Name: acellular and cellular lung model to study tumor metastasis
Uploaded: 2018-08-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Acellular and Cellular Lung Model to Study Tumor Metastasis at JoVE.com

Min s. Kim ikinci John W. Kirklin Araştırma Bursu, torasik cerrahi, Graham Araştırma Vakfı, Houston Methodist özel Hekim Group Grant ve Michael M. ve Joann H. koni Araştırma Ödülü Amerikan Derneği hibe destek aldı. Ann Saikin dil yazması düzenleme için teşekkür ediyoruz.

Hayvan deneyleri protokollerde kurumsal hayvan bakım ve Houston Methodist Araştırma Enstitüsü'nde kullanım Komitesi tarafından onaylanmış ve bütün mevzuatı, yasalara, kurallara ve politikaları uygun olarak yürütülmektedir.
1. fare akciğer hasat
<ol><li>4 - için 6-hafta-yaşlı erkek Sprague-Dawley rat ketamin (100 mg/kg) ve xylazine (10 mg/kg) onun kanadını içinde bir mayi (IP) enjeksiyonla anestezi. Anestezi ne zaman hind bacak ayak forseps ile boğumlu bir devamsızlık hareketi için kontrol ederek emin olun.</li>
	<li>10 dk sonra göğüs ve karın tıraş ve deri bir klorheksidin bez ile silin.</li>
	<li>Cilt o forseps ile tespit ve tek kullanımlık neşterle incising kaldırın. Neşter ile incising tarafından göğüs boşluğuna açtıktan sonra ikili torakotomi sol göğüs kafesinin ön tarafında ve diyafram sağ tarafına makasla keserek gerçekleştirin. Not: Bu bir hayatta kalma sigara cerrahidir.</li>
	<li>Göğüs kafesi tutun ve 2 mL heparin (1000 adet/mL) 27 G iğne kullanarak kalbi sağ ventrikül enjekte. Not: Bu herhangi bir akciğer kan pıhtı oluşumunu engeller.</li>
	<li>Tamamen göğüs kafesi makasla çıkarın ve kan çıkana kadar bir 18 G iğne sol ventrikül bir havalandırma yerleştirin. Sonra heparinized fosfat tamponlu tuz (12.5 adet/mL; heparinized PBS) 15 mL 25 G iğne kullanılarak sağ ventrikül enjekte.</li>
	<li>İnferior ve superior vena kava, kalbin sağ tarafta iki büyük damarları keser ve akciğerler ile 27 G iğne kullanılarak sağ ventrikül heparinized PBS ek bir 10 mL sifonu. Not: İnferior vena kava kalbimle büyük bir gemi olarak altında görüntülenir kırmızı kan ile dolu. Benzer şekilde, üstün vena cava kalp üst kısmında büyük bir beden olarak görüntülenir.</li>
	<li>Trakea tiroid tabanında kesti. Hemiazygos ven ve dalları Aort kemer düzeyinde azalan aort dikkatli bir şekilde çıkarın.</li>
	<li>Göğüs boşluğuna ve vücudun kalan kısmına sıçan kalp-akciğer bloğundan çıkar.</li>
	<li>Sağ ve sol ventriküllerin yarısı keserek ventriculotomy gerçekleştirmek ve özel yapım bir doldurulmuş 18 G paslanmaz çelik iğne kanül ile sağ ventrikül ana pulmoner arter (PA) yerleştirin.</li>
	<li>Kanül ile 2-0 ipek kravat güvenli ve dikkatlice sağ ventrikül ve atrium bulaşmasına neden.</li>
	<li>Bir kadın radarı bölme içinde sol ventrikül yerleştirin ve 2-0 ipek kravat ile sabitleyin.</li>
	<li>PA kanül aracılığıyla heparinized PBS kalp-akciğer bloğu ile 20 mL sifonu ve kültür ortamı veya heparinized PBS içeren bir 50 mL tüp içinde yerleştirin. Not: adım biyoreaktör ayarlamak için 3.1 hücresel bir modeli için gidin. Bir acellular modeli için adım 2.1 decellularization için devam edin.</li>
</ol>2. akciğer Decellularization
<ol><li>
Decellularization birim hazırlanması
	<ol>
<li>Her decellularization odası/şişe şişe kapağı iki delik delme ve delik (Şekil 1A ve 1B) bir kadın radarı yakalamaya hazırlayın. Diğer tarafta bir siyah naylon halka ile güvenli. Benzer şekilde, başka bir şişe kapağı intravenöz set eki (Şekil 1 c) için tek bir delik matkap. Not: İki farklı taraf aynı şişe kapağıyla Şekil 1A ve 1B vardır. 2.1.1. adımda yukarıda belirtildiği gibi tek bir delik ile farklı bir kap Şekil 1 c olduğunu.</li>
		<li>Şişe kapakları (Şekil 1A ve 1B) içinde kadın bir radarı (at pulmoner arter veya PA bitiş) 0.5-inç tüp ve 6 inçlik tüpler (Şekil 1J) ekleyin ve bir erkek radarı kilit biter takın. 500 mL şişe ile kilit decellularization odası/şişe ayarlayın.</li>
		<li>Pompa baş (1E rakam ve 1F) bir kadın radarı bir kartuşla (Şekil 1G) tarafından bağlı olduğu pompa tüp (Şekil 1 H), her iki ucunun (hangi erkek radarı kilit ile bağlı) 2 2 ft tüp bir ucunu takın kilit (Şekil 1I).</li>
		<li>2 ft tüpler (2.1.3. adımdaki) her kadın radarı kilit kafasına decellularization odası/şişe kapağı (Şekil 1 L) için diğer ucunu bağlayın.</li>
		<li>Ters bir şişe şişe kapağı ve decellularization c bağlı 2 ft tüp yerine distal son eklenen bir intravenöz set (Şekil 1 d) proksimal ucu olan bir stand üzerinde asılı tarafından PBS şişeyle (PBS 200 mL) 250 mL kurmak heparinized hamber/şişe PA sonunda (Şekil 1B). Bu 2 ft tüp atma biberondan bağlayın. Not: resim 1 Kiçinde gösterildiği gibi karton, şişeleri ayarlanır. İntravenöz tüpler reaktifler akciğer iskele içinde dağıtmak için asılı şişe çıkması.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Akciğer decellularization işlemi
	<ol>
<li>Decellularization odası/şişe içinde serbestçe akar kadar 30 mm Hg (Şekil 1 K) bir fizyolojik perfüzyon basıncı heparinized PBS'yi çalıştırmak ve sonra kalp-akciğer bloğu PA kanül PA sonuna ekleyin.</li>
		<li>Herhangi bir aşırı arabellek/çözüm decellularization odası/şişe içinde atılan böylece pompa sürekli olarak çalışır durumda tutun.</li>
		<li>PA, perfüzyon basıncı 30 mm Hg (Şekil 1 K) ilk yıkama için 15 dakika ile heparinized PBS'yi çalıştırmak.</li>
		<li>Deiyonize su % 0,1 Sodyum Lauryl Sülfat (SDS) heparinized PBS şişe yerine ve decellularization için 2 h için akciğer sıvı.</li>
		<li>Decellularization sonra 15 dk akciğer iskele deiyonize suyla autoclaved su sıvı.</li>
		<li>Sonra %1 non-iyonik deterjan 10 dk deiyonize su sıvı.</li>
		<li>Decellularization odası/şişe 500 mL autoclaved PBS 1 x antibiyotik (penisilin-streptomisin amfoterisin) ile desteklenmiş asılı akciğer içinde şişe kapağı ile olduğu gibi tutmak yerine.</li>
		<li>Ayarlama, decellularization odası pulmoner arter sonuna geri atarak kapsayıcıya bağlı 2 ft tüpü yerleştirmek ve 6 mL/dk (Şekil 1 L) pompa çalıştırmak Intravenous atmak.</li>
		<li>Akciğerler için 72 h sıvı ve antibiyotik her 12 h PBS değişen tutmak. Not: Acellular akciğer hemen kullanıma hazırdır. İhtiyaç kadar-80 ˚C depolanabilir. Akciğer lobları pembe lekeler veya kan pıhtıları açıkça görüntülenmeyecektir Eğer akciğer atmak. Rastgele DNA ve histopatoloji için test etmek mümkündür. Tam bir acellular akciğer hücreleri ve DNA'ın % 99.9 yıkanması göstermez. Not: bir hücresel akciğer modeli ile çalışırken, decellularization atlayın. Hasat akciğer (adım 1) doğrudan biyoreaktör ayarlayabilirsiniz.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. biyoreaktör Set-up
<ol><li>Biyoreaktör şişe ve kurulum için gereken maddeleri hazır olun.<ol>
<li>Bir 500 mL şişe kapağı eşit uzaklıkta, üç delik ve bir kadın radarı siyah naylon halkalar (Şekil 2A ve 2B) kullanarak tüm üç delik olarak düzeltin. Not: bir ucunu şişenin iç yüzleri ise iki delik radarı kilit yüz dışı sona erer.</li>
		<li>6 pompa Tüp, 2 tüp, Tüp, 1,5 ft Tüp, 2 ft tüp ve 10 ft oxygenator tüp 6 biyoreaktör kesilmiş.</li>
		<li>18 G paslanmaz çelik iğne kesin ve tekrar, trakeal kanül biyouyumlu boruları ile biter takın.</li>
		<li>Oxygenator tüp radarı kilit konektörler otoklav bantlar (Şekil 2C) kullanarak bir solenoid hasır üstünde belgili tanımlık etraf ile sarın.</li>
		<li>Otoklav yukarıda bahsedilen öğeleri ve UV 10 dakikadır ışık tutun.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Normal hücre kültür inkübatör (37 ° C, % 5 CO2) içinde pompa ile kolayca 500 mL şişe sığdırmak için tepsiler arasındaki uygun aralığı ayarlayın.</li>
	<li>% 70 etanol pompası çıkarma, sprey ve pompa boru dişi radarı kilit konektörler pompa her iki ucundaki ile bağlayın.</li>
	<li>Pompa tüp ve biyoreaktör 1,5 ft tüp ile diğer ucunu bir ucunu (çıkış) oxygenator bağlanarak solenoid tel örgü hücre kültür inkübatör içinde sarılı oxygenator ayarlayın.</li>
	<li>Bir Biyogüvenlik biyoreaktör şişede aseptik koşullar ile kabine ayarlayın.<ol>
<li>PA üzerinden akışını denetlemek için kadın yapma biri kafasına bir 3-yönlü stopcock (sarı) eklemek</li>
		<li>Tek yönlü stopcock (mavi) başka bir kadın radarı kilit bölme trakea (Şekil 2F) tohum hücre için bağlayın.</li>
		<li>2. Boru dış bağlanmak (beyaz) ve medya dışarı dolaşmaya şişe içine tüp 6. Erkek radarı kilit 2 ft tüp için uygun ve bir kadın radarı lug stil eklemek veya bir şey kaldırmak için erişilebilirlik sağlamak için Tee ekleyebilirsiniz.</li>
		<li>Tek yönlü bir stopcock üç yönlü konnektör (kadın radarı lug tarzı Tee) açıklıklar birine iliştirin.</li>
		<li>Erkek radarı kilit ve kadın radarı kilit 2 ft tüpler için ekleyin.</li>
		<li>RPMI1640 200 mL % 10 FBS ve % 1 antibiyotik hücre kültür (hücre şartının değişir) orta ile ekleyin ve biyoreaktör kuluçka makinesi için transfer. Oxygenator tüp iki açık ucu için (tek yönlü stopcock ve Tee bağlayıcı) kapalı çevrim biyoreaktör sağlamak üzere bağlayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>O hiçbir hava kabarcıkları boru içinde pompa 6 mL/dk içinde hücre kültür kuluçka hücre kültür oxygenator ve tüpler, doldurmak için medya ile önceden çalıştırın.</li>
	<li>Tüpler ile dolu bir kez medya, stopcock kapatın ve biyoreaktör şişe biyoreaktör şişe her iki ucunda Oksijenatörler keserek kuluçka makinesi kaldırın.</li>
	<li>Biyoreaktör şişe içinde Biyogüvenlik kabini koymak, Kültür medya stopcock yoluyla geçmek ve akciğer iskele (acellular veya hücresel) PA kanül stopcock erkek radarı Bağlayıcısı aracılığıyla ekleyin. Not: Burada (decellularization süreç sonrasında) acellular modeli veya taze hasat kalp-akciğer bloğu kullanmak mümkün (yani, hücresel modeli, o kadar yerli fare hücreleri korur).</li>
	<li>Kültür medya yoluyla herhangi bir hava kaldırmak ve trakea ipek iplik tarafından trakeal kanül kravat tek yönlü bir stopcock geçmek.</li>
	<li>Herhangi bir PA ve trakea büküm önlemek emin olun. Yakın biyoreaktör şişe kapağı ile akciğer içinde İskele yapısı ve, tekrar, aseptik biyoreaktör kuluçka makinesi için aktarmak ve 6 mL/dk hızında pompa başlatın.</li>
	<li>Kültür medya tüm lob şişirilmiş ve iyi durumda (Şekil 2 g) akciğer görünüyor emin olmak 10-15 dk için çalıştırın.</li>
</ol>4. metastaz modeli ve hücre tohumlama
Not: Yukarıdaki akciğer modeli için bir birincil tümör büyüme çalışma ile tohum hücre geçin. Akciğer İskele yapısı-İskele (acellular veya hücresel) metastatik modeli için aşağıdaki gibi değiştirin.
<ol><li>Biyoreaktör ile akciğer iskele kuluçka makinesi üzerinden çıkar ve biyogüvenlik kabine koymuştum.</li>
	<li>Nefes borusu yoluyla kültür ortamının 5 mL geçmek ve biyoreaktör kap asarak da açmak için bir radarı kilit şırınga kullanın akciğer İskele yapısı-İskele (Şekil 2F).</li>
	<li>Bu adımda, bir kişi daha akciğer değişiklik metastatik manken için yardımcı olmak için gereklidir.</li>
	<li>İpek 2-0 açısal forseps trakea geçmekle çatallanma noktada yapmak için kullanın ve hazır olsun.</li>
	<li>Sağ akciğer çatallanma noktada olacak trakea kravat ve kültür ortamı geçirerek medya Sol akciğer için nefes borusu yoluyla serbest akışını kontrol edin. Not: trakea çatallanma noktada bağlı sonra nefes borusu seribaşı hücreleri otomatik olarak tohum sol lob için yönlendirilirsiniz. Bu hücreleri tohum önce nefes borusu yoluyla bastırıyor Kültür medya tarafından test edilebilir. Metastatik modelinde, medya sadece, şişirmek, sol lob ve sağ lob10hareket edecek.</li>
	<li>20 mL radarı kilit şırınga trakeal kanül üstüne ayarlayın ve RPMI1640 komple Kültür Medya (Şekil 2F) 50 mL ATCC akciğer kanseri hücreleri (A549, H1299) ekleyin.</li>
	<li>Biyogüvenlik kabini tohum hücre gerçekleştirin. Hücre 15 mL şırıngada ekleyin ve yerçekimi tarafından akciğer loblar geçmek. Herhangi bir hava kabarcıkları ile geçirmeden hücreleri geri kalanını ekleyin.</li>
	<li>Acellular akciğer tohum, biyoreaktör şişede damlama perfused medya toplamak ve nefes borusu tekrar 3 x geçmek izin. Not: Perfused medya bazen numaralı seribaşı kanser hücreleri vardır. Bu nedenle, verimli tohum için medya tekrar borusunda şırınga yerine koy.</li>
	<li>Seribaşı sonra şırınga kaldırmak için 15 dakika bekleyin, taze medya eklemek ve biyoreaktör kuluçka geri dönmek. Herhangi bir hava kabarcıkları boru içinde kaldırın.</li>
	<li>6 mL/dk medya sıvı pompa başlatın.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+Statistics,+2017.">Cancer Statistics, 2017.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 67 (1), 7-30 (2017).</li><li>Torre, L. A., Siegel, R. L., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+Cancer+Statistics.">Lung Cancer Statistics.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 893, 1-19 (2016).</li><li>Lallo, A., Schenk, M. W., Frese, K. K., Blackhall, F., Dive, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+cells+and+CDX+models+as+a+tool+for+preclinical+drug+development.">Circulating tumor cells and CDX models as a tool for preclinical drug development.</a> Translational Lung Cancer Research. 6 (4), 397-408 (2017).</li><li>Yang, S., Zhang, J. J., Huang, X. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+for+tumor+metastasis.">Mouse models for tumor metastasis.</a> Methods in Molecular Biology. 928, 221-228 (2012).</li><li>Bissell, M. J., Hines, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+don't+we+get+more+cancer?+A+proposed+role+of+the+microenvironment+in+restraining+cancer+progression.">Why don't we get more cancer? A proposed role of the microenvironment in restraining cancer progression.</a> Nature Medicine. 17 (3), 320-329 (2011).</li><li>Francia, G., Cruz-Munoz, W., Man, S., Xu, P., Kerbel, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+advanced+spontaneous+metastasis+for+experimental+therapeutics.">Mouse models of advanced spontaneous metastasis for experimental therapeutics.</a> Nature Reviews Cancer. 11 (2), 135-141 (2011).</li><li>Mishra, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+lung+cancer+cells+grown+in+an+ex+vivo+3D+lung+model+produce+matrix+metalloproteinases+not+produced+in+2D+culture.">Human lung cancer cells grown in an ex vivo 3D lung model produce matrix metalloproteinases not produced in 2D culture.</a> PloS One. 7 (9), e45308 (2012).</li><li>Vishnoi, M., Mishra, D. K., Thrall, M. J., Kurie, J. M., Kim, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+cells+from+a+4-dimensional+lung+cancer+model+are+resistant+to+cisplatin.">Circulating tumor cells from a 4-dimensional lung cancer model are resistant to cisplatin.</a> The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 148 (3), 1056-1063 (2014).</li><li>Mishra, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+profile+of+A549+cells+from+tissue+of+4D+model+predicts+poor+prognosis+in+lung+cancer+patients.">Gene expression profile of A549 cells from tissue of 4D model predicts poor prognosis in lung cancer patients.</a> International Journal of Cancer. Journal International du Cancer. , (2013).</li><li>Mishra, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+four-dimensional+lung+cancer+model+mimics+metastasis.">Ex vivo four-dimensional lung cancer model mimics metastasis.</a> The Annals of Thoracic Surgery. 99 (4), 1149-1156 (2015).</li><li>Mishra, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+lung+cancer+cells+grown+on+acellular+rat+lung+matrix+create+perfusable+tumor+nodules.">Human lung cancer cells grown on acellular rat lung matrix create perfusable tumor nodules.</a> The Annals of Thoracic Surgery. 93 (4), 1075-1081 (2012).</li><li>Pence, K. A., Mishra, D. K., Thrall, M., Dave, B., Kim, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+cancer+cells+form+primary+tumors+on+ex+vivo+four-dimensional+lung+model.">Breast cancer cells form primary tumors on ex vivo four-dimensional lung model.</a> Journal of Surgical Research. 210, 181-187 (2017).</li><li>Mishra, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Lung+Fibroblasts+Inhibit+Non-Small+Cell+Lung+Cancer+Metastasis+in+Ex+Vivo+4D+Model.">Human Lung Fibroblasts Inhibit Non-Small Cell Lung Cancer Metastasis in Ex Vivo 4D Model.</a> The Annals of Thoracic Surgery. 100 (4), 1167-1174 (2015).</li><li>Mishra, D. K., Miller, R. A., Pence, K. A., Kim, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+cell+and+non+small+cell+lung+cancer+form+metastasis+on+cellular+4D+lung+model.">Small cell and non small cell lung cancer form metastasis on cellular 4D lung model.</a> BMC Cancer. 18 (1), 441 (2018).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Ex vivo 4-D akciğer tümör büyüme ve metastaz bir laboratuvar tuzak içinde çalışma olanağı sağlar. Bir yerel akciğer matris normal doku için destek sağlar ve hücre-hücre etkileşimleri, hücre-matris etkileşimleri, hücresel başkalaşım ve doku organizasyon korur karmaşık bir sistemdir. Tümör büyüme üzerindeki etkileri ve diğer hücreleri ile etkileşim çalışmaya herhangi bir tümör microenvironment bileşenleri eklemek için bir fırsat sağlar.
Akciğe...

Kanser metastaz çoğu kanser ölümler arkasında suçlu olduğunu ve son meydan kanser mücadele çalışmalarında teşkil etmektedir. Bu yöntem genel amacı yanı sıra üç boyutlu (3-b) hücre büyüme akışının bir boyut olan bir dört boyutlu (4 D) hücre kültürü için bir protokol tasarlamaktır. Metastaz işlemi [yani, tümör hücreleri (CTCs) ve metastatik lezyonlar dolaşan birincil tümörün] üç farklı aşamalarında temsil eder.
Son üç yılda dünya çapında bilim geliştirilmiş bir tedavi mi, yoksa ilerleme-Alerjik yaşam beklentisi farklı kanser metastatik ilerlemesinde temel mekanizmaları anlamak için bilgi benzersiz bir zenginlik vermiştir. Meme kanseri gibi bazı kanser türleri klinik yönetiminin1önemli ölçüde geliştirilmiş; Ancak, akciğer kanseri gibi bazı kanser türleri hala zavallı hayatta kalma2var. Vitro ve in vivo hayvan modelleri yeni görüşler hastalık gelişimi destekleyecek mekanizmalar oluşturmak için vesile olmuştur. Son birkaç yıl içinde xenografts (CDX) satır elde edilen hücre ve hasta elde edilen xenografts (PDX) birincil insan tümör3, büyüme kinetik gibi birçok ilgili özellikleri histolojik özellikleri, davranış korumak gibi daha fazla ilgi olmuştur özellikleri ve tedaviye yanıt. Ancak, her model CTC oluşumu ve metastaz uzak organ4,5,6mekanizmasını anlamak için kendi sınırlamaları vardır.
Son zamanlarda, organ yeniden yapılanma ve perfüzyon tabanlı hücre kültürü kavramı kullanarak bir 4-D ex vivo akciğer kanseri modeli geliştirdik. Zaman içinde kanser salgılanan benzer bir insanla büyümek perfusable tümör nodüller oluşturarak insan akciğer kanser büyüme taklit eden protein üretim7. Kanserli hastalarda zavallı hayatta kalma öngörür ve ayrıca sisplatin tedavisi8,9üzerine tümör regresyon tarafından tedavi edici bir yanıt gösteren gen ifade imza temsil eder. Metastatik lezyonlar oluşturabilir böylece akciğer modeli daha da güncellenmiştir. CTCs birincil tümör ve intravasate damarlara geliştirmek ve metastatik lezyonlar10kurmaya kontralateral akciğer extravasate. Gen ifadesi çalışmaları birincil tümör, CTCs ve metastatik lezyonlar farklı ifade profil ve fenotip10için gerekli genler alt kümesini upregulation öneririm. Kanserli hastalarda görülen biyolojik koşulların varlığı nedeniyle metastatik bu işlem gerçekleşir. Bu modelin avantajı, doğal bir matris ve mimari varlığı ve tümör nodüller oluşumuna yol açar bir perfüzyon besin olduğunu. Buna ek olarak, aynı zamanda farklı bileşenleri tümör microenvironment veya uyuşturucu etkileri, tümör gelişimi zaman içinde çalışma olanağı sağlar. Bu model bir Aralık kanser hücrelerinin (akciğer kanseri, meme kanseri, sarkom vb) bir laboratuvar kurulumu büyümeye kullanılabilir.

<table><tbody><tr><td>Sprague Dowley rat</td><td>Harlan</td><td>206M</td><td>Male</td></tr><tr><td>Chlorhexidine swab</td><td>Prevantics, NY, USA</td><td>NDC 10819-1080-1</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sagent Pharmaceuticals, Schaumburg, IL, USA</td><td>NDC 25021-400-10</td><td></td></tr><tr><td>18-gauge needle</td><td>McMaster Carr, USA</td><td>75165A249</td><td></td></tr><tr><td>2-0 silk tie</td><td>Ethicon, San Angelo, TX, USA</td><td>A305H</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S pump</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>EW-07554-80</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S pump head</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>EW-07519-05</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S pump cartridge</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>EW-07519-70</td><td></td></tr><tr><td>Tygon Tube</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>14171211</td><td></td></tr><tr><td>MasterFlex Pump tube</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>06598-16</td><td></td></tr><tr><td>Female luer lock connectors</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>45508-34</td><td>75165A249</td></tr><tr><td>Male luer lock connectors</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>45513-04</td><td></td></tr><tr><td>black nylon ring</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>EW-45509-04</td><td></td></tr><tr><td>Intravenous set</td><td>CareFusion</td><td>41134E</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>CAS151-21-3</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-1L</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotics</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>Silicone oxygenator</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>ABW00011</td><td>Saint-GoBain-</td></tr><tr><td>Wire mesh</td><td>1164610105</td><td>Lowes</td><td>New York Wire</td></tr><tr><td>Female luer Lug Style TEE</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>45508-56</td><td></td></tr><tr><td>Male luer integral lock ring to 200series Barb</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>45518-08</td><td></td></tr><tr><td>Female luer thread style coupler</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>45508-22</td><td></td></tr><tr><td>Clave connector</td><td>ICU Medical</td><td>11956</td><td></td></tr><tr><td>Hi-Flo &amp;trade;4-way Stopcock w/swivel male luer lock</td><td>smith Medical</td><td>MX9341L</td><td></td></tr><tr><td>MasterFlex Pump tube</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>06598-13</td><td>for cannula</td></tr></tbody></table>

acellular and cellular lung model to study tumor metastasis

Tümör hücrelerinin tümör progresyon farklı noktalarda ayırmak zordur. Biz tümör hücreleri doğal bir matris ile etkileşim ve besin sürekli akışı gösterebilir bir ex vivo akciğer modeli, hem de tümör hücreleri normal hücresel bileşenleri ile etkileşim ve doğal bir matris gösterir bir model oluşturdu. Acellular ex vivo akciğer modeli bir sıçan kalp-akciğer bloğu izole edip decellularization işlemini kullanarak tüm hücreleri çıkarmadan oluşturulur. Sağ ana bronş kapalı bağladılar ve tümör hücreleri borusunda bir şırınga tarafından yerleştirilir. Hücreleri taşımak ve sol akciğer doldurmak. Akciğer sonra nerede bir kapalı devre içinde sürekli bir akış medya, pulmoner arter alır bir biyoreaktör yerleştirilir. Sol akciğer yetiştirilen birincil tümör tümördür. Dolaşımdaki medyada izole tümör hücrelerinin tümör hücreleri dolaşan vardır ve sağ akciğer tümör hücrelerinde metastatik lezyonlar vardır. Hücresel ex vivo akciğer modeli decellularization işleminin atlayarak oluşturulur. Her model farklı araştırma soruları cevaplamak için kullanabilirsiniz.

Sıçan gelen hasat akciğer sağlam damarlara ve alveoller11 (Şekil 3A ve 3B) tutar. Decellularization, kolajen, fibronektin ve elastin, gibi bir acellular akciğer hücre dışı matriks bileşenlerinin11 (Şekil 3 c, 3D, 3Eve 3F) korunur. Decellularization yerli fare hücreleri mevcut Hematoksilen ve eozin (H & ...

Watch this Scientific Journal Video about Acellular and Cellular Lung Model to Study Tumor Metastasis at JoVE.com

Acellular and Cellular Lung Model to Study Tumor Metastasis

Tümör metastazı çalışmaya acellular ve hücresel akciğer modeli

Burada, tümör hücreleri ve metastatik lezyonlar dolaşan bir protokol tümör progresyon adımları taklit eder ve birincil tümörün izole etmek için yardımcı olan bir ex vivo akciğer kanseri modeli için mevcut.

It is difficult to isolate tumor cells at different points of tumor progression. We created an ex vivo lung model that can show the interaction of tumor ...

acellular-and-cellular-lung-model-to-study-tumor-metastasis

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Cancer Research

7.5K Görüntüleme.  Houston Methodist Hospital Research Institute. Burada, tümör hücreleri ve metastatik lezyonlar dolaşan bir protokol tümör progresyon adımları taklit eder ve birincil tümörün izole etmek için yardımcı olan bir ex vivo akciğer kanseri modeli için mevcut.

Video: Acellular and Cellular Lung Model to Study Tumor Metastasis

Lung Tumor Cell Recruitment Assay

To investigate the molecular mechanisms governing tumor metastasis, various assays using the mouse as a model animal have been proposed. Here, we demonstrate a simple assay to evaluate tumor cell extravasation or micrometastasis. In this assay, tumor cells were injected through the tail vein, and after a short period, the lungs were dissected and digested to count the accumulated labeled tumor cells. This assay skips the initial step of primary tumor invasion into the blood vessel and facilitates the study of events in the distant organ where tumor metastasis occurs. The number of cells injected into the blood vessel can be optimized to observe a limited number of metastases. It has been reported that stromal cells in the distant organ contribute to metastasis. Thus, this assay could be a useful tool to explore potential therapeutic drugs or devices for prevention of tumor metastasis.

This manuscript describes a method to quantify tumor cell accumulation in the lungs in an animal model of tumor metastasis.

Akciğer tümör hücre işe alım tahlil

To investigate the molecular mechanisms governing tumor metastasis, various assays using the mouse as a model animal have been proposed. Here, we ...

Kanser Araştırmaları

Advanced Animal Model of Colorectal Metastasis in Liver: Imaging Techniques and Properties of Metastatic Clones

Patients with a limited number of hepatic metastases and slow rates of progression can be successfully treated with local treatment approaches1,2. However, little is known about the heterogeneity of liver metastases, and animal models capable of evaluating the development of individual metastatic colonies are needed. Here, we present an advanced model of hepatic metastases that provides the ability to quantitatively visualize the development of individual tumor clones in the liver and estimate their growth kinetics and colonization efficiency. We generated a panel of monoclonal derivatives of HCT116 human colorectal cancer cells stably labeled with luciferase and tdTomato and possessing different growth properties. With a splenic injection followed by a splenectomy, the majority of these clones are able to generate hepatic metastases, but with different frequencies of colonization and varying growth rates. Using the In Vivo&#160;Imaging System (IVIS), it is possible to visualize and quantify metastasis development with in vivo luminescent and ex vivo fluorescent imaging. In addition, Diffuse Luminescent Imaging Tomography (DLIT) provides a 3D distribution of liver metastases in vivo. Ex vivo fluorescent imaging of harvested livers provides quantitative measurements of individual hepatic metastatic colonies, allowing for the evaluation of the frequency of liver colonization and the growth kinetics of metastases. Since the model is similar to clinically observed liver metastases, it can serve as a modality for detecting genes associated with liver metastasis and for testing potential ablative or adjuvant treatments for liver metastatic disease.

The ability of metastatic clones to colonize distant sites depends on their proliferation capacity and/or their ability to survive in the host microenvironment without significant proliferation. Here, we present an animal model that allows quantitative visualization of both types of liver colonization by metastatic clones.

İleri Hayvan Karaciğer Kolorektal Metastaz Model: Görüntüleme Teknikleri ve Metastatik Klonların Özellikleri

Patients with a limited number of hepatic metastases and slow rates of progression can be successfully treated with local treatment approaches1,2. ...

Experimental Metastasis and CTL Adoptive Transfer Immunotherapy Mouse Model

Experimental metastasis mouse model is a simple and yet physiologically relevant metastasis model. The tumor cells are injected intravenously (i.v) into mouse tail veins and colonize in the lungs, thereby, resembling the last steps of tumor cell spontaneous metastasis: survival in the circulation, extravasation and colonization in the distal organs. From a therapeutic point of view, the experimental metastasis model is the simplest and ideal model since the target of therapies is often the end point of metastasis: established metastatic tumor in the distal organ. In this model, tumor cells are injected i.v into mouse tail veins and allowed to colonize and grow in the lungs. Tumor-specific CTLs are then injected i.v into the metastases-bearing mouse. The number and size of the lung metastases can be controlled by the number of tumor cells to be injected and the time of tumor growth. Therefore, various stages of metastasis, from minimal metastasis to extensive metastasis, can be modeled. Lung metastases are analyzed by inflation with ink, thus allowing easier visual observation and quantification.

An experimental lung metastasis and CTL immunotherapy mouse model for analysis of tumor cells-T cell interaction in vivo.

Deneysel metastaz ve CTL Kabul edilmiş Transfer İmmünoterapi Fare Modeli

Experimental metastasis mouse model is a simple and yet physiologically relevant metastasis model. The tumor cells are injected intravenously (i.v) into ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Practical Considerations in Studying Metastatic Lung Colonization in Osteosarcoma Using the Pulmonary Metastasis Assay

The pulmonary metastasis assay (PuMA) is an ex vivo lung explant and closed cell culture system that permits researchers to study the biology of lung colonization in osteosarcoma (OS) by fluorescence microscopy. This article provides a detailed description of the protocol, and discusses examples of obtaining image data on metastatic growth using widefield or confocal fluorescence microscopy platforms. The flexibility of the PuMA model permits researchers to study not only the growth of OS cells in the lung microenvironment, but also to assess the effects of anti-metastatic therapeutics over time. Confocal microscopy allows for unprecedented, high-resolution imaging of OS cell interactions with the lung parenchyma. Moreover, when the PuMA model is combined with fluorescent dyes or fluorescent protein genetic reporters, researchers can study the lung microenvironment, cellular and subcellular structures, gene function, and promoter activity in metastatic OS cells. The PuMA model provides a new tool for osteosarcoma researchers to discover new metastasis biology and assess the activity of novel anti-metastatic, targeted therapies.

The goal of this article is to provide a detailed description of the protocol for the pulmonary metastasis assay (PuMA). This model permits researchers to study metastatic osteosarcoma (OS) cell growth in lung tissue using a widefield fluorescence or confocal laser-scanning microscope.

Metastatik akciğer kolonizasyon pulmoner metastaz tahlil kullanarak osteosarkom içinde eğitim pratik düşünceler

The pulmonary metastasis assay (PuMA) is an ex vivo lung explant and closed cell culture system that permits researchers to study the biology of lung ...

The Establishment of a Lung Colonization Assay for Circulating Tumor Cell Visualization in Lung Tissues

Metastasis is the major cause of cancer death. The role of circulating tumor cells (CTCs) in promoting cancer metastasis, in which lung colonization by CTCs critically contributes to early lung metastatic processes, has been vigorously investigated. As such, animal models are the only approach that captures the full systemic process of metastasis. Given that problems occur in previous experimental designs for examining the contributions of CTCs to blood vessel extravasation, we established an in vivo lung colonization assay in which a long-term-fluorescence cell-tracer, carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE), was used to label suspended tumor cells and lung perfusion was performed to clear non-specifically trapped CTCs prior to lung removal, confocal imaging, and quantification. Polymeric fibronectin (polyFN) assembled on CTC surfaces has been found to mediate lung colonization in the final establishment of metastatic tumor tissues. Here, to specifically test the requirement of polyFN assembly on CTCs for lung colonization and extravasation, we performed short term lung colonization assays in which suspended Lewis lung carcinoma cells (LLCs) stably expressing FN-shRNA (shFN) or scramble-shRNA (shScr) and pre-labeled with 20 &#956;M of CFSE were intravenously inoculated into C57BL/6 mice. We successfully demonstrated that the abilities of shFN LLC cells to colonize the mouse lungs were significantly diminished in comparison to shScr LLC cells. Therefore, this short-term methodology may be widely applied to specifically demonstrate the ability of CTCs within the circulation to colonize the lungs.

An animal model is needed to decipher the role of circulating tumor cells (CTCs) in promoting lung colonization during cancer metastasis. Here, we established and successfully performed an in vivo assay to specifically test the requirement of polymeric fibronectin (polyFN) assembly on CTCs for lung colonization.

Tümör hücre görselleştirme akciğer dokusu içinde dolaşan bir akciğer kolonizasyon tahlil kurulması

Metastasis is the major cause of cancer death. The role of circulating tumor cells (CTCs) in promoting cancer metastasis, in which lung colonization by ...

Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs

Metastasis is the main cause of cancer-related deaths and there are limited therapeutic options for patients with metastatic disease. The identification and testing of novel therapeutic targets that will facilitate the development of better treatments for metastatic disease requires preclinical in vivo models. Demonstrated here is a syngeneic mouse model for assaying breast cancer metastatic colonization and subsequent growth. Metastatic cancer cells are stably transduced with viral vectors encoding firefly luciferase and ZsGreen proteins. Candidate genes are then stably manipulated in luciferase/ZsGreen-expressing cancer cells and then the cells are injected into mice via the lateral tail vein to assay metastatic colonization and growth. An in vivo imaging device is then used to measure the bioluminescence or fluorescence of the tumor cells in the living animals to quantify changes in metastatic burden over time. The expression of the fluorescent protein allows the number and size of metastases in the lungs to be quantified at the end of the experiment without the need for sectioning or histological staining. This approach offers a relatively quick and easy way to test the role of candidate genes in metastatic colonization and growth, and provides a great deal more information than traditional tail vein metastasis assays. Using this approach, we show that simultaneous knockdown of Yes associated protein (YAP) and transcriptional co-activator with a PDZ-binding motif (TAZ) in breast cancer cells leads to reduced metastatic burden in the lungs and that this reduced burden is the result of significantly impaired metastatic colonization and reduced growth of metastases.

The described approach combines experimental tail vein metastasis assays with in vivo live animal imaging to allow real-time monitoring of breast cancer metastasis formation and growth in addition to the quantification of metastasis number and size in the lungs.

Kuyruk Ven Metastaz Tahlilleri ve Gerçek Zamanlı Vivo Görüntüleme Kombine Kullanımı Meme Kanseri Metastatik Kolonizasyon ve Yük Akciğerlerde Quantify için

Metastasis is the main cause of cancer-related deaths and there are limited therapeutic options for patients with metastatic disease. The identification ...

Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous metastasis models are available. Thus, the experimental metastasis model involving tail-vein injection of suitable cell lines is a mainstay of metastasis research. When cancer cells are injected into the lateral tail-vein, the lung is their preferred site of colonization. A potential limitation of this technique is the accurate quantification of the metastatic lung tumor burden. While some investigators count macrometastases of a pre-defined size and/or include micrometastases following sectioning of tissue, others determine the area of metastatic lesions relative to normal tissue area. Both of these quantification methods can be exceedingly difficult when the metastatic burden is high. Herein, we demonstrate an intravenous injection model of lung metastasis followed by an advanced method for quantifying metastatic tumor burden using image analysis software. This process allows for investigation of multiple end-point parameters, including average metastasis size, total number of metastases, and total metastasis area, to provide a comprehensive analysis. Furthermore, this method has been reviewed by a veterinary pathologist board-certified by the American College of Veterinary Pathologists (SEK) to ensure accuracy.

Intravenous injection of cancer cells is often used in metastasis research, but the metastatic tumor burden can be difficult to analyze. Herein, we demonstrate a tail-vein injection model of metastasis and include a novel approach to analyze the resulting metastatic lung tumor burden.

Tümör Hücrelerinin Lateral Kuyruk-Damar Enjeksiyonu Sonrasında Akciğer Metastazının Patolojik Analizi

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous ...

A Permanent Window for Investigating Cancer Metastasis to the Lung

Metastasis, accounting for ~90% of cancer-related mortality, involves the systemic spread of cancer cells from primary tumors to secondary sites such as the bone, brain, and lung. Although extensively studied, the mechanistic details of this process remain poorly understood. While common imaging modalities, including computed tomography (CT), positron emission tomography (PET), and magnetic resonance imaging (MRI), offer varying degrees of gross visualization, each lacks the temporal and spatial resolution necessary to detect the dynamics of individual tumor cells. To address this, numerous techniques have been described for intravital imaging of common metastatic sites. Of these sites, the lung has proven especially challenging to access for intravital imaging owing to its delicacy and critical role in sustaining life. Although several approaches have previously been described for single-cell intravital imaging of the intact lung, all involve highly invasive and terminal procedures, limiting the maximum possible imaging duration to 6-12 h. Described here is an improved technique for the permanent implantation of a minimally invasive thoracic optical Window for High-Resolution Imaging of the Lung (WHRIL). Combined with an adapted approach to microcartography, the innovative optical window facilitates serial intravital imaging of the intact lung at single-cell resolution across multiple imaging sessions and spanning multiple weeks. Given the unprecedented duration of time over which imaging data can be gathered, the WHRIL can facilitate the accelerated discovery of the dynamic mechanisms underlying metastatic progression and numerous additional biologic processes within the lung.

Here, we present a protocol for the surgical implantation of a permanently indwelling optical window for the murine thorax, which enables high-resolution, intravital imaging of the lung. The permanence of the window makes it well-suited to the study of dynamic cellular processes in the lung, especially those that are slowly evolving, such as metastatic progression of disseminated tumor cells.

Akciğere Kanser Metastazını Araştırmak İçin Kalıcı Bir Pencere

Metastasis, accounting for ~90% of cancer-related mortality, involves the systemic spread of cancer cells from primary tumors to secondary sites such as ...

In Vivo Imaging to Measure Spontaneous Lung Metastasis of Orthotopically-injected Breast Tumor Cells

Metastasis remains the primary cause of cancer-related death. The succession of events that characterize the metastatic cascade presents multiple opportunities for therapeutic intervention, and the ability to accurately model them in mice is critical to evaluate their effects. Here, a step-by-step protocol is presented for the establishment of orthotopic primary breast tumors and the subsequent monitoring of the establishment and growth of metastatic lesions in the lung using in vivo bioluminescence imaging. This methodology allows for the evaluation of treatment or its biological effects along the entire range of metastatic development, from primary tumor escape to outgrowth in the lungs. Breast orthotopic tumors are generated in mice via injection of a luciferase-labeled cell suspension in the 4th mammary gland. Tumors are allowed to grow and disseminate for a specific amount of time and are then surgically resected. Upon resection, spontaneous lung metastasis is detected, and the growth over time is monitored using in vivo bioluminescence imaging. At the desired experimental endpoint, lung tissue can be collected for downstream analysis. The treatment of established, clinically evident metastasis is critical to improve outcomes for stage IV cancer patients, and it can be evaluated through tail vein models of experimental lung metastasis. However, metastatic dissemination occurs early in breast cancer, and many patients have latent, subclinical disseminated disease after surgery. Utilization of spontaneous models such as this one provides the opportunity to study the whole spectrum of the disease, especially the systemic effects driven by treatment of the primary tumor such as pre-metastatic niche priming, and evaluate treatments on dormant and subclinical disease after surgery.

<meta charset="utf8"></head><body>Ortotopik Olarak Enjekte Edilen Meme Tümörü Hücrelerinin Spontan Akciğer Metastazını Ölçmek için İn Vivo Görüntüleme

The manuscript describes a methodology for the establishment as well as longitudinal growth monitoring of spontaneous lung metastasis from orthotopically-injected breast tumors, amenable to intervention at all stages of the metastatic cascade.