung. Although extensively studied, the mechanistic details of this process remain poorly understood. While common imaging modalities, including computed tomography (CT), positron emission tomography (PET), and magnetic resonance imaging (MRI), offer varying degrees of gross visualization, each lacks the temporal and spatial resolution necessary to detect the dynamics of individual tumor cells. To address this, numerous techniques have been described for intravital imaging of common metastatic sites. Of these sites, the lung has proven especially challenging to access for intravital imaging owing to its delicacy and critical role in sustaining life. Although several approaches have previously been described for single-cell intravital imaging of the intact lung, all involve highly invasive and terminal procedures, limiting the maximum possible imaging duration to 6-12 h. Described here is an improved technique for the permanent implantation of a minimally invasive thoracic optical Window for High-Resolution Imaging of the Lung (WHRIL). Combined with an adapted approach to microcartography, the innovative optical window facilitates serial intravital imaging of the intact lung at single-cell resolution across multiple imaging sessions and spanning multiple weeks. Given the unprecedented duration of time over which imaging data can be gathered, the WHRIL can facilitate the accelerated discovery of the dynamic mechanisms underlying metastatic progression and numerous additional biologic processes within the lung.

Here, we present a protocol for the surgical implantation of a permanently indwelling optical window for the murine thorax, which enables high-resolution, intravital imaging of the lung. The permanence of the window makes it well-suited to the study of dynamic cellular processes in the lung, especially those that are slowly evolving, such as metastatic progression of disseminated tumor cells.

肺への癌転移を調査するための永久的な窓

Metastasis, accounting for ~90% of cancer-related mortality, involves the systemic spread of cancer cells from primary tumors to secondary sites such as ...

In Vivo Imaging to Measure Spontaneous Lung Metastasis of Orthotopically-injected Breast Tumor Cells

Metastasis remains the primary cause of cancer-related death. The succession of events that characterize the metastatic cascade presents multiple opportunities for therapeutic intervention, and the ability to accurately model them in mice is critical to evaluate their effects. Here, a step-by-step protocol is presented for the establishment of orthotopic primary breast tumors and the subsequent monitoring of the establishment and growth of metastatic lesions in the lung using in vivo bioluminescence imaging. This methodology allows for the evaluation of treatment or its biological effects along the entire range of metastatic development, from primary tumor escape to outgrowth in the lungs. Breast orthotopic tumors are generated in mice via injection of a luciferase-labeled cell suspension in the 4th mammary gland. Tumors are allowed to grow and disseminate for a specific amount of time and are then surgically resected. Upon resection, spontaneous lung metastasis is detected, and the growth over time is monitored using in vivo bioluminescence imaging. At the desired experimental endpoint, lung tissue can be collected for downstream analysis. The treatment of established, clinically evident metastasis is critical to improve outcomes for stage IV cancer patients, and it can be evaluated through tail vein models of experimental lung metastasis. However, metastatic dissemination occurs early in breast cancer, and many patients have latent, subclinical disseminated disease after surgery. Utilization of spontaneous models such as this one provides the opportunity to study the whole spectrum of the disease, especially the systemic effects driven by treatment of the primary tumor such as pre-metastatic niche priming, and evaluate treatments on dormant and subclinical disease after surgery.

<meta charset="utf8"></head><body>同所性注射された乳房腫瘍細胞の自発的な肺転移を測定するためのin vivoイメージング

The manuscript describes a methodology for the establishment as well as longitudinal growth monitoring of spontaneous lung metastasis from orthotopically-injected breast tumors, amenable to intervention at all stages of the metastatic cascade.

無細胞性と細胞の肺転移モデル

要約

さらに動画を探す

この動画の章

肺腫瘍細胞募集試験

肝臓における大腸転移の高度な動物モデル：イメージング技術および転移性クローンのプロパティ

実験的転移とCTLの養子移入免疫療法のマウスモデル

肺転移アッセイを用いた骨肉腫の肺転移を植民地化の勉強に実用的な考慮事項

肺組織に腫瘍のセルの視覚化を循環させるため肺植民地化アッセイの確立

尾静脈転移アッセイとリアルタイムインビボイメージングの併用による乳癌転移性コロニー形成と肺の負担の定量化

腫瘍細胞の横尾静脈注入後の肺転移の病理学的解析

肺への癌転移を調査するための永久的な窓

インビボ同所注射された乳房腫瘍細胞の自然肺転移を測定するためのイメージング

インビボ同所注射された乳房腫瘍細胞の自然肺転移を測定するためのイメージング

無細胞性と細胞の肺転移モデル

要約

さらに動画を探す

この動画の章

肺腫瘍細胞募集試験

肝臓における大腸転移の高度な動物モデル：イメージング技術および転移性クローンのプロパティ

実験的転移とCTLの養子移入免疫療法のマウスモデル

肺転移アッセイを用いた骨肉腫の肺転移を植民地化の勉強に実用的な考慮事項

肺組織に腫瘍のセルの視覚化を循環させるため肺植民地化アッセイの確立

尾静脈転移アッセイとリアルタイムインビボイメージングの併用による乳癌転移性コロニー形成と肺の負担の定量化

腫瘍細胞の横尾静脈注入後の肺転移の病理学的解析

肺への癌転移を調査するための永久的な窓

インビボ 同所注射された乳房腫瘍細胞の自然肺転移を測定するためのイメージング

インビボ 同所注射された乳房腫瘍細胞の自然肺転移を測定するためのイメージング

インビボ同所注射された乳房腫瘍細胞の自然肺転移を測定するためのイメージング

インビボ同所注射された乳房腫瘍細胞の自然肺転移を測定するためのイメージング