Gli autori ringraziano Linnea Tankred e Diana Rydholm per la zootecnia.

Cuccioli di topo BALB/c di entrambi i sessi sono stati utilizzati secondo l'istruzione per l'uso degli animali in oftalmologica e Vision Research, e i protocolli sono stati approvati dal comitato di Stoccolma per la ricerca etica animale. Topi sono stati alloggiati in cucciolate, insieme a madre durante l'allattamento, con un ciclo giorno/notte di 12 h, libero accesso a cibo e acqua e monitorati giornalmente.
Nota: Per la procedura chirurgica, topi sono stati tenuti sotto anestesia con isoflurano volatile. Pomate oculari sono sconsigliati durante procedure oculari, come potrebbero interferire con i trattamenti e sostanze utilizzate. Se necessario, per evitare che dell'occhio secco, può essere applicata una goccia di soluzione salina normale sterile. Anche se uveal punture sono auto-guarigione, cura è stata presa durante uveale forature per garantire la sterilità con strumenti chirurgici. Trattamento post-chirurgico incluso idratazione con soluzione salina normale per via sottocutanea e analgesia con somministrazione topica oculare del cloridrato del tetracaine. I cuccioli hanno permesso di recuperare in decubito sternale su un rilievo di riscaldamento prima di essere restituito alla madre durante allattamento, in una gabbia pulita. Cucciolate erano tenute con la stessa madre di professione d'infermiera per evitare lo stress.
1. anestesia
<ol><li>Preparare la camera di induzione di anestesia, per somministrare anestetico isoflurano e garantire che una maschera di piccolo topo è anche accoppiata. Nota: Eseguire esperimenti su animali tutti d'accordo con tutti i permessi etici applicabili.</li>
	<li>Riempire la camera di induzione con 3-4% isoflurane volatili nell'aria atmosferica. Nota: Diverse sostanze anestetiche diversa isoflurane possono essere utilizzate, secondo etici permessi. Procedure di anestetiche volatile devono essere eseguite su un cappuccio ventilato panca o fumi.</li>
	<li>Posizionare un cucciolo di topo BALB/c di postnatale (P) 12.5-giorno-vecchio nella camera di induzione. Confermare che l'apparato di anestesia è pronto a consegnare isoflurano alla camera di induzione. Nota: Mouse cuccioli sono fragili e meglio gestito per la collottola. Tenere i cuccioli insieme come una cucciolata o con madre durante l'allattamento per evitare lo stress.</li>
	<li>Consentire il cucciolo essere completamente anestetizzato.</li>
	<li>Delicatamente, ritirare il cucciolo di topo per la collottola. Nota: Tenere la camera di induzione chiusa a tutte le volte per induzione sicuro e stabile.</li>
	<li>Trasferire il mouse alla maschera del roditore. Assicurarsi di passare il flusso di anestetico dal vano di induzione alla maschera quando si sposta il mouse.</li>
	<li>Eseguire un pizzico di punta per confermare l'anestesia.</li>
</ol>2. procedura sotto stereoscopio chirurgico di puntura
<ol><li>Posizionare il mouse nella posizione di decubito laterale. Confermare che la maschera è ben posizionata, quindi l'occhio del mouse è nel campo di vista dello stereoscopio.</li>
	<li>Ruotare delicatamente la testa del mouse così l'occhio è rivolto verso lo stereoscopio. Nota: Chiara messa a fuoco dell'occhio dovrebbe essere realizzato sotto lo stereoscopio. Per il posizionamento, è raccomandato un ingrandimento di 16x, mentre 40 X deve essere utilizzato per eseguire la procedura chirurgica. Se permessi etici lo consentono, tagliare la punta dei baffi può facilitare la visualizzazione dell'occhio.</li>
	<li>Utilizzando piccolo legatura forcipe, sporgono attentamente occhio di pup applicando una pressione al ribasso per le palpebre dorsale e ventrale per l'occhio.</li>
	<li>Mantenere una stretta gentile ma ferma della palpebra di pup, con piccole pinze. Nota: È consigliabile eseguire la protrusione dell'occhio ed il coperchio con la mano non dominante, come la mano dominante deve eseguire la procedura di puntura.</li>
	<li>Utilizzare lo stereoscopio per individuare il limbus cornea. Limbus BALB/c Albino possono essere facilmente identificati dal plesso vascolare circolare posteriore alla cornea.</li>
	<li>Con un ago smussato 0,25 mm diametro (30 G), è necessario eseguire una piccola puntura uveal, vicino al limite di limbal posteriore del uvea. Usare solo la punta dell'ago, e non più di metà lo smusso (equivalente a 0,5 mm), puntura dell'uvea. Se eseguito correttamente, le punture uveale sono auto-sigillanti, eppure l'iniezione intraoculare di sostanze di studio possa essere somministrato attraverso la stessa ferita di puntura. Nota: Se vissuto con anatomia oculare del mouse, la puntura uveal viene eseguita tra il corpo ciliare e ora serrata. Deve prestare attenzione durante l'esecuzione della puntura uveal per evitare la rottura della lente.</li>
	<li>Eseguire la seconda puntura uveal nel lato opposto dell'occhio dal primo sito di puntura. Ottimizzare la distanza e la posizione delle punture; Considera 12 e 6 punture, con 12 essendo come dorsale come possibile.</li>
	<li>Ripetere la procedura di forature uveal ogni quattro giorni fino al P24.5. Prima di ogni successiva puntura uveal, monitorare lo stato degli animali prestando particolare attenzione alla presenza di cataratta traumatica a causa di danni lente durante la puntura uveal, o evidente diminuita pressione oculare. Obiettivo per l'esecuzione di forature ripetere alle stesse posizioni come precedente forature per gli effetti ottimali.</li>
</ol>3. non invasiva in Vivo monitoraggio
<ol><li>Prima della puntura o iniezioni ogni giorno sperimentale, anestetizzare il mouse come eseguita sopra.</li>
	<li>Con il mouse nella posizione di decubito laterale, sporgono delicatamente l'occhio.</li>
	<li>Concentrarsi sul sistema vascolare iris con lo stereoscopio chirurgico.</li>
	<li>Scattare una foto del vasculature iride con una telecamera montata lo stereoscopio chirurgico. Nota: Anche se non necessario, inducendo meiosi può essere utile per normalizzare la zona di iris per animale. Prendere in considerazione etici permessi quando si seleziona un agente d'induzione meiosi. Messa a fuoco accurata del vasculature iris faciliterà ulteriormente analisi quantitativa. È consigliabile una magnitudo di 40x.</li>
</ol>4. post-operatorio
<ol><li>Rimuovere il pup BALB/c dalla maschera del roditore e trasferirlo delicatamente un Termoforo a strati con una stuoia chirurgica.</li>
	<li>Deporre una goccia di soluzione di 1% tetracaina occhi forati. Nota: Altre soluzioni analgesici possono essere utilizzati, secondo etici permessi.</li>
	<li>Idratare l'animale con un'iniezione sottocutanea di 200 µ l di soluzione salina normale sterile.</li>
	<li>Tornare il cucciolo alla madre durante allattamento in una gabbia pulita del mouse.</li>
	<li>Monitorare il processo di recupero. Il cucciolo dovrebbe essere in grado di deambulate e tornare alla lettiera.</li>
</ol>5. occhio Enucleation
<ol><li>Eutanasia animale di dislocazione cervicale. Per una migliore visualizzazione della procedura, eseguire enucleazione e dissezione sotto uno stereoscopio. Nota: Eutanasia diverse procedure possono essere utilizzate. Si raccomanda di attenersi rigorosamente alle etici permessi.</li>
	<li>Separare le palpebre per migliorare l'esposizione all'occhio.</li>
	<li>Fare un piccolo taglio (circa 0,5 cm) vicino canthus dei coperchi dell'occhio con le forbici curve occhio di Bonn.</li>
	<li>Utilizzare lo spazio periocular esposta per inserire micro forcipe legatura dietro (sotto) il mondo nell'orbita.</li>
	<li>Afferrare il tessuto che circonda l'occhio e tirare delicatamente verso l'alto. Evitare reggendo il bulbo oculare, usare i tessuti circostanti più vicino per lo zoccolo dell'occhio.</li>
	<li>Inserire le forbici curve di Bonn occhio dietro il globo oculare nell'orbita.</li>
	<li>Tagliare i tessuti circostanti fino a quando l'occhio è rilasciato dalla presa di corrente. Nota: Questa tecnica di dissezione mantiene anatomia dell'occhio e successiva analisi di benefici.</li>
	<li>Procedere alla rimozione del tessuto estraneo dall'occhio. La rimozione del tessuto estraneo può essere eseguita dopo la correzione, se si preferisce. Nota: Topi BALB/c sono melanina carente, di conseguenza, per aumentare il contrasto, uno sfondo scuro è consigliato per facilitare la procedura di dissezione.</li>
	<li>Brevemente sciacquare l'intero-occhio in una capsula Petri riempito con soluzione fisiologica sterile di tampone fosfato (PBS).</li>
	<li>Trasferire l'occhio in una provetta 2 mL contenente 1,5 mL di soluzione di formalina tamponata 4%.</li>
	<li>Difficoltà l'occhio per 6 ore a temperatura ambiente. Nota: Fissaggio conferisce la rigidità del tessuto e facilita la dissezione dell'iride. Tempo di fissaggio deve essere testato e regolato per diverse applicazioni.</li>
</ol>6. Iris dissezione procedura sotto stereoscopio
<ol><li>Rimuovere la soluzione fissante dal tubo con una pipetta di Pasteur plastica 1,5 mL (o simili) e sciacquare l'occhio tre volte con PBS fresco.</li>
	<li>Posto l'occhio fisso in una liscia superficie asciutta (stand di dissezione) con camera anteriore rivolto verso l'alto.</li>
	<li>Con un ago 30g smussato, eseguire un punto di ingresso posteriore al limbus.</li>
	<li>Tenendo il segmento anteriore con piccolo legatura forcipe, inserire un suggerimento di Forbici rette Clayman-Allerød nell'apertura creata in precedenza. Nota: Si consiglia di controllare il forcipe con la mano non dominante e la forbice con il dominante.</li>
	<li>Durante la rotazione dell'occhio con il forcipe legatura, tagliare intorno al limbus per rimuovere il segmento posteriore dell'occhio. Nota: Eseguire i tagli parziale consentirà la punta interna delle forbici per continuare nel tessuto e notevolmente facilita il processo.</li>
	<li>Posizionare il segmento anteriore rivolta verso il basso, esponendo la lente.</li>
	<li>Rimuovere attentamente l'obiettivo afferrandolo con piccole pinze e tirando verso l'alto. Nota: Un ago smussato può essere utilizzato per puntura e tirare la lente.</li>
	<li>Posizionare il segmento anteriore con la cornea rivolto verso il basso e il taglio perpendicolare al campo di vista.</li>
	<li>Afferrare delicatamente il tessuto posteriore al corpo ciliare con le piccole pinze di legature.</li>
	<li>Con Forbici rette Clayman-Allerød, procedere a tagliare solo anteriore al corpo ciliare per rimuovere il trabecolato e isolare l'iride. Verificare che sia stato rimosso il trabecolato; l'iride dovrebbe muoversi all'interno della cornea.</li>
	<li>Trasferire con cautela l'oculare anteriore con le piccole pinze legature, che tiene la cornea, di una piastra a 96 pozzetti contenenti 200 µ l di PBS.</li>
	<li>Continuare a tenere la cornea nel pozzo e sezionare l'iride sciacquando con PBS con una pipetta. Nota: Se l'iride rimane aderente alla cornea, alcuni trabecolato potrebbe essere presente e la smussatura di un ago 30g utilizzabile per aiutare spostando l'iride.</li>
	<li>Rimuovere la cornea dal 96-well con le piccole pinze di legature e mantenere l'iride isolato nel pozzo per ulteriore analisi.</li>
	<li>Conservare i campioni digalleggiante iris a 4 ° C. Nota: Pur essendo fisso, stoccaggio a lungo termine dei campioni digalleggiante iris non è raccomandato.</li>
</ol>7. possibili letture sperimentali
<ol><li>Per visualizzare i vasi sanguigni nelle iridi dissecate, utilizzare digalleggiante intero-monta immunohistochemistry, metodi per gli indicatori quali la molecola di adesione delle cellule endoteliali della piastrina (PECAM) -1 di colorazione o isolectin B4. In alternativa, è possibile utilizzare aspersione del corpo intero con la macchiatura vascolare, quali destrani con etichetta fluorescente ad alto peso molecolare.</li>
	<li>Utilizzare in vivo non invasiva immagini per eseguire in silico piatto-montaggio e quantificare il sistema vascolare completo iris con software di imaging appropriato. Nota: Sistema vascolare può essere quantificato sia in vivo che in vitro, mediante densitometria o con sistema vascolare analisi software9.</li>
	<li>Elaborare l'intero bulbo oculare per acidi nucleici ed estrazione di proteine, seguita da metodi di PCR o immunoblotting, per eseguire l'analisi molecolare degli occhi forati. Nota: L'analisi molecolare dei tessuti migliore viene eseguita con il tessuto non fissa, ma la dissezione dell'iride non fissa è estremamente impegnativa e l'uso dell'occhio intero ha reso risultati statisticamente significativi in precedenti studi8.</li>
</ol>

<ol>
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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Nel presente protocollo, è presentato un nuovo metodo per l'induzione della risposta vascolare iris dalla puntura uveal. La puntura innesca meccanismi di guarigione della ferita e promuove le risposte vascolari nei iris10,11. Questo è in accordo con patologie oculari, quali PDR e NVG, dove risposte angiogeniche esacerbato dalla retina nel segmento posteriore dell'occhio culminano con lo stato clinico di rubeosis iridis, una maggiore vascolarizzazione dell'iride...

L'iride, insieme con il corpo ciliare e coroide, comprende dell'uvea, che è il tessuto più vascolarizzato dell'occhio. Sistema vascolare Iris è essenziale nel mantenimento dell'omeostasi nell'alloggiamento anteriore dell'occhio. A seguito di abbondanti connessioni anastomotiche tra le arterie e le vene, i vasi sanguigni di iris fornire nutrienti e apporto di ossigeno non solo per l'iride stessa, ma per l'intero segmento anteriore dell' occhio1.
La formazione di nuovi vasi sanguigni, o l'angiogenesi da quelle pre-esistenti, è fondamentale nei processi fisiologici, quali sviluppo e2di guarigione della ferita. L'angiogenesi è finemente regolata da una moltitudine di fattori canoniche, come fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF) e l'inibitore dell'attivatore del plasminogeno (PAI), così come molteplici fattori infiammatori e uno squilibrio di questi fattori può portare a patologica l'angiogenesi3.
Nell'occhio, la neovascolarizzazione è la causa di malattie avvistare-minaccioso, come retinopatia diabetica proliferative (PDR) e glaucoma neovascolare (NVG). In queste malattie oculari, la neovascolarizzazione focale si trova comunemente in tessuto retinico, ma lo squilibrio in infiammatorie e fattori angiogenici in entrambi i posteriori ed anteriori chambers oculare dell'occhio è stato associato con rubeosis iridis, il termine clinico per iris neoangiogenesi patologica4. Queste patologie indicano la capacità dell'adulto iride a subire l'angiogenesi. Nei topi, sistema vascolare oculare è immaturo dopo la nascita e continua maturazione post-partum. Questa peculiarità di sviluppo viene sfruttata nel modello del topo di retinopatia indotta da ossigeno, un modello che imita molto attentamente le condizioni cliniche della retinopatia della prematurità5. Inoltre, l'angiogenesi e l'infiammazione gioca un ruolo fondamentale nella guarigione meccanismi6e cicatrizzazione stessa è stata associata con l'angiogenesi modelli7.
In questo studio, descriviamo un modello del neovascularization dell'iride indotta da puntura. Uveale forature vengono eseguite nei pressi del limite esterno del limbus, che indurre il neovascularization dell'iride attivando il sistema di guarigione della ferita. Grazie alla trasparenza della cornea, sistema vascolare iride può essere analizzato facilmente in vivo di metodi non invasivi. Forato occhi presentano un aumento del letto vascolare nell'iride, che è stato associato con un aumento dell'attivazione del plasminogeno e indicatori infiammatori8. Il modello presentato ha un grande potenziale come un nuovo strumento per studiare l'angiogenesi e angiogenici composti di screening e permette la visualizzazione diretta in vivo dei processi angiogenici.

<table><tbody><tr><td>Bonn eye scissors</td><td>Bausch &amp;amp; Lomb</td><td>23060</td><td></td></tr><tr><td>Clayman-Vannas curved scissors</td><td>Bausch &amp;amp; Lomb</td><td>E3383 C</td><td></td></tr><tr><td>Clayman-Vannas straight scissors</td><td>Bausch &amp;amp; Lomb</td><td>E3383 S</td><td></td></tr><tr><td>Objective adapter for camera</td><td>Handcrafted</td><td>N/A</td><td>Or any system that allows adapting a camera to the microscope</td></tr><tr><td>Heating Pad 100-110 watts</td><td>Non Applicable</td><td>N/A</td><td>Available in pet/veterinarian stores</td></tr><tr><td>Hypodermic 30g beveled needle</td><td>KDM GmBH germany</td><td>911914</td><td></td></tr><tr><td>Iphone 4S</td><td>Apple</td><td>Non Applicable</td><td>Or other high resolution image acquistion device</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Baxter</td><td>KDG 9623</td><td></td></tr><tr><td>McPherson tying forceps</td><td>Bausch &amp;amp; Lomb</td><td>E1815 S</td><td></td></tr><tr><td>Micro tying forceps</td><td>Bausch &amp;amp; Lomb</td><td>63140</td><td></td></tr><tr><td>Minims tetracaine hydrochloride</td><td>Bausch &amp;amp; Lomb</td><td>N/A</td><td>1 % (w/v) Eye Drops</td></tr><tr><td>Neutral-buffered formalin</td><td>Bioreagens</td><td>0018-40</td><td></td></tr><tr><td>Normal saline solution</td><td>Fresenius Kabi</td><td>210352</td><td>0.9 % (w/v) NaCl in injectable water</td></tr><tr><td>Phosphate-buffered saline</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10010023</td><td>Balanced and buffered PBS pH 7.4</td></tr><tr><td>Petri dish 10 cm</td><td>Starstedt</td><td>83.3902</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish 3 cm</td><td>Starstedt</td><td>83.3900</td><td></td></tr><tr><td>Safe Seal Tube 2.0 mL</td><td>Starstedt</td><td>72.685.200</td><td>Or any eppendorf style tubes</td></tr><tr><td>TC plate 96-well</td><td>Starstedt</td><td>83.3924</td><td></td></tr><tr><td>Transfer pipette 3.5 mL</td><td>Starstedt</td><td>86.1171</td><td>Or any other Pasteur pipette style</td></tr><tr><td>Univentor 400 anesthesia unit</td><td>Univentor Limited</td><td>N/A</td><td>Or equivalent flow regulator with induction chamber and mask for volatile anesthesia</td></tr><tr><td>Wild M650 surgical microscope</td><td>Wild Heerbrugg</td><td>N/A</td><td>Or other surgical or magnifying stereoscope</td></tr></tbody></table>

puncture-induced iris neovascularization as a mouse model of rubeosis iridis

Descriviamo un modello del neovascularization dell'iride indotta da puntura come un modello generale per la valutazione non invasiva dell'angiogenesi. Il modello è anche rilevante per il targeting glaucoma neovascolare, una complicazione avvistare-minacciosa di retinopatia diabetica. Questo metodo si basa sull'induzione della risposta vascolare iris da una serie di forature autosigillante uveale su topi BALB/c e sfrutta la maturazione post-partum del vasculature oculare del mouse. Cuccioli di mouse subiscono uveale forature da giorno postnatale 12.5, naturalmente quando i cuccioli aprono i loro occhi, fino al giorno postnatale 24,5. Grazie alla trasparenza della cornea, sistema vascolare iride può essere analizzato facilmente attraverso il tempo con metodi non invasiva in vivo . Inoltre, l'iride semitrasparente di topi BALB/c può essere flatmounted per l'analisi dettagliata immunohistologic con la colorazione di fondo minimo non specifici. In questo modello, l'angiogenesi è determinata essenzialmente dall'infiammatorio e sistemi di attivazione del plasminogeno. Il modello indotta da puntura è il primo per indurre il neovascularization dell'iride in piccoli roditori e ha il vantaggio di consentire analisi diretta non invasiva in vivo del processo angiogenico. Inoltre, il modello può essere abbinato angiogenici modulante sostanze, che evidenzia il suo potenziale nello studio dell'angiogenesi con una prospettiva in vivo .

Cuccioli di topo BALB/c Albino alle p 12.5 sono stati sottoposti a forature uveale, ripetute ogni quarto giorno (sperimentale giorno 0, 4, 8, 12), fino al P24.5. A P27.5, topi sono stati eutanasizzati e iridi attentamente sezionato (sperimentale giorno 15). Foto degli occhi del mouse sono state scattate con una videocamera fissata ad uno stereoscopio chirurgico prima di ogni serie di puntura in ogni giorno sperimentale per valutare la valutazione non invasiva della risposta vascolare iris...

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Puncture-Induced Iris Neovascularization as a Mouse Model of Rubeosis Iridis

Neovascularization dell'iride, una complicazione comune della malattia della retina ischemica, può portare ad avvistare-minaccioso il glaucoma neovascular. Qui, descriviamo un protocollo murino per indurre il neovascularization iris sperimentali che possono essere utilizzati per la valutazione non invasiva delle sostanze l'angiogenesi di modulazione.

Puntura-indotta di Neovascularization dell'iride come un modello murino di Rubeosis Iridis

We describe a model of puncture-induced iris neovascularization as a general model for noninvasive evaluation of angiogenesis. The model is also relevant ...

puncture-induced-iris-neovascularization-as-mouse-model-rubeosis

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Medicine

8.7K Views.  Karolinska Institutet. Neovascularization dell'iride, una complicazione comune della malattia della retina ischemica, può portare ad avvistare-minaccioso il glaucoma neovascular. Qui, descriviamo un protocollo murino per indurre il neovascularization iris sperimentali che possono essere utilizzati per la valutazione non invasiva delle sostanze l'angiogenesi di modulazione.

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A Mouse Model for Laser-induced Choroidal Neovascularization

The mouse laser-induced choroidal neovascularization (CNV) model has been a crucial mainstay model for neovascular age-related macular degeneration (AMD) research. By administering targeted laser injury to the RPE and Bruch&#8217;s membrane, the procedure induces angiogenesis, modeling the hallmark pathology observed in neovascular AMD. 
First developed in non-human primates, the laser-induced CNV model has come to be implemented into many other species, the most recent of which being the mouse. Mouse experiments are advantageously more cost-effective, experiments can be executed on a much faster timeline, and they allow the use of various transgenic models. The miniature size of the mouse eye, however, poses a particular challenge when performing the procedure. Manipulation of the eye to visualize the retina requires practice of fine dexterity skills as well as simultaneous hand-eye-foot coordination to operate the laser. However, once mastered, the model can be applied to study many aspects of neovascular AMD such as molecular mechanisms, the effect of genetic manipulations, and drug treatment effects. 
The laser-induced CNV model, though useful, is not a perfect model of the disease. The wild-type mouse eye is otherwise healthy, and the chorio-retinal environment does not mimic the pathologic changes in human AMD. Furthermore, injury-induced angiogenesis does not reflect the same pathways as angiogenesis occurring in an age-related and chronic disease state as in AMD.
Despite its shortcomings, the laser-induced CNV model is one of the best methods currently available to study the debilitating pathology of neovascular AMD. Its implementation has led to a deeper understanding of the pathogenesis of AMD, as well as contributing to the development of many of the AMD therapies currently available.

Here, we present the mouse laser-induced choroidal neovascularization (CNV) protocol, an experimental model that re-creates the vascular hallmarks of neovascular age-related macular degeneration (AMD). Once mastered, it can reliably and effectively induce CNV as a model system to test various experimental measures.

Un modello di topo per Laser-indotta della coroide neovascolarizzazione

The mouse laser-induced choroidal neovascularization (CNV) model has been a crucial mainstay model for neovascular age-related macular degeneration (AMD) ...

Ricerca

Medicina

A Mouse Model of Retinal Ischemia-Reperfusion Injury Through Elevation of Intraocular Pressure

Retinal ischemia-reperfusion (I/R) is a pathophysiological process contributing to cellular damage in multiple ocular conditions, including glaucoma, diabetic retinopathy, and retinal vascular occlusions. Rodent models of I/R injury are providing significant insights into mechanisms and treatment strategies for human I/R injury, especially with regard to neurodegenerative damage in the retinal neurovascular unit. Presented here is a protocol for inducing retinal I/R injury in mice through elevation of intraocular pressure (IOP). In this protocol, the ocular anterior chamber is cannulated with a needle, through which flows the drip of an elevated saline reservoir. Using this drip to raise IOP above systolic arterial blood pressure, a practitioner temporarily halts inner retinal blood flow (ischemia). When circulation is reinstated (reperfusion) by removal of the cannula, severe cellular damage ensues, resulting ultimately in retinal neurodegeneration. Recent studies demonstrate inflammation, vascular permeability, and capillary degeneration as additional elements of this model. Compared to alternative retinal I/R methodologies, such as retinal arterial ligation, retinal I/R injury by elevated IOP offers advantages in its&#160;anatomical specificity, experimental tractability, and technical accessibility, presenting itself as a valuable tool for examining neuronal pathogenesis and therapy in the retinal neurovascular unit.

This article describes a procedure for inducing retinal ischemia-reperfusion injury by elevated intraocular pressure in mice. Retinal ischemia-reperfusion injury by elevated intraocular pressure serves to model human pathologies characterized by compromised oxygen and nutrient delivery in the retina, enabling researchers to examine potential cellular mechanisms and treatments for human diseases of the retinal neurovascular unit.

Un modello murino di retina ischemia-riperfusione lesioni a causa di aumento della pressione intraoculare

Retinal ischemia-reperfusion (I/R) is a pathophysiological process contributing to cellular damage in multiple ocular conditions, including glaucoma, ...

In Vivo Multimodal Imaging and Analysis of Mouse Laser-Induced Choroidal Neovascularization Model

Laser-induced choroidal neovascularization (CNV) is a well-established model to mimic the wet form of age-related macular degeneration (AMD). In this protocol, we aim to guide the reader not simply through the technical considerations of generating laser-induced lesions to trigger neovascular processes, but rather focus on the powerful information that can be obtained from multimodal longitudinal in vivo imaging throughout the follow-up period.
The laser-induced mouse CNV model was generated by a diode laser administration. Multimodal in vivo imaging techniques were used to monitor CNV induction, progression and regression. First, spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) was performed immediately after the lasering to verify a break of Bruch&#39;s membrane. Subsequent in vivo imaging using fluorescein angiography (FA) confirmed successful damage of Bruch&#39;s membrane from serial images acquired at the choroidal level. Longitudinal follow-up of CNV proliferation and regression on days 5, 10, and 14 after the lasering was performed using both SD-OCT and FA. Simple and reliable grading of leaky CNV leasions from FA images is&#160;presented. Automated segmentation for measurement of total retinal thickness, combined with manual caliber application for measurement of retinal thickness at CNV sites, allow unbiased evaluation of the presence of edema. Finally, histological verification of CNV is performed using isolectin GS-IB4 staining on choroidal flatmounts. The staining is thresholded, and the isolectin-positive area is calculated with ImageJ.
This protocol is especially useful in therapeutics studies requiring high-throughput-like screening of CNV pathology as it allows fast, multimodal, and reliable classification of CNV pathology and retinal edema. In addition, high resolution SD-OCT enables the recording of other pathological hallmarks, such as the accumulation of subretinal or intraretinal fluid. However, this method does not provide a possibility to automate CNV volume analysis from SD-OCT images, which has to be performed manually.

In Vivo Multimodal Imaging and Analysis of Mouse Laser-Induced Choroidal Neovascularization Model

Here, we present the usefulness of longitudinal in vivo imaging in the follow-up of morphological changes of laser-induced choroidal neovascularization in mice.

In Vivo Imaging multimodale e l'analisi di Mouse indotta da Laser modello di Neovascularization coroidico

Laser-induced choroidal neovascularization (CNV) is a well-established model to mimic the wet form of age-related macular degeneration (AMD). In this ...

Neuroscienze

A Model of Glaucoma Induced by Circumlimbal Suture in Rats and Mice

The circumlimbal suture is a technique for inducing experimental glaucoma in rodents by chronically elevating intraocular pressure (IOP), a well-known risk factor for glaucoma. This protocol demonstrates a step-by-step guide on this technique in Long Evans rats and C57BL/6 mice. Under general anesthesia, a "purse-string" suture is applied on the conjunctiva, around the equator and behind the limbus of the eye. The fellow eye serves as an untreated control. Over the duration of our study, which was a period of 8 weeks for rats and 12 weeks for mice, IOP remained elevated, as measured regularly by rebound tonometry in conscious animals without topical anesthesia. In both species, the sutured eyes showed electroretinogram features consistent with preferential inner retinal dysfunction. Optical coherence tomography showed selective thinning of the retinal nerve fiber layer. Histology of the rat retina in cross-section found reduced cell density in the ganglion cell layer, but no change in other cellular layers. Staining of flat-mounted mouse retinae with a ganglion cell specific marker (RBPMS) confirmed ganglion cell loss. The circumlimbal suture is a simple, minimally invasive and cost-effective way to induce ocular hypertension that leads to ganglion cell injury in both rats and mice.

Chronic ocular hypertension is induced by applying a circumlimbal suture in rats and mice, leading to functional and structural deterioration of the retinal ganglion cells consistent with glaucoma.

Un modello del Glaucoma indotto da sutura Circumlimbal nei ratti e nei topi

The circumlimbal suture is a technique for inducing experimental glaucoma in rodents by chronically elevating intraocular pressure (IOP), a well-known ...

Optimization of the Retinal Vein Occlusion Mouse Model to Limit Variability

Mouse models of retinal vein occlusion (RVO) are often used in ophthalmology to study hypoxic-ischemic injury in the neural retina. In this report, a detailed method pointing out critical steps is provided with recommendations for optimization to achieve consistently successful occlusion rates across different genetically modified mouse strains. The RVO mouse model consists primarily of the intravenous administration of a photosensitizer dye followed by laser photocoagulation using a retinal imaging microscope attached to an ophthalmic guided laser. Three variables were identified as determinants of occlusion consistency. By adjusting the wait time after rose bengal administration and balancing the baseline and experimental laser output, the variability across experiments can be limited and a higher success rate of occlusions achieved. This method can be used to study retinal diseases that are characterized by retinal edema and hypoxic-ischemic injury. Additionally, as this model induces vascular injury, it can also be applied to study the neurovasculature, neuronal death, and inflammation.

Here, we describe an optimized protocol for retinal vein occlusion using rose bengal and a laser-guided retinal imaging microscope system with recommendations to maximize its reproducibility in genetically modified strains.

Ottimizzazione del modello murino di occlusione venosa retinica per limitare la variabilità

Mouse models of retinal vein occlusion (RVO) are often used in ophthalmology to study hypoxic-ischemic injury in the neural retina. In this report, a ...

Oxygen-Induced Retinopathy Model for Ischemic Retinal Diseases in Rodents

One of the commonly used models for ischemic retinopathies is the oxygen-induced retinopathy (OIR) model. Here we describe detailed protocols for the OIR model induction and its readouts in both mice and rats. Retinal neovascularization is induced in OIR by exposing rodent pups either to hyperoxia (mice) or alternating levels of hyperoxia and hypoxia (rats). The primary readouts of these models are the size of neovascular (NV) and avascular (AVA) areas in the retina. This preclinical in vivo model can be used to evaluate the efficacy of potential anti-angiogenic drugs or to address the role of specific genes in the retinal angiogenesis by using genetically manipulated animals. The model has some strain and vendor specific variation in the OIR induction which should be taken into consideration when designing the experiments.

Oxygen-induced retinopathy (OIR) can be used to model ischemic retinal diseases such as retinopathy of prematurity and proliferative diabetic retinopathy and to serve as a model for proof-of-concept studies in evaluating antiangiogenic drugs for neovascular diseases. OIR induces robust and reproducible neovascularization in the retina that can be quantified.

Modello di retinopatia indotta dall'ossigeno per le malattie retiniche ischemiche nei roditori

One of the commonly used models for ischemic retinopathies is the oxygen-induced retinopathy (OIR) model. Here we describe detailed protocols for the OIR ...

Quantification of Vascular Parameters in Whole Mount Retinas of Mice with Non-Proliferative and Proliferative Retinopathies

Retinopathies are a heterogeneous group of diseases that affect the neurosensory tissue of the eye. They are characterized by neurodegeneration, gliosis&#160;and a progressive change in vascular function and structure. Although the onset of the retinopathies is characterized by subtle disturbances in visual perception, the modifications in the vascular plexus are the first signs detected by clinicians. The absence or presence of neovascularization determines whether the retinopathy is classified as either non-proliferative (NPDR) or proliferative (PDR). In this sense, several animal models tried to mimic specific vascular features of each stage to determine the underlying mechanisms involved in endothelium alterations, neuronal death and other events taking place in the retina. In this article, we will provide a complete description of the procedures required for the measurement of retinal vascular parameters in adults and early birth mice at postnatal day (P)17. We will detail the protocols to carry out retinal vascular staining with Isolectin GSA-IB4 in whole mounts for later microscopic visualization. Key steps for image processing with Image J Fiji software are also provided, therefore, the readers will be able to measure vessel density, diameter and tortuosity, vascular branching, as well as avascular and neovascular areas. These tools are highly helpful to evaluate and quantify vascular alterations in both non-proliferative and proliferative retinopathies.

This article describes a well-established and reproducible lectin stain assay for the whole mount retinal preparations and the protocols required for the quantitative measurement of vascular parameters frequently altered in proliferative and non-proliferative retinopathies.

Quantificazione dei parametri vascolari nelle retine a montaggio intero di topi con retinopatie non proliferative e proliferative

Retinopathies are a heterogeneous group of diseases that affect the neurosensory tissue of the eye. They are characterized by neurodegeneration, ...

Full-Circle Cauterization of Limbal Vascular Plexus for Surgically Induced Glaucoma in Rodents

Glaucoma, the second leading cause of blindness worldwide, is a heterogeneous group of ocular disorders characterized by structural damage to the optic nerve and retinal ganglion cell (RGC) degeneration, resulting in visual dysfunction by interrupting the transmission of visual information from the eye to the brain. Elevated intraocular pressure is the most important risk factor; thus, several models of ocular hypertension have been developed in rodents by either genetic or experimental approaches to investigate the causes and effects of the disease. Among those, some limitations have been reported such as surgical invasiveness, inadequate functional assessment, requirement of extensive training, and highly variable extension of retinal damage. The present work characterizes a simple, low-cost, and efficient method to induce ocular hypertension in rodents, based on low-temperature, full-circle cauterization of the limbal vascular plexus, a major component of aqueous humor drainage. The new model provides a technically easy, noninvasive, and reproducible subacute ocular hypertension, associated with progressive RGC and optic nerve degeneration, and a unique post-operative clinical recovery rate that allows in vivo functional studies by both electrophysiological and behavioral methods.

The goal of this protocol is to characterize a novel model of glaucomatous neurodegeneration based on 360&#176; thermic cauterization of limbal vascular plexus, inducing subacute ocular hypertension.

Cauterizzazione a cerchio completo del plesso vascolare limbare per il glaucoma indotto chirurgicamente nei roditori

Glaucoma, the second leading cause of blindness worldwide, is a heterogeneous group of ocular disorders characterized by structural damage to the optic ...

<meta charset="utf8"></head><body>Modello murino per lesione da ischemia-riperfusione retinica per studiare le patologie retiniche

Induction of Retinal Ischemia-Reperfusion Injury in a Mouse Eye Model

Ischemia-reperfusion injuries are known to cause a range of retinal pathologies, including diabetic retinopathy, glaucoma, retinal vascular occlusions, and other vaso-occlusive conditions. This manuscript presents a method for inducing ischemia-reperfusion injury in a mouse model. The method utilized anterior chamber cannulation attached to a saline reservoir, generating hydrostatic pressure to raise the intraocular pressure to 90-100 mmHg. This method effectively caused constriction of retinal capillaries to induce retinal ischemia. At the end of the ischemic period (60 min), the intraocular pressure was normalized (&#8804;20 mmHg) before removing the cannula from the anterior chamber to initiate reperfusion. Days after the ischemia/reperfusion procedure, the eyes were collected and sectioned for histological staining. The histopathology of the retinal sections was scored by evaluating eight parameters of retinal injury: folds, hemorrhage, deformation, cell loss in the ganglion cell, inner nuclear, outer nuclear, and photoreceptor layers, and damage to retinal pigment epithelial cells. This method provided a reproducible model to study the mechanisms and pathology of retinal ischemia/reperfusion injury. In addition, this model can facilitate the discovery of potential therapeutic targets to treat retinal ischemia/reperfusion injury, advancing the study of retinal pathologies and improving patient outcomes.

<meta charset="utf8"></head><body>Induzione di lesioni da ischemia-riperfusione retinica in un modello di occhio murino

This protocol models retinal ischemia-reperfusion injury in a mouse eye by inducing retinal ischemia via anterior chamber cannulation and intraocular pressure elevation, followed by intraocular pressure normalization to initiate the reperfusion.

Induzione di lesioni da ischemia-riperfusione retinica in un modello di occhio murino

Ischemia-reperfusion injuries are known to cause a range of retinal pathologies, including diabetic retinopathy, glaucoma, retinal vascular occlusions, ...

Puntura-indotta di Neovascularization dell'iride come un modello murino di Rubeosis Iridis

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Un modello di topo per Laser-indotta della coroide neovascolarizzazione

Un modello murino di retina ischemia-riperfusione lesioni a causa di aumento della pressione intraoculare

In Vivo Imaging multimodale e l'analisi di Mouse indotta da Laser modello di Neovascularization coroidico

Un modello del Glaucoma indotto da sutura Circumlimbal nei ratti e nei topi

Ottimizzazione del modello murino di occlusione venosa retinica per limitare la variabilità

Modello di retinopatia indotta dall'ossigeno per le malattie retiniche ischemiche nei roditori

Quantificazione dei parametri vascolari nelle retine a montaggio intero di topi con retinopatie non proliferative e proliferative

Cauterizzazione a cerchio completo del plesso vascolare limbare per il glaucoma indotto chirurgicamente nei roditori

Induzione di lesioni da ischemia-riperfusione retinica in un modello di occhio murino

Induzione di lesioni da ischemia-riperfusione retinica in un modello di occhio murino