Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo da arquitetura da cromatina, como como a estrutura 3D da cromatina pode influenciar a expressão e o desenvolvimento genético. A principal vantagem desta técnica é que ela fornece uma visão de alta resolução da arquitetura cromatina e de embriões de mosca precisamente encenados. Embora este método possa fornecer insights sobre a organização e o desenvolvimento da cromatina, também se pode usar linhas existentes de bibliotecas de moscas transgênicas para testar seu efeito na organização da cromatina.
Para iniciar o protocolo, ajuste o volume total de embriões coletados anteriormente para dois mililitros com PBST. Adicione seis mililitros de heptano e 100 microliters de 37% de formaldeído na água. Depois de adicionar formaldeído, agite vigorosamente o tubo para cima e para baixo por um minuto.
A fase aquosa e orgânica se combinará para formar uma consistência semelhante a um shampoo. Agitar a mistura em uma batedeira rotativa por 10 minutos. Centrifugar o tubo a 500 vezes g por um minuto à temperatura ambiente para coletar embriões na parte inferior do tubo.
Aspire todo o líquido tipo xampu e descarte-o, tomando cuidado para não aspirar nenhum embrião. 15 minutos após a adição de formaldeído, resuspende os embriões em cinco mililitros de PBST com 125 glicina milimiliar. Agite os embriões para cima e para baixo vigorosamente por um minuto.
Depois de centrifugar, aspire o supernante. Usando uma pipeta de 1.000 microliter, transfira um lote de 100 embriões para um pequeno vaso de vidro adequado para a classificação, de preferência em um fundo escuro e coloque-o no gelo. Classifique embriões por densidade nuclear e status de ciclo celular usando uma agulha ou ponta de seringa.
Remova todos os embriões mitóticos reconhecíveis por sua distribuição dispersa e não nuclear de EGFP PCNA e embriões que mostram parcialmente um sinal GFP não nuclear. Para auxiliar na classificação, forre os embriões de referência nos ciclos nucleares 12, 13 e 14 em cada lote para combinar embriões com um dos embriões de referência. Pipeta até os embriões desejados usando uma pipeta de 1.000 microliter.
Transfira-os para um tubo fresco e coloque-os no gelo. Continue até que embriões suficientes sejam classificados para o experimento planejado. Gire tubos brevemente a 100 vezes g à temperatura ambiente.
Remova o sobrenante e certifique-se de que os embriões estejam o mais secos possível para congelar. Os embriões congelam flash submergindo os tubos em nitrogênio líquido e armazenam a menos 80 graus Celsius. Coloque os tubos com embriões congelados no gelo.
Resuspense os embriões em 500 microliters de tampão de lise gelada. Espere um minuto para permitir que o embrião se instale no fundo do tubo. Em seguida, triture os embriões com um micro pilão metálico pré-resfriado no gelo que foi projetado para caber firmemente um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro.
Para evitar agitar os embriões, insira o pilão lentamente até tocar a parte inferior do tubo. Empurre para baixo e, em seguida, moer girando o pilão duas vezes em ambas as direções. Levante o pilão um pouco.
Empurre para o fundo do tubo novamente e repita o procedimento de moagem 10 vezes ou até que os embriões estejam completamente liseados. A solução deve ser homogênea e não restam grandes pedaços residuais de embriões. Incubar a suspensão homogeneizada no gelo por 15 minutos.
Gire a 1.000 vezes g quatro graus Celsius por cinco minutos. Descarte o supernascer e lave a pelota reutilizando em 500 tampão de lise gelada de 500 microliter e pipetando para cima e para baixo. Depois de outra rotação, descarte o supernaspe.
Resuspend a pelota lavada em 100 microlitres de 0,5% Sulfato de Dodecyl de Sódio ou SDS. Em seguida, permeabilize os núcleos incubando a amostra por 10 minutos a 65 graus Celsius em um bloco de aquecimento. Adicione 50 microliters de 10% Triton X100 e 120 microliters de água.
Flick o tubo para misturar o conteúdo e incubar o tubo a 37 graus Celsius por 15 minutos em um bloco de calor. Adicione 25 microliters de tampão de enzima de restrição 10X e 20 unidades de cinco unidades por microliter MBO1. Flick o tubo para misturar o conteúdo e incubar o tubo em um bloco de calor para digerir o DNA.
Adicione mais 20 unidades de MBO1. Continue a incubação por 90 minutos. Após a segunda incubação de 90 minutos, incubar a amostra a 62 graus Celsius por 20 minutos para inativo o MBO1.
Em seguida, adicione 18 microliters de 0,4 milimilitros biotina 14-dATP, 2,25 microliters de um fragmento de 3,3 mililitros dCTP-dGTP-dTTP não modificado, e oito microliters de cinco unidades por microliter DNA polymerase I klenow fragmento. Flick o tubo para misturar o conteúdo e incubar a amostra a 37 graus Celsius por 90 minutos. Em seguida, adicione 657 microliters de água, 120 microliters de 10X T4 DNA ligase buffer, 100 microliters de 10%Triton X100, seis microliters de 20 miligramas por mililitro de soro bovino de mililitro, e finalmente cinco microliters de cinco unidades por microliter T4 LIGASE de DNA.
Em seguida, gire o tubo suavemente a 20 RPM em temperatura ambiente por duas horas. Adicione mais cinco microliters de cinco unidades por microliter T4 LIGA LIGASe de DNA. Continue girando por mais duas horas, depois gire os núcleos a 2.500 vezes g por cinco minutos.
Após a centrifugação, descarte o supernasce. Resuspengue a pelota em 500 microliters de tampão de extração e adicione 20 microliters de 20 miligramas por proteína mililitro K.Flick o tubo e incubar o tubo para digerir a proteína. Adicione 130 microliters de cinco cloreto de sódio molar e incubar durante a noite para descruzar.
No dia seguinte, pipeta a amostra em um novo tubo de dois mililitros com baixas características de ligação de DNA. Adicione 0,1X de volume de três acetatos de sódio molar e dois microliters de 15 miligramas por mililitro GlycoBlue. Adicione 1,6 volumes de etanol absoluto puro e inverta o conteúdo, em seguida, incubar a amostra a menos 80 graus Celsius por 15 minutos.
Após a incubação, centrifugar o conteúdo. Localize a cápsula de DNA que só pode ser vista pelo GlycoBlue. Remova o supernatante cuidadosamente, movendo a ponta da pipeta para o tubo ao longo da parede oposta da pelota de DNA.
Lave a pelota com 800 microliters de 70% de etanol. Misture a amostra invertendo-a e centrifuá-la a 20.000 vezes g à temperatura ambiente por cinco minutos. Remova as gotículas restantes durante esta etapa e as seguintes lavadas empurrando-as para fora dos tubos com uma ponta P10 e, em seguida, abra a tampa para secar o ar por até cinco minutos.
Uma vez que não reste líquido, adicione 50 microliters de 10 mililitros tris cloreto. Repetidamente pipeta a solução sobre a área onde a pelota estava localizada para solubilizar o DNA. Adicione um microliter de 20 miligramas por mililitro RNase A.Mix apertando o tubo.
Incubar a amostra a 37 graus Celsius por 15 minutos para digerir RNA. Por fim, guarde a amostra no congelador ou geladeira até a preparação da biblioteca. Imagens do sinal PCNA EGFP de cada lote de embriões classificados revelam estágios precisos e status de ciclo celular de cada embrião para experimentos a jusante.
Traços bioanalyzer mostram que a distribuição de tamanho dos fragmentos de DNA após a seleção de tamanho está entre 300 e 700 pares de base com um máximo em torno de 450 pares de base. Mapas de interação hi-C mostram que no ciclo nuclear 12, poucos Domínios Topologicamente Associados ou TADs são detectados que mudam drasticamente nos ciclos nucleares 13 e 14 quando os TADs são cada vez mais proeminentes e contatos de longo alcance inespecíficos são esgotados. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de lavar as contas completamente e não prolongar os tempos de incubação desnecessariamente especialmente em altas temperaturas, uma vez que isso pode levar a bibliotecas Hi-C de baixa qualidade.
Esta técnica que combina encenação precisa e mapeamento de confirmação de cromatina de alta resolução abriu caminho para pesquisadores do campo da epigenética explorarem o papel da organização tridimensional de cromatina em um cenário in vivo de desenvolvimento.
