Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'architettura della cromatina come il modo in cui la struttura 3D della cromatina può influenzare l'espressione e lo sviluppo genico. Il vantaggio principale di questa tecnica è che fornisce una visione ad alta risoluzione dell'architettura della cromatina e degli embrioni di mosca messi in scena con precisione. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sull'organizzazione e lo sviluppo della cromatina, si possono anche utilizzare linee esistenti da librerie di volo transgeniche per testarne l'effetto nell'organizzazione della cromatina.
Per iniziare il protocollo, regolare il volume totale degli embrioni raccolti in precedenza a due millilitri con PBST. Aggiungere sei millilitri di eptano e 100 microlitri di formaldeide al 37% in acqua. Dopo aver aggiunto la formaldeide, scuotere vigorosamente il tubo su e giù per un minuto.
La fase acquosa e organica si combinerà per formare una consistenza simile a uno shampoo. Agitare la miscela su un miscelatore rotante per 10 minuti. Centrifugare il tubo a 500 volte g per un minuto a temperatura ambiente per raccogliere embrioni nella parte inferiore del tubo.
Aspirare l'intero liquido simile a uno shampoo e scartarlo, facendo attenzione a non aspirare embrioni. 15 minuti dopo l'aggiunta di formaldeide, resuspend gli embrioni in cinque millilitri di PBST con glicina millimolare 125. Scuotere vigorosamente gli embrioni su e giù per un minuto.
Dopo la centrifugazione, aspirare il supernatante. Utilizzando una pipetta da 1.000 microliter, trasferire un lotto di 100 embrioni su un piccolo recipiente di vetro adatto per la cernita, preferibilmente su uno sfondo scuro e posizionarlo sul ghiaccio. Ordinare gli embrioni in base alla densità nucleare e allo stato del ciclo cellulare utilizzando un ago o una punta della siringa.
Rimuovere tutti gli embrioni mitotici riconoscibili dalla distribuzione non nucleare di EGFP PCNA ed embrioni che mostrano parzialmente un segnale GFP non nucleare. Per aiutare lo smistamento, allineare gli embrioni di riferimento ai cicli nucleari 12, 13 e 14 in ogni lotto per abbinare gli embrioni a uno degli embrioni di riferimento. Pipettare gli embrioni desiderati utilizzando una pipetta da 1.000 microliter.
Trasferirli su un tubo fresco e metterli sul ghiaccio. Continuare fino a quando non vengono ordinati abbastanza embrioni per l'esperimento pianificato. Tubi di rotazione brevemente a 100 volte g a temperatura ambiente.
Rimuovere il supernatante e assicurarsi che gli embrioni siano il più asciutti possibile per il congelamento. Flash congela gli embrioni immergendo i tubi in azoto liquido e immagazzinare a meno 80 gradi Celsius. Posizionare i tubi con embrioni congelati sul ghiaccio.
Rimescolare gli embrioni in 500 microlitri di tampone di lysis ghiacciata. Attendere un minuto per consentire all'embrione di depositarsi sul fondo del tubo. Successivamente, macinare gli embrioni con un micro pestello metallico pre-raffreddato sul ghiaccio progettato per adattarsi strettamente a un tubo di microcentrifugo da 1,5 millilitri.
Per evitare di agitare gli embrioni, inserire lentamente il pestello fino a tocchi il fondo del tubo. Spingere verso il basso e quindi macinare ruotando il pestello due volte in entrambe le direzioni. Sollevare il pestello molto leggermente.
Spingere di nuovo verso il fondo del tubo e ripetere la procedura di macinazione 10 volte o fino a quando gli embrioni non sono completamente lisci. La soluzione dovrebbe essere omogenea e non dovrebbero rimanere grandi pezzi residui di embrioni. Incubare la sospensione omogeneizzata sul ghiaccio per 15 minuti.
Gira a 1.000 volte g quattro gradi Celsius per cinque minuti. Scartare il supernatante e lavare il pellet riutilizzando in tampone di lisi fredda di ghiaccio da 500 microliter e tubazione su e giù. Dopo un altro giro, scartare il supernatante.
Rimescolare il pellet lavato in 100 microlitri dello 0,5% sodio Dodecil Solfato o SDS. Quindi permeabilizzare i nuclei incubando il campione per 10 minuti a 65 gradi Celsius in un blocco riscaldante. Aggiungere 50 microlitri del 10%Triton X100 e 120 microlitri di acqua.
Scorrere il tubo per mescolare il contenuto e incubare il tubo a 37 gradi Celsius per 15 minuti in un blocco termico. Aggiungere 25 microlitri di tampone enzimatico di restrizione 10X e 20 unità di cinque unità per microlitro MBO1. Far scorrere il tubo per mescolare il contenuto e incubare il tubo in un blocco di calore per digerire il DNA.
Aggiungere altre 20 unità di MBO1. Continuare l'incubazione per 90 minuti. Dopo la seconda incubazione di 90 minuti, incubare il campione a 62 gradi Celsius per 20 minuti per inattivo l'MBO1.
Successivamente, aggiungere 18 microlitri di 0,4 millimolare biotina 14-dATP, 2,25 microlitri di un mix non modificato di 3,3 millimolare dCTP-dGTP-dTTP e otto microlitri di cinque unità per microlitro DNA polimerasi I Klenow frammento. Scorrere il tubo per mescolare il contenuto e incubare il campione a 37 gradi Celsius per 90 minuti. Successivamente, aggiungere 657 microlitri di acqua, 120 microlitri di tampone di ligasi del DNA 10X T4, 100 microlitri del 10%Triton X100, sei microlitri di 20 milligrammi per albumina di siero bovino millilitro e infine cinque microlitri di cinque unità per microlitro T4 DNA ligasi.
Quindi, ruotare delicatamente il tubo a 20 giri/min a temperatura ambiente per due ore. Aggiungere altri cinque microlitri di cinque unità per microlitro T4 DNA ligasi. Continuare a ruotare per altre due ore, quindi far girare i nuclei a 2.500 volte g per cinque minuti.
Dopo la centrifugazione, scartare il supernatante. Rimescolare il pellet in 500 microlitri di tampone di estrazione e aggiungere 20 microlitri da 20 milligrammi per millilitro proteinasi K.Flick il tubo e incubare il tubo per digerire la proteina. Aggiungere 130 microlitri di cinque cloruri di sodio molare e incubare durante la notte per scollegare.
Il giorno dopo, pipettare il campione in un nuovo tubo da due millilitri con basse caratteristiche di legame del DNA. Aggiungere un volume di 0,1X di tre acetato di sodio molare e due microlitri da 15 milligrammi per millilitro GlycoBlue. Aggiungere 1,6 volumi di etanolo assoluto puro e invertire il contenuto, quindi incubare il campione a meno 80 gradi Celsius per 15 minuti.
Dopo l'incubazione, centrifugare il contenuto. Individuare il pellet di DNA che può essere individuato solo dal GlycoBlue. Rimuovere attentamente il supernatante, spostando la punta della pipetta nel tubo lungo la parete opposta dal pellet di DNA.
Lavare il pellet con 800 microlitri di 70%etanolo. Mescolare il campione inverterlo e centrifugarlo a 20.000 volte g a temperatura ambiente per cinque minuti. Rimuovere le goccioline rimanenti durante questo passaggio e i seguenti lavaggi spingendoli fuori dai tubi con una punta P10, quindi aprire il coperchio per asciugare all'aria per un massimo di cinque minuti.
Una volta che non rimane liquido, aggiungere 50 microlitri di cloruro di tris millimolare. Pipettare ripetutamente la soluzione sull'area in cui si trovava il pellet per solubilizzare il DNA. Aggiungere un microlitro di 20 milligrammi per millilitro RNasi A.Mescolare facendo scorrere il tubo.
Incubare il campione a 37 gradi Celsius per 15 minuti per digerire l'RNA. Infine, conservare il campione nel congelatore o nel frigorifero fino alla preparazione della biblioteca. Le immagini del segnale PCNA EGFP di ogni lotto di embrioni ordinato rivelano lo stato preciso dello stadio e del ciclo cellulare di ogni singolo embrione per gli esperimenti a valle.
Le tracce di bioanalizzatore mostrano che la distribuzione delle dimensioni dei frammenti di DNA dopo la selezione delle dimensioni è compresa tra 300 e 700 coppie di basi con un massimo di circa 450 coppie di basi. Le mappe di interazione hi-C mostrano che al ciclo nucleare 12 vengono rilevati pochi domini o DATAD topologicamente associati che cambiano drasticamente ai cicli nucleari 13 e 14 quando i DATAD sono sempre più prominenti e i contatti a lungo raggio non specifici sono esauriti. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di lavare accuratamente le perline e di non prolungare inutilmente i tempi di incubazione soprattutto alle alte temperature poiché ciò può portare a librerie Hi-C di bassa qualità.
Questa tecnica che combina una stadiazione accurata e una mappatura di conferma della cromatina ad alta risoluzione ha spianato la strada ai ricercatori nel campo dell'epigenetica per esplorare il ruolo dell'organizzazione tridimensionale della cromatina in un ambiente di sviluppo in vivo.
