이 방법은 크로마틴의 3D 구조가 유전자 발현 및 발달에 어떻게 영향을 미칠 수 있는지와 같은 크로마틴 아키텍처 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 크로마틴 아키텍처와 정밀하게 준비된 플라이 배아의 고해상도 뷰를 제공한다는 것입니다. 이 방법은 크로마틴 조직 및 개발에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 형질전환 플라이 라이브러리의 기존 라인을 사용하여 크로마틴 조직에서 의 영향을 테스트할 수도 있습니다.
프로토콜을 시작하려면 이전에 수집된 배아의 총 부피를 PBST를 사용하여 2밀리리터로 조정합니다. 6 밀리리터의 헵탄과 100마이크로리터를 37%의 포름알데히드를 물에 넣습니다. 포름알데히드를 추가한 후 1분 동안 튜브를 위아래로 힘차게 흔들어 줍니다.
수성 및 유기 단계는 샴푸와 같은 일관성을 형성하기 위해 결합됩니다. 로터리 믹서에 혼합물을 10분 동안 교반합니다. 튜브의 바닥에 배아를 수집하기 위해 실온에서 1 분 동안 500 배 g에서 튜브를 원심 분리합니다.
샴푸와 같은 액체 전체를 흡인하고 폐기하여 배아를 흡인하지 않도록 주의하십시오. 포름알데히드를 첨가한 후 15분 후, 125밀리머 글리신으로 PBST의 5밀리리터에서 배아를 재보습한다. 배아를 1분 동안 힘차게 위아래로 흔들어 줍니다.
원심 분리 후, 슈퍼 나티를 흡인. 1, 000 마이크로리터 파이펫을 사용하여 100개의 배아를 정렬에 적합한 작은 유리 용기로 옮기고, 바람직하게는 어두운 배경에 얼음 위에 놓습니다. 바늘 또는 주사기 팁을 사용하여 핵 밀도 및 세포 주기 상태에 의해 배아를 정렬합니다.
부분적으로 비핵 GFP 신호를 보여주는 EGFP PCNA 및 배아의 분산, 비핵 분포에 의해 인식되는 모든 미토틱 배아를 제거합니다. 선별을 돕기 위해 각 배치에서 12, 13 및 14의 참조 배아를 참조 배아 중 하나와 일치시도록 하십시오. 파이펫은 1, 000 마이크로리터 파이펫을 사용하여 원하는 배아를 증가시다.
신선한 튜브로 옮기고 얼음 위에 놓습니다. 계획된 실험을 위해 충분한 배아가 정렬될 때까지 계속하십시오. 실온에서 100배 g로 튜브를 짧게 회전시다.
상체를 제거하고 태아가 동결을 위해 가능한 한 건조하도록 하십시오. 액체 질소에 튜브를 잠그고 영하 80도에 저장하여 배아를 동결 플래시. 얼어붙은 배아를 얼음 위에 놓습니다.
얼음 차가운 리시 버퍼의 500 마이크로 리터에서 배아를 다시 중단합니다. 배아가 튜브 의 바닥에 정착 할 수 있도록 1 분을 기다립니다. 다음으로, 1.5 밀리리터 미세 원심 분리기 튜브에 단단히 맞도록 설계된 얼음에 미리 냉각 된 금속 마이크로 유봉으로 배아를 갈아.
배아를 동요하지 않으려면 튜브 바닥에 닿을 때까지 유봉을 천천히 삽입하십시오. 아래로 밀어 두 방향으로 유봉을 두 번 회전하여 갈기. 봉제봉을 매우 약간 들어 올립니다.
튜브 의 바닥에 다시 밀어 10 번 또는 배아가 완전히 lysed 될 때까지 연삭 절차를 반복합니다. 해결책은 균질해야 하며, 배아의 잔류 큰 조각은 남아 서는 안됩니다. 15분 동안 얼음에 균질화된 서스펜션을 배양합니다.
섭씨 4도 에서 섭씨 1, 000배에서 5분간 회전합니다. 500 마이크로리터 얼음 차가운 리시스 버퍼로 재연하고 위아래로 파이펫을 하여 상체를 버리고 펠릿을 씻으십시오. 또 다른 스핀 후, 상체를 폐기합니다.
도데실 설페이트 나트륨 0.5% 나트륨 도데실 설페이트 또는 SDS의 100 마이크로리터에서 세척된 펠릿을 재중단합니다. 그런 다음 가열 블록에서 섭씨 65도에서 10 분 동안 샘플을 배양하여 핵을 침투합니다. 10%트리톤 X100과 120마이크로리터의 마이크로리터 50기를 추가합니다.
튜브를 플릭하여 내용물들을 섞고 튜브를 37도에서 15분간 열블록에서 배양합니다. 10X 제한 효소 버퍼 25마이크로리터와 마이크로리터 MBO1당 5단위 20대를 추가합니다. 튜브를 플릭하여 내용을 혼합하고 열을 차단하여 튜브를 배양하여 DNA를 소화합니다.
MBO1의 20 단위를 추가합니다. 잠복기를 90분 동안 계속하십시오. 두 번째 90분 배양 후 샘플을 섭씨 62도에서 20분 동안 배양하여 MBO1을 비활성 상태로 합니다.
다음으로, 0.4 밀리몰러 비오틴 14-dATP의 18 마이크로리터, 수정되지 않은 3.3 밀리머 dCTP-dGTP-dTTP 믹스의 마이크로리터 2.25개, 마이크로리터 DNA 폴리머라제 I Klenow 단편당 5단위의 8개의 마이크로리터를 추가한다. 튜브를 플릭하여 내용물들을 혼합하고 샘플을 섭씨 37도에서 90분간 배양합니다. 다음으로, 657 마이크로리터의 물, 10X T4 DNA 리구아제 완충제 120마이크로리터, 100마이크로리터 100마이크로리터 10%트리톤 X100, 밀리리터 소 혈청 알부민 당 20밀리그램의 6마이크로리터, 그리고 마지막으로 마이크로리터 T4 DNA ligase당 5단위의 마이크로리터를 추가합니다.
다음으로, 2 시간 동안 실온에서 20 RPM에서 튜브를 부드럽게 회전시십시오. 마이크로리터 T4 DNA 리그아제당 5개의 마이크로리터를 추가합니다. 2시간 더 회전한 다음 5분 동안 2, 500배 g에서 핵을 회전시합니다.
원심 분리 후, 상체를 폐기하십시오. 추출 버퍼 500 마이크로 리터에서 펠릿을 다시 중단하고 밀리리터 단백질 제 K.Flick 당 20 밀리그램의 마이크로 리터를 추가하고 튜브를 배양하여 단백질을 소화합니다. 염화 나트륨 5개미130마이크로리터를 넣고 하룻밤 동안 배양하여 크로스링크를 해제합니다.
다음 날, 낮은 DNA 결합 특성을 가진 새로운 2 밀리리터 튜브로 견본을 피펫합니다. 3 개의 어금니 나트륨 아세테이트와 밀리리터 글리코블루 당 15 밀리그램의 마이크로리터 2개를 0.1X 부피를 추가합니다. 순수한 절대 에탄올 1.6 볼륨을 추가하고 내용물 왜곡한 다음 샘플을 섭씨 영하 80도에서 15분 동안 배양합니다.
인큐베이션 후, 원심분리내용을 분리합니다. 글리코블루에서만 발견할 수 있는 DNA 펠릿을 찾아보세요. 피펫 팁을 DNA 펠릿에서 반대 쪽 벽을 따라 튜브로 이동하여 주체를 조심스럽게 제거합니다.
70%에탄올의 800 마이크로리터로 펠릿을 씻으십시오. 샘플을 반역하여 원심분리기를 실온에서 20, 000배에서 5분간 섞는다. 이 단계에서 남은 액적을 제거하고 다음 세차처리는 P10 팁으로 튜브에서 밀어 낸 다음 뚜껑을 열어 최대 5분 동안 공기 건조시합니다.
액체가 남지 않은 후 10 밀리머 트리스 염화물의 50 마이크로리터를 추가하십시오. 반복적으로 펠릿이 DNA를 용해시키기 위해 위치한 영역에 대한 용액을 피펫. 튜브를 가볍게 하여 밀리리터 RNase A.Mix당 20 밀리그램의 마이크로리터 1개를 추가합니다.
RNA를 소화하기 위해 15분 동안 섭씨 37도에서 샘플을 배양합니다. 마지막으로, 도서관 준비 까지 냉동실이나 냉장고에 샘플을 저장합니다. 각 정렬된 배아 배치의 EGFP PCNA 신호의 이미지는 다운스트림 실험을 위한 모든 단일 배아의 정확한 단계 및 세포 주기 상태를 드러냅니다.
Bioanalyzer 추적은 크기 선택 후 DNA 조각의 크기 분포가 약 450 개의 기본 쌍에서 최대300 ~ 700 개의 기본 쌍 사이임을 보여줍니다. Hi-C 상호 작용 맵은 핵 사이클 12에서 TAD가 점점 더 두드러지고 특이하지 않은 장거리 접촉이 고갈될 때 핵 사이클 13과 14에서 극적으로 변경되는 토폴로지 관련 도메인 또는 TAD가 감지되는 것을 보여줍니다. 이 절차를 시도하는 동안, 그것은 철저하게 구슬을 세척하고이 낮은 품질의 Hi-C 라이브러리로 이어질 수 있기 때문에 특히 높은 온도에서 불필요하게 잠복 시간을 연장하지 기억하는 것이 중요합니다.
정확한 스테이징과 고해상도 크로마틴 확인 매핑을 결합한 이 기술은 후성 유전학 분야의 연구원들이 생체 내 발달 환경에서 3차원 크로마틴 조직의 역할을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.
