Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la arquitectura de la cromatina, como cómo la estructura 3D de la cromatina puede influir en la expresión y el desarrollo del gen. La principal ventaja de esta técnica es que proporciona una visión de alta resolución de la arquitectura de la cromatina y los embriones de mosca escenificadas con precisión. Aunque este método puede proporcionar información sobre la organización y el desarrollo de la cromatina, también se pueden utilizar líneas existentes de bibliotecas de moscas transgénicas para probar su efecto en la organización de la cromatina.
Para comenzar el protocolo, ajuste el volumen total de embriones previamente recogidos a dos mililitros con PBST. Añadir seis mililitros de heptano y 100 microlitros de 37% formaldehído en agua. Después de añadir formaldehído, agita vigorosamente el tubo hacia arriba y hacia abajo durante un minuto.
La fase acuosa y orgánica se combinará para formar una consistencia similar al champú. Agitar la mezcla en un mezclador rotativo durante 10 minutos. Centrifugar el tubo a 500 veces g durante un minuto a temperatura ambiente para recoger embriones en la parte inferior del tubo.
Aspirar todo el líquido similar al champú y desecharlo, teniendo cuidado de no aspirar ningún embrión. 15 minutos después de la adición de formaldehído, resuspender los embriones en cinco mililitros de PBST con 125 glicina milimétrica. Agitar los embriones hacia arriba y hacia abajo vigorosamente durante un minuto.
Después de centrifugar, aspirar el sobrenadante. Usando una pipeta de 1.000 microlitros, transfiera un lote de 100 embriones a un pequeño recipiente de vidrio adecuado para la clasificación, preferiblemente sobre un fondo oscuro y colóquelo sobre hielo. Ordene los embriones por densidad nuclear y estado del ciclo celular utilizando una aguja o una punta de jeringa.
Elimine todos los embriones mitóticos reconocibles por su distribución dispersa y no nuclear de PCNA EGFP y embriones que muestren parcialmente una señal de PFG no nuclear. Para ayudar a la clasificación, alinee los embriones de referencia en los ciclos nucleares 12, 13 y 14 en cada lote para que coincidan con los embriones con uno de los embriones de referencia. Pipetee los embriones deseados utilizando una pipeta de 1.000 microlitros.
Transfieralos a un tubo fresco y colóquelos en hielo. Continúe hasta que se clasifen suficientes embriones para el experimento planeado. Gire los tubos brevemente a 100 g a temperatura ambiente.
Retire el sobrenadante y asegúrese de que los embriones estén lo más secos posible para la congelación. Congelar los embriones al sumergir los tubos en nitrógeno líquido y almacenar a menos 80 grados Celsius. Coloque los tubos con embriones congelados sobre hielo.
Resuspender los embriones en 500 microlitros de tampón de lelisis helada. Espere un minuto para permitir que el embrión se asiente en la parte inferior del tubo. A continuación, moler los embriones con un micro peste de metal pre-enfriado sobre hielo que está diseñado para encajar firmemente un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros.
Para evitar agitar los embriones, inserte el pestillo lentamente hasta que toque la parte inferior del tubo. Empuje hacia abajo y luego muele girando el pestle dos veces en ambas direcciones. Levante el pestle muy ligeramente.
Empuje hacia la parte inferior del tubo de nuevo y repita el procedimiento de molienda 10 veces o hasta que los embriones estén completamente separados. La solución debe ser homogénea y no deben permanecer grandes trozos residuales de embriones. Incubar la suspensión homogeneizada sobre hielo durante 15 minutos.
Gire a 1.000 veces g cuatro grados Celsius durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante y lave el pellet resuspendiendo en 500 microlitros de tólizar de lysis fría de hielo y pipeteando arriba y abajo. Después de otro giro, deseche el sobrenadante.
Resuspender el pellet lavado en 100 microlitros de 0.5%Dodecyl Sulfate o SDS. A continuación, permeabilizar los núcleos incubando la muestra durante 10 minutos a 65 grados Celsius en un bloque de calentamiento. Añadir 50 microlitros de 10%Triton X100 y 120 microlitros de agua.
Deslice el tubo para mezclar el contenido e incubar el tubo a 37 grados Centígrados durante 15 minutos en un bloque de calor. Añadir 25 microlitros de tampón de enzimas de restricción 10X y 20 unidades de cinco unidades por microlitor MBO1. Deslice el tubo para mezclar el contenido e incubar el tubo en un bloque de calor para digerir el ADN.
Añade otras 20 unidades de MBO1. Continúe la incubación durante 90 minutos. Después de la segunda incubación de 90 minutos, incubar la muestra a 62 grados centígrados durante 20 minutos para inactivar el MBO1.
A continuación, añada 18 microlitros de 0,4 biotina miliamperosas 14-dATP, 2,25 microlitros de una mezcla dCTP-dGTP-dTTP de 3,3 millimolares sin modificar, y ocho microlitros de cinco unidades por microlitro de ADN polimerasa I fragmento De Klenow. Deslice el tubo para mezclar el contenido e incubar la muestra a 37 grados centígrados durante 90 minutos. A continuación, añadir 657 microlitros de agua, 120 microlitros de 10X T4 DNA ligasa buffer, 100 microlitros de 10%Triton X100, seis microlitros de 20 miligramos por mililitro de albúmina sérica bovina, y finalmente cinco microlitros de cinco unidades por microlitro T4 ligasa de ADN.
A continuación, gire el tubo suavemente a 20 RPM a temperatura ambiente durante dos horas. Añadir otros cinco microlitros de cinco unidades por microlitro T4 ligase de ADN. Continúe girando durante dos horas más, luego gire hacia abajo los núcleos a 2, 500 veces g durante cinco minutos.
Después de la centrifugación, deseche el sobrenadante. Resuspender el pellet en 500 microlitros de tampón de extracción y añadir 20 microlitros de 20 miligramos por mililitro proteinasa K.Flick el tubo e incubar el tubo para digerir la proteína. Añadir 130 microlitros de cinco molares de cloruro sódico e incubar durante la noche para des-crosslink.
Al día siguiente, pipetear la muestra en un nuevo tubo de dos mililitros con características bajas de unión al ADN. Añadir 0,1X volumen de tres molares de acetato de sodio y dos microlitros de 15 miligramos por mililitro GlycoBlue. Añadir 1,6 volúmenes de etanol absoluto puro e invertir el contenido, luego incubar la muestra a menos 80 grados Celsius durante 15 minutos.
Después de la incubación, centrifugar el contenido. Localice el pellet de ADN que sólo puede ser detectado por el GlycoBlue. Retire el sobrenadante cuidadosamente, moviendo la punta de la pipeta en el tubo a lo largo de la pared opuesta del pellet de ADN.
Lavar el pellet con 800 microlitros de 70% etanol. Mezcle la muestra invirtiendo y centrifugarlo a 20.000 veces g a temperatura ambiente durante cinco minutos. Retire las gotas restantes durante este paso y los siguientes lavados empujándolas fuera de los tubos con una punta P10, luego abra la tapa para secar al aire durante un máximo de cinco minutos.
Una vez que no quede líquido, agregue 50 microlitros de cloruro de tris de 10 milimolares. Pipetear repetidamente la solución sobre el área donde se localizó el pellet para solubilizar el ADN. Añadir un microlitro de 20 miligramos por mililitro RNase A.Mix moviendo el tubo.
Incubar la muestra a 37 grados centígrados durante 15 minutos para digerir el ARN. Por último, guarde la muestra en el congelador o en el refrigerador hasta la preparación de la biblioteca. Las imágenes de la señal EGFP PCNA de cada lote de embriones clasificados revelan estados precisos de etapa y ciclo celular de cada embrión para experimentos posteriores.
Las trazas de bioanalizador muestran que la distribución del tamaño de los fragmentos de ADN después de la selección del tamaño está entre 300 y 700 pares base con un máximo de alrededor de 450 pares base. Los mapas de interacción Hi-C muestran que en el ciclo nuclear 12, se detectan pocos dominios o TAD topológicamente asociados que cambian drásticamente en los ciclos nucleares 13 y 14 cuando los TAC son cada vez más prominentes e inespecíficos contactos de largo alcance se agotan. Al intentar este procedimiento, es importante recordar lavar las cuentas a fondo y no prolongar los tiempos de incubación innecesariamente, especialmente a altas temperaturas, ya que esto puede conducir a bibliotecas Hi-C de baja calidad.
Esta técnica que combina la puesta en escena precisa y el mapeo de confirmación de cromatina de alta resolución allanaron el camino para que los investigadores en el campo de la epigenética exploraran el papel de la organización de la cromatina tridimensional en un entorno de desarrollo in vivo.
