Name: dissection and live-imaging of the late embryonic drosophila gonad
Uploaded: 2020-10-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad at JoVE.com

Vorremmo ringraziare Lindsey W. Plasschaert e Justin Sui per i loro sostanziali contributi allo sviluppo iniziale di questo protocollo. Gli autori sono grati alla comunità delle mosche per la loro generosità con i reagenti, e in particolare a Ruth Lehmann e Benjamin Lin per il loro dono della linea nos5'-Lifeact-tdtomato p2a tdkatushka2 Caax nos3' prima della sua pubblicazione. In questo studio sono state utilizzate le scorte ottenute dal Bloomington Drosophila Stock Center (NIH P40OD018537). Questo lavoro è stato supportato da NIH RO1 GM060804, R33AG04791503 e R35GM136270 (S.D) e dalle borse di formazione T32GM007229 (B.W.) e F32GM125123 (L.A.).

1. Preparazione del giorno prima della dissezione
<ol><li>Affilare elettroliticamente un ago di tungsteno24 in modo che il diametro risultante sia di circa 0,03 mm. Regolare la tensione fornita a circa 14 V e utilizzare 3,3 M NaOH. L'affilatura non dovrebbe richiedere più di 1 o 2 minuti. ATTENZIONE: NaOH è altamente corrosivo e causerà ustioni a contatto con la pelle. Indossare guanti e occhiali durante la manipolazione e lavorare all'interno di un cappuccio fumi. NOTA: Dopo l'uso, conservare NaOH in un tubo Falcon in polipropilene.</li>
	<li>Creare il supporto di imaging preparato. In un tubo conico da 15 mL, combinare 4,25 mL di mezzi di Schneider con 750 μL di siero bovino fetale (FBS, concentrazione finale del 15%) e 27,5 μL di penicillina-streptomicina (0,05 U/μL di penicillina, 0,05 μg/μL di concentrazione finale). Conservare questo supporto di imaging preparato a 4 °C.</li>
	<li>Fare la soluzione eptano-colla. Aggiungere circa 0,5 mL di eptano a un flaconcino sigillabile da 20 mL farcito con nastro biadesivo di circa 20 cm. Cullare su un nutatore per circa un'ora o mescolare con una punta di pipetta fino a raggiungere una consistenza tra quella di acqua e glicerolo. Questa soluzione di colla disciolta durerà per diversi giorni prima che l'eptano evapori. Per rinfrescare la soluzione, aggiungere altri 0,5 ml di eptano e roccia. NOTA: Una soluzione efficace di eptano-colla può essere preparata utilizzando vari rapporti tra eptano e nastro adesivo, nonché durate variabili di oscillazione / agitazione. Le specifiche di cui sopra sono solo suggerimenti per preparare o rinfrescare una di queste soluzioni adeguate.</li>
</ol>2. Raccolta degli embrioni: 15-17 ore prima della dissezione
<ol><li>Aggiungere la pasta di lievito fresco a un piatto di agar di succo di mela25. Allestire una gabbia per la raccolta degli embrioni aggiungendo mosche adulte (meno di 10 giorni) a una bottiglia di cibo vuota, perforata con piccoli fori26. Tappare la gabbia di raccolta utilizzando la piastra di agar lievitato, fissata alla bottiglia, e posizionare la gabbia con il lato della piastra verso il basso in un'incubatrice scura a 25 °C per 1 ora. NOTA: Le mosche devono esprimere un transgene che segnerà fluorescentemente la gonade, ad esempio six4-eGFP::Moesin20, perché la dissezione degli embrioni avverrà sotto un microscopio stereo-fluorescente. Vedere Tabella dei materiali per un elenco dei genotipi utilizzati per contrassegnare la gonade.</li>
	<li>Rimuovere la gabbia dall'incubatrice e scartare questa prima raccolta. Sostituirlo con una piastra di agar appena lievitato e riposizionare la gabbia nell'incubatrice per 2 ore. NOTA: La prima raccolta di embrioni viene utilizzata per liberare le femmine dagli embrioni fecondati e in via di sviluppo, per ottenere una seconda raccolta di embrioni strettamente programmata.</li>
	<li>Rimuovere la piastra di agar dalla gabbia e posizionarla (con il lato lievitato rivolto verso l'alto) su un tovagliolo di carta umido all'interno di un contenitore di plastica sigillabile. Posizionare questa camera umida in un'incubatrice a 25 °C per invecchiare gli embrioni per 14,5 ore (età finale, 14,5-16,5 ore dopo la deposizione delle uova). NOTA: immediatamente prima di iniziare il passaggio 2.4, completare i passaggi 3.1 e 3.2.</li>
	<li>Rimuovere la piastra di agar dall'incubatrice e, usando una bottiglia di schizzo, aggiungere abbastanza acqua alla piastra di agar per sciogliere la pasta di lievito spazzolando leggermente con un pennello. Risciacquare gli embrioni e il lievito disciolto in un piccolo cestello a rete seduto all'interno di una barca di pesatura. Risciacquare il cestello con la bottiglia di spruzzo d'acqua fino a quando la maggior parte della pasta di lievito non è filtrata attraverso la rete.</li>
	<li>Rimuovere l'acqua dalla barca di pesatura e riposizionare il cestello all'interno. Decorionare gli embrioni immergendoli in una soluzione di candeggina al 50%, utilizzando un flacone di schizzo. La soluzione di candeggina dovrebbe avere una profondità di 3-5 mm. Tenere gli embrioni immersi nella candeggina per ~ 2 minuti, con vortici occasionali. ATTENZIONE: La candeggina è corrosiva e può irritare o danneggiare gli occhi e le vie respiratorie. Indossare guanti e occhiali mentre si maneggia la candeggina. NOTA: durante questo periodo, completare il più possibile il passaggio 3.3. L'avanzamento della decorionazione può essere controllato posizionando il cestello sotto uno stereomicroscopio e controllando l'assenza delle appendici dorsali. Immergere gli embrioni nella soluzione di candeggina per un ulteriore tempo, se necessario.</li>
	<li>Scartare la candeggina e risciacquare accuratamente gli embrioni all'interno del cestello con acqua da una bottiglia di schizzo (per ~ 3 s, tamponando il cestello a rete con carta assorbente; ripetere 2-3 volte).</li>
</ol>3. Preparazione del giorno di dissezione
<ol><li>Aggiungere 30 μL di insulina (10 mg/mL) a 1.500 μL di imaging preparato (vedere fase 1.2) in un tubo di Eppendorf da 1,5 mL (concentrazione finale di 0,2 mg/mL). Mescolare bene e lasciare il tubo sul banco per equilibrare a temperatura ambiente.</li>
	<li>Preparare strisce di coverslip rivestite con colla.<ol>
<li>Utilizzare un coltello con punta di diamante per tagliare un coverslip di 22 mm x 22 mm in quattro strisce di dimensioni uguali (Figura 1A).</li>
		<li>Utilizzare una pinza per raccogliere una striscia e distribuire un totale di circa 30 μL di soluzione di eptano-colla su entrambi i lati della striscia (Figura 1B). Per ottenere uno strato uniforme di residui di colla, inclinare la striscia a varie angolazioni mentre l'eptano evapora.</li>
		<li>Conservare la striscia ricoperta di colla in una fessura vuota di una scatola di coverslip; per mantenere la sua viscosità, posizionare la striscia in posizione inclinata, ma verticale, appoggiandosi ai bordi della scatola per ridurre al minimo il contatto con le superfici della scatola (Figura 1C). Chiudere la scatola in modo che le particelle nell'aria non rivestano la colla e ne riducano la viscosità.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Posizionare i seguenti elementi sul banco: una pipetta Pasteur in vetro da 6 pollici, un vetrino per microscopio, un pipettaman P200 e P1000 con le punte appropriate per pipette, la soluzione27 di Ringer (pH regolato a 7,3 con NaOH) e una parabola di imaging da 35 mm rivestita in Poli-D-lisina scoperta.</li>
	<li>Trasferire gli embrioni dal cestello dello schermo a rete a un piccolo vetro dell'orologio riempito con 500-750 μL di eptano.<ol>
<li>Asciugare i lati e il fondo del cestello con una salvietta di tessuto. Inumidire un pennello nell'eptano, toccare il pennello agli embrioni (la membrana vitellina idrofobica dovrebbe aderire alle setole) e immergere nuovamente il pennello nell'eptano nel vetro dell'orologio (gli embrioni dovrebbero affondare sul fondo). NOTA: I passaggi successivi devono essere eseguiti il più rapidamente possibile per evitare che gli embrioni si secchino. Gli embrioni non devono essere esposti all'aria per più di 20 s.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Trasferire gli embrioni sul vetrino del microscopio utilizzando una pipetta Pasteur (Figura 1D). Aspirare lentamente gli embrioni nella pipetta e limitarli alla porzione stretta della pipetta. Gli embrioni di pipetta sul vetrino lentamente, in modo tale che si aggregano appena all'interno della punta della pipetta prima di fluire sul vetrino. Ruotare l'angolo di una salvietta di tessuto in una punta fine e allontanare l'eptano dagli embrioni sul vetrino. Si aggregano e coprono un'area più piccola, rendendo più facile catturarli su una striscia ricoperta di colla nella fase successiva.</li>
	<li>Con la pinza, raccogliere una striscia ricoperta di colla e toccarla delicatamente agli embrioni (Figura 1E). Posizionare la striscia nel piatto di imaging, nell'embrione lateralmente e appena fuori dal centro rivestito di poli-D-lisina. Premere la striscia sul piatto usando una pinza, per assicurarsi che sia fissata in posizione. Inondare immediatamente il piatto con 2-3,5 ml di soluzione di Ringer; immergere prima gli embrioni per evitare che si secchino (Figura 1F).</li>
</ol>4. Dissezione
NOTA: Questi passaggi devono essere eseguiti al microscopio stereofluorescenza.
<ol><li>Devitellinizzare 10-15 embrioni. NOTA: Questo può variare da due embrioni, per principianti, a quindici embrioni, per esperti.<ol>
<li>Selezionare gli embrioni di stadio 16 in base alla morfologia intestinale (Figura 2). In questa fase, gli embrioni hanno tre costrizioni intestinali che creano quattro segmenti intestinali impilati (Figura 2B,B'). Per iniziare la devitellinizzazione, perforare l'embrione selezionato a un'estremità, preferibilmente quella anteriore, con l'ago di tungsteno. L'embrione può uscire dalla sua membrana vitellina, ma in caso contrario, staccare la membrana dall'embrione. NOTA: Gli embrioni troppo giovani per essere sezionati hanno un intestino non regionalizzato (Figura 2C). La dissezione degli embrioni di stadio 17 è possibile, ma più impegnativa della dissezione di embrioni di stadio 16 perché la cuticola sta iniziando a svilupparsi in questa fase. Gli embrioni di stadio 17 precoce presentano quattro segmenti intestinali che sono spostati l'uno rispetto all'altro (Figura 2D,D').</li>
		<li>Aggancia l'ago attraverso l'embrione in una regione lontana dalle gonadi. Trasferire l'embrione uncinato nella regione rivestita di polilisina del piatto (da qui in poi indicato semplicemente come "cover slip") e trascinarlo contro il fondo fino a quando non aderisce. Ripeti questi passaggi e disponi gli embrioni devitellinizzati in fila lungo la parte superiore dello slip di copertura rivestito di polilisina (Figura 3A), lasciando molto spazio sotto per un'ulteriore dissezione. NOTA: Le gonadi appaiono come piccoli aggregati sferici di cellule che dovrebbero fluorescere brillantemente, a seconda del marcatore specifico utilizzato e del numero di copia transgenica. In questa fase, le gonadi si trovano lateralmente nel segmento A5, a circa il 70%-80% della lunghezza dell'embrione dall'anteriore. Durante tutto il protocollo di dissezione, il tessuto può attaccarsi all'ago. Per liberare l'ago dai detriti, sollevarlo appena sopra la superficie della soluzione del Ringer. La devitellinizzazione può essere disordinata finché la gonade vera e propria è disturbata il meno possibile.</li>
	</ol></li>
	<li>Finezza le gonadi fuori dall'embrione e sul piatto (Figura 3C,D).<ol>
<li>In primo luogo, filettare l'embrione per esporre il suo interno (Figura 3C). Taglia l'embrione dal suo centro, muovendo l'ago posteriormente, tra le gonadi. Stuzzicare un po 'di tessuto interno, in quanto questo si attaccherà al piatto molto meglio della cuticola esterna. La viscosità del tessuto consentirà alle successive manipolazioni di rivelare la gonade e consentirle di aderire allo slittamento del coperchio. NOTA: se il tessuto non si attacca al piatto, prova a convincerlo in una regione incontaminata dello slip di copertura rivestito; le regioni esterne dello slittamento del coperchio saranno particolarmente appiccicose. Come indicato nel passaggio 4.1.2, non importa se le manipolazioni di dissezione provocano una carcassa embrionale maciullata, purché le gonadi rimangano indenni.</li>
		<li>Usa l'ago per affettare una gonade fino a quando un pezzo di tessuto, compresa la gonade, è separato dalla carcassa rimanente. Con l'ago, disegnare questo tessuto in una regione fresca di copertura rivestita e convincerlo contro il fondo fino a quando non aderisce al piatto. NOTA: La migliore immagine sarà ottenuta per quei casi in cui la gonade stessa si attacca direttamente allo slittamento del coperchio, piuttosto che all'attacco indiretto tramite tessuto sovrastante. Pertanto, mentre il tessuto viene guidato lontano dalla carcassa, tentare di far scivolare prima la gonade sul coperchio, piuttosto che il tessuto estraneo.</li>
		<li>Rimuovere il più possibile il tessuto circostante dalla gonade (Figura 3D) trascinando delicatamente il tessuto aderente lontano dalla gonade con l'ago. Evitare di toccare direttamente la gonade, che la danneggerebbe (Figura 4E). Per assicurarti che la gonade sia sufficientemente aderente al piatto, sposta l'ago con un delicato movimento circolare attorno alla gonade, se si muove, tocca l'ago sul tessuto aderente rimanente e dirigi la gonade verso una regione fresca di scivolamento appiccicoso della copertura. Ripeti questo processo fino a quando non c'è alcun movimento rilevabile della gonade.</li>
		<li>Ritorna alla carcassa dell'embrione e seziona la seconda gonade. Ripeti questo processo sul maggior numero possibile di embrioni ma NON superare i 25 minuti. La vitalità tissutale sarà compromessa nella soluzione di Ringer dopo più di ~ 40-45 minuti.</li>
	</ol></li>
	<li>Una volta completate le dissezioni, utilizzare un marcatore indelebile per aggiungere segni di registrazione al bordo esterno della parabola di imaging per registrarne l'orientamento durante la dissezione.</li>
	<li>Rimuovere la striscia rivestita di colla dal piatto.<ol>
<li>Inserire delicatamente la punta inferiore di un paio di pinze sotto la striscia, stringere e inclinare lentamente la striscia verso l'alto per liberarla dal piatto con il minor scorrimento possibile della soluzione di Ringer per ridurre al minimo il disturbo delle gonadi aderenti. NOTA: la striscia deve essere inclinata lontano dalle gonadi sezionate.</li>
	</ol></li>
	<li>Portare delicatamente il piatto al microscopio per immagini in modo da evitare lo slittamento della soluzione di Ringer.</li>
</ol>5. Imaging
<ol><li>Posizionare la parabola di imaging nel supporto del palco, utilizzando i segni di registrazione per posizionare la parabola nell'orientamento approssimativo come durante la dissezione. Utilizzando la microscopia a campo luminoso e un obiettivo a bassa potenza (~ 10x), identificare e mettere a fuoco qualsiasi pezzo di tessuto che aderisce al coperchio. Cambia le impostazioni dell'oculare per rivelare la fluorescenza e, utilizzando gli oculari binoculari, scansiona sistematicamente il piatto, contrassegnando la posizione di ciascuna gonade all'interno del software di imaging (vedi Tabella dei materiali). NOTA: assicurarsi che le gonadi siano centrate nel campo visivo prima di contrassegnare le posizioni.</li>
	<li>Rimuovere delicatamente l'intero gruppo portastadio, con la parabola di imaging nel supporto, e posizionare l'assemblaggio sul banco di lavoro.</li>
	<li>Sostituire la soluzione di Ringer con il mezzo di imaging preparato contenente insulina (vedere i passaggi 1.2 e 3.1).<ol>
<li>Utilizzare un P1000 per rimuovere tutta la soluzione di Ringer dalla sporgenza superiore interna della parabola di imaging (non pipettare Ringer dalla regione di scorrimento del coperchio centrale). Quindi, passa a un P200 e posiziona la sua punta appena sotto la superficie dei Ringer rimanenti nella regione centrale. Rimuovere con attenzione 50-100 μL di Ringer; NON rimuovere l'intera soluzione.</li>
		<li>Aspirare ~ 200 μL di supporti di imaging e, posizionando nuovamente la punta P200 appena sotto la superficie della suoneria rimanente, aggiungere lentamente questo supporto di imaging. Quindi, aggiungere il supporto di imaging rimanente (~ 1.300 μL) al piatto, a partire dal bordo più esterno della sporgenza superiore. Durante il pipettaggio, spostati verso la cupola centrale del fluido e alla fine unisci i due spazzolando la punta della pipetta su entrambi. Posizionare il coperchio sul piatto. NOTA: il supporto di imaging deve coprire l'intero diametro interno del piatto, con una profondità di circa 2 mm, per evitare l'evaporazione (Figura 4D).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Passare il microscopio a un obiettivo di potenza superiore (63x, 1,2 NA), applicare il fluido di immersione appropriato in base all'obiettivo utilizzato (tipo di fluido ad immersione e indice di rifrazione richiesto dall'obiettivo) e quindi sostituire l'assieme portastadio. Utilizzare la microscopia a campo luminoso per concentrarsi sul tessuto aderente al fondo della parabola di imaging. NOTA: se il palco non è stato spostato, l'ultima gonade dovrebbe essere visualizzata una volta che l'obiettivo è focalizzato.</li>
	<li>Passa attraverso ogni posizione della gonade contrassegnata e regola quella posizione, se necessario. Seleziona quali gonadi visualizzare in base alla chiarezza dell'immagine, al sesso delle gonadi, ecc. Personalizza le impostazioni di imaging (multicanale, tempi di esposizione, intensità laser, incrementi della serie Z, time-lapse con intervalli appropriati, ecc.). Inizia l'imaging. NOTA: Le gonadi maschili possono essere identificate dalla presenza sia di una nicchia, sia all'estremità opposta della gonade, un gruppo di piccole cellule somatiche altamente circolari chiamate precursori gonadici somatici maschili-specifici (msSGP). Se viene utilizzato il marcatore fluorescente six4-eGFP::moesin, le cellule di nicchia sono le seconde cellule più luminose nella gonade, la più luminosa è la msSGP. In questa fase, le gonadi femminili non hanno né una nicchia né msSGP.</li>
</ol>

<ol>
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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+Drosophila+gonad+formation+reveals+roles+for+Six4+in+regulating+germline+and+somatic+cell+migration.">Live imaging of Drosophila gonad formation reveals roles for Six4 in regulating germline and somatic cell migration.</a> BMC Devlopmental Biology. 7, 1-9 (2007).</li><li>Sheng, X. R., Brawley, C. M., Matunis, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dedifferentiating+spermatogonia+outcompete+somatic+stem+cells+for+niche+occupancy+in+the+Drosophila+testis.">Dedifferentiating spermatogonia outcompete somatic stem cells for niche occupancy in the Drosophila testis.</a> Cell Stem Cell. 5, 191-203 (2009).</li><li>Tanentzapf, G., Devenport, D., Godt, D., Brown, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Europe+PMC+Funders+Group+integrin-dependent+anchoring+of+a+stem+cell+niche.">Europe PMC Funders Group integrin-dependent anchoring of a stem cell niche.</a> Nature Cell Biology. 9, 1413-1418 (2007).</li><li>Brady, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+making+very+fine,+durable+dissecting+needles+by+sharpening+tungsten+wire+electrolytically+a+motorized+molluscicide+dispenser.">A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically a motorized molluscicide dispenser.</a> Bulletin of the World Health Organization. , 105-106 (1960).</li><li>Featherstone, D. E., Chen, K., Broadie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harvesting+and+preparing+Drosophila+embryos+for+electrophysiological+recording+and+other+procedures.">Harvesting and preparing Drosophila embryos for electrophysiological recording and other procedures.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. , (2009).</li><li>JoVE. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryo+and+Larva+Harvesting+and+Preparation.">Embryo and Larva Harvesting and Preparation.</a> JoVE Science Education Database. , (2020).</li><li>Cold Spring Harbor Protocols. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ringer's+solution+for+Drosophila.">Ringer's solution for Drosophila.</a> Cold Spring Harbor Protocols. , (2011).</li><li>Schuh, M., Lehner, C. F., Heidmann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporation+of+Drosophila+CID/CENP-A+and+CENP-C+into+Centromeres+during+Early+Embryonic+Anaphase.">Incorporation of Drosophila CID/CENP-A and CENP-C into Centromeres during Early Embryonic Anaphase.</a> Current Biology. 17, 237-243 (2007).</li><li>Lin, B., Luo, J., Lehmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collectively+stabilizing+and+orienting+posterior+migratory+forces+disperses+cell+clusters+in+vivo.">Collectively stabilizing and orienting posterior migratory forces disperses cell clusters in vivo.</a> Nature Communications. 11, 1-16 (2020).</li><li>Prasad, M., Jang, A. C. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+culturing+drosophila+melanogaster+stage+9+egg+chambers+for+live+imaging.">A protocol for culturing drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging.</a> Nature Protocols. 2, 2467-2473 (2007).</li><li>Gabay, L., Lowell, S., Rubin, L. L., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deregulation+of+dorsoventral+patterning+by+FGF+confers+trilineage+differentiation+capacity+on+CNS+stem+cells+in+vitro.">Deregulation of dorsoventral patterning by FGF confers trilineage differentiation capacity on CNS stem cells in vitro.</a> Neuron. 40, 485-499 (2003).</li><li>Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+elasticity+directs+stem+cell+lineage+specification.">Matrix elasticity directs stem cell lineage specification.</a> Cell. 126, 677-689 (2006).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Durante la gonadogenesi, la gonade embrionale, e in particolare la nicchia delle cellule staminali all'interno della gonade maschile15, subisce rapidi cambiamenti morfologici. I meccanismi di sviluppo che sono alla base di questi cambiamenti dinamici sono meglio compresi attraverso tecniche di live-imaging. Tuttavia, allo stadio embrionale 17, l'imaging in vivo della gonade è reso impossibile dall'insorgenza di contrazioni muscolari su larga scala17. Con questo pr...

Il testicolo della Drosophila melanogaster è servito come paradigma per la nostra comprensione di molti processi cellulari dinamici. Gli studi di questo modello hanno fatto luce sulla regolazione della divisione delle cellule staminali 1,2,3, sullo sviluppo delle cellule germinali 4,5, sulla biologia del piRNA 6,7,8 e sugli eventi di segnalazione delle cellule staminali di nicchia 9,10,11,12,13. Questo modello è vantaggioso perché è geneticamente trattabile14,15 ed è uno dei pochi in cui possiamo vivere le cellule staminali nel loro ambiente naturale 3,16,17,18. Tuttavia, l'imaging dal vivo di questo modello è stato limitato al tessuto adulto e ai primi stadi embrionali, lasciando una lacuna nella nostra conoscenza della dinamica gonadica nell'embrione tardivo, lo stadio preciso in cui la nicchia si sta formando per la prima volta e inizia a funzionare.
La gonade embrionale in stadio avanzato è una sfera, costituita da cellule di nicchia somatiche nella parte anteriore e cellule germinali incistate da cellule gonadiche somatiche in più regioni posteriori19. Questo organo può essere ripreso vivo fino allo stadio embrionale precoce 17 17,20,21. Ulteriori immagini sono prevenute a causa dell'inizio di contrazioni muscolari su larga scala. Queste contrazioni sono così gravi che spingono la gonade fuori dal fotogramma di imaging e tale movimento non può essere corretto con un software di imaging. Il nostro laboratorio è interessato a svelare i meccanismi della formazione di nicchia, che si verifica durante questo periodo sfuggente per l'imaging dal vivo. Pertanto, abbiamo generato un approccio ex vivo per l'immagine dal vivo della gonade a partire dallo stadio embrionale 16, facilitando lo studio della dinamica cellulare durante questo periodo cruciale di sviluppo delle gonadi. Precedenti lavori del nostro laboratorio mostrano che questa imaging ex vivo ricapitola fedelmente lo sviluppo delle gonadi in vivo 17. Questa tecnica è la prima e unica del suo genere per la gonade embrionale drosophila.
Qui presentiamo il protocollo di dissezione richiesto per l'imaging live ex vivo della gonade durante le fasi embrionali tardive. Questo protocollo può essere combinato con trattamenti farmacologici o manipolazione transgenica di specifici lignaggi cellulari all'interno della gonade. Usando questa tecnica, abbiamo ripreso con successo le fasi della formazione di nicchia delle cellule staminali17. Questo approccio di imaging è quindi strumentale per il campo della biologia delle cellule staminali, in quanto consentirà la visualizzazione delle fasi iniziali della formazione di nicchia in tempo reale all'interno del suo ambiente naturale15,17. Mentre questo metodo è utile per il campo della biologia delle cellule staminali, è inoltre applicabile per visualizzare eventuali processi dinamici che si verificano nella gonade durante questo punto temporale di sviluppo, compresi i riarrangiamenti cellulari22, l'adesione cellulare 2,12,23 e la migrazione cellulare23. Questo protocollo di dissezione migliorerà così la nostra comprensione di molti processi biologici cellulari fondamentali.

<table><tbody><tr><td>Alfa Aesar Tungsten wire</td><td>Fisher Scientific</td><td>AA10408G6</td><td>0.25mm (0.01 in.) dia., 99.95% (metals basis)</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;D. melanogaster:&lt;/em&gt; His2Av::mRFP1</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC)</td><td>FBtp0056035</td><td>Schuh, Lehner, &amp;amp; Heidmann, Current Biology, 2007</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;D. melanogaster: nos&lt;/em&gt;-lifeact::tdtomato</td><td>Gift from Ruth Lehmann Lab</td><td></td><td>Lin, Luo, &amp;amp; Lehmann, Nature Communications, 2020: nos5&#039;- Lifeact-tdtomato p2a tdkatushka2 Caax nos3&#039;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;D. melanogaster: P-Dsix4-eGFP::Moesin&lt;/em&gt;</td><td></td><td>FBtp0083398</td><td>Sano et al., PLoS One, 2012</td></tr><tr><td>Diamond-tipped knife</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Double-sided tape</td><td>Scotch</td><td>665</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>GIBCO</td><td>10082</td><td></td></tr><tr><td>Imaging dish</td><td>MatTek</td><td>P35GC-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Imaging software</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>MetaMorph Microscopy Automation and Image Analysis Software v7.8.4.0</td></tr><tr><td>Insulin, bovine</td><td>Sigma</td><td>l0516</td><td>Store aliquots at 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Needle holder</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-955</td><td></td></tr><tr><td>Nytex basket</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/streptomycin</td><td>Corning</td><td>30-002-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Ringer&#039;s solution</td><td></td><td></td><td>2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 130 mM NaCl, 5mM KCl, 36 mM Sucrose, 5mM Hepe&amp;rsquo;s Buffer; adjusted with NaOH until pH of 7.3 is achieved</td></tr><tr><td>Schneider&#039;s Insect Media</td><td>GIBCO</td><td>21720-024</td><td></td></tr></tbody></table>

dissection and live-imaging of the late embryonic drosophila gonad

La gonade embrionale maschile Drosophila melanogaster è un modello vantaggioso per studiare vari aspetti della biologia dello sviluppo tra cui, ma non solo, lo sviluppo delle cellule germinali, la biologia del piRNA e la formazione di nicchia. Qui, presentiamo una tecnica di dissezione per l'immagine dal vivo della gonade ex vivo durante un periodo in cui l'imaging dal vivo dal vivo è altamente inefficace. Questo protocollo delinea come trasferire gli embrioni in un piatto di imaging, scegliere embrioni maschili opportunamente messi in scena e sezionare la gonade dal tessuto circostante pur mantenendo la sua integrità strutturale. Dopo la dissezione, le gonadi possono essere fotografate utilizzando un microscopio confocale per visualizzare i processi cellulari dinamici. La procedura di dissezione richiede tempi e destrezza precisi, ma forniamo informazioni su come prevenire errori comuni e su come superare queste sfide. Per quanto ne sappiamo, questo è il primo protocollo di dissezione per la gonade embrionale Drosophila e consentirà l'imaging dal vivo durante una finestra di tempo altrimenti inaccessibile. Questa tecnica può essere combinata con manipolazioni transgeniche farmacologiche o specifiche del tipo cellulare per studiare eventuali processi dinamici che si verificano all'interno o tra le cellule nel loro ambiente gonadico naturale.

Illustriamo la preparazione del piatto di imaging nella Figura 1, come descritto in "Preparazione del giorno della dissezione". Questi metodi dovrebbero alla fine portare a embrioni ben idratati aderenti a una striscia di copertura, che viene temporaneamente fissata al fondo del piatto e immersa nella soluzione di Ringer (Figura 1F). Un coltello con punta di diamante consente di tagliare in modo pulito un coperchio di 22 x 22 mm in tre o quattro strisce più pic...

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Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

Qui, forniamo un protocollo di dissezione necessario per l'immagine dal vivo della gonade maschio drosophila embrionale tardiva . Questo protocollo consentirà l'osservazione di processi cellulari dinamici in condizioni normali o dopo manipolazione transgenica o farmacologica.

Dissezione e Live-Imaging della Drosophila Gonad embrionale tardiva

The Drosophila melanogaster male embryonic gonad is an advantageous model to study various aspects of developmental biology including, but not limited to, ...

dissection-and-live-imaging-of-the-late-embryonic-drosophila-gonad

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

3.2K Views.  University of Pennsylvania. Qui, forniamo un protocollo di dissezione necessario per l'immagine dal vivo della gonade maschio drosophila embrionale tardiva . Questo protocollo consentirà l'osservazione di processi cellulari dinamici in condizioni normali o dopo manipolazione transgenica o farmacologica.

Video: Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track during live cell imaging. These processes include: retinal rotation, cell growth and organismal movement. Additionally, irregularities in the topology of the epithelium, including subtle bumps and folds often introduced as the pupa is prepared for imaging, make it challenging to acquire in-focus images of more than a few ommatidia in a single focal plane. The workflow outlined here remedies these issues, allowing easy analysis of cellular processes during Drosophila pupal eye development. Appropriately-staged pupae are arranged in an imaging rig that can be easily assembled in most laboratories. Ubiquitin-DE-Cadherin:GFP and GMR-GAL4&#8211;driven UAS-&#945;-catenin:GFP are used to visualize cell boundaries in the eye epithelium 1-3. After deconvolution is applied to fluorescent images captured at multiple focal planes, maximum projection images are generated for each time point and enhanced using image editing software. Alignment algorithms are used to quickly stabilize superfluous motion, making individual cell behavior easier to track.

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

This protocol presents an efficient method for imaging the live Drosophila pupal eye neuroepithelium. This method compensates for tissue movement and uneven topology, enhances visualization of cell boundaries through the use of multiple GFP-tagged junction proteins, and uses an easily-assembled imaging rig.

Live-imaging del<em&gt; Drosophila</em&gt; Pupa Eye

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Live Imaging of Glial Cell Migration in the Drosophila Eye Imaginal Disc

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons. While recent progress has been made to describe the live migration of glial cells in the developing pupal wing (1), studies of Drosophila glial cell migration have typically involved the examination of fixed tissue. Live microscopic analysis of motile cells offers the ability to examine cellular behavior throughout the migratory process, including determining the rate of and changes in direction of growth. Paired with use of genetic tools, live imaging can be used to determine more precise roles for specific genes in the process of development. Previous work by Silies et al. (2) has described the migration of glia originating from the optic stalk, a structure that connects the developing eye and brain, into the eye imaginal disc in fixed tissue. Here we outline a protocol for examining the live migration of glial cells into the Drosophila eye imaginal disc. We take advantage of a Drosophila line that expresses GFP in developing glia to follow glial cell progression in wild type and in mutant animals.

Here we describe a protocol to examine the migration of glial cells into the developing Drosophila eye using live microscopic analysis paired with GFP tagged glial cells.

Vivere Imaging della migrazione cellule gliali nella Eye Disco Drosophila immaginale

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons.  While ...

Biologia

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Visualizing developing organ formation as well as progession and treatment of disease often heavily relies on the ability to optically interrogate molecular and functional changes in intact living organisms. Most existing optical imaging methods are inadequate for imaging at dimensions that lie between the penetration limits of modern optical microscopy (0.5-1mm) and the diffusion-imposed limits of optical macroscopy (&gt;1cm) [1]. Thus, many important model organisms, e.g. insects, animal embryos or small animal extremities, remain inaccessible for in-vivo optical imaging. 
Although there is increasing interest towards the development of nanometer-resolution optical imaging methods, there have not been many successful efforts in improving the imaging penetration depth. The ability to perform in-vivo imaging beyond microscopy limits is in fact met with the difficulties associated with photon scattering present in tissues. Recent efforts to image entire embryos for example [2,3] require special chemical treatment of the specimen, to clear them from scattering, a procedure that makes them suitable only for post-mortem imaging. These methods however evidence the need for imaging larger specimens than the ones usually allowed by two-photon or confocal microscopy, especially in developmental biology and in drug discovery.
We have developed a new optical imaging technique named Mesoscopic Fluorescence Tomography [4], which appropriate for non-invasive in-vivo imaging at dimensions of 1mm-5mm. The method exchanges resolution for penetration depth, but offers unprecedented tomographic imaging performance and it has been developed to add time as a new dimension in developmental biology observations (and possibly other areas of biological research) by imparting the ability to image the evolution of fluorescence-tagged responses over time. As such it can accelerate studies of morphological or functional dependencies on gene mutations or external stimuli, and can importantly, capture the complete picture of development or tissue function by allowing longitudinal time-lapse visualization of the same, developing organism.
The technique utilizes a modified laboratory microscope and multi-projection illumination to collect data at 360-degree projections. It applies the Fermi simplification to Fokker-Plank solution of the photon transport equation, combined with geometrical optics principles in order to build a realistic inversion scheme suitable for mesoscopic range. This allows in-vivo whole-body visualization of non-transparent three-dimensional structures in samples up to several millimeters in size.
We have demonstrated the in-vivo performance of the technique by imaging three-dimensional structures of developing Drosophila tissues in-vivo and by following the morphogenesis of the wings in the opaque Drosophila pupae in real time over six consecutive hours.

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Mesoscopic fluorescence tomography operates beyond the penetration limits of tissue-sectioning fluorescence microscopy. The technique is based on multi-projection illumination and a photon transport description. We demonstrate in-vivo whole-body 3D visualization of the morphogenesis of GFP-expressing wing imaginal discs in Drosophila melanogaster.

Mesoscopici fluorescenza per Tomografia In-vivo Imaging di sviluppo Drosophila</em

Visualizing  developing organ formation as well as progession and treatment of disease often  heavily relies on the ability to optically interrogate ...

Live Dissection of Drosophila Embryos: Streamlined Methods for Screening Mutant Collections by Antibody Staining

Drosophila embryos between stages 14 and 17 of embryonic development can be readily dissected to generate "fillet" preparations. In these preparations, the central nervous system runs down the middle, and is flanked by the body walls. Many different phenotypes have been examined using such preparations. In most cases, the fillets were generated by dissection of antibody-stained fixed whole-mount embryos. These "fixed dissections" have some disadvantages, however. They are time-consuming to execute, and it is difficult to sort mutant (GFP-negative) embryos from stocks in which mutations are maintained over GFP balancer chromosomes. Since 2002, our group has been conducting deficiency and ectopic expression screens to identify ligands for orphan receptors. In order to do this, we developed streamlined protocols for live embryo dissection and antibody staining of collections containing hundreds of balanced lines. We have concluded that it is considerably more efficient to examine phenotypes in large collections of stocks by live dissection than by fixed dissection. Using the protocol described here, a single trained individual can screen up to 10 lines per day for phenotypes, examining 4-7 mutant embryos from each line under a compound microscope. This allows the identification of mutations conferring subtle, low-penetrance phenotypes, since up to 70 hemisegments per line are scored at high magnification with a 40X water-immersion lens.

Live Dissection of Drosophila Embryos: Streamlined Methods for Screening Mutant Collections by Antibody Staining

We describe a streamlined protocol for generating "fillet" preparations of Drosophila embryos of specific genotypes. This protocol allows efficient execution of a variety of genetic screens. It also allows excellent visualization of structures in the late embryo.

Dissezione di vivere Drosophila Embrioni: Metodi semplificati per lo screening Collezioni Mutant dalla colorazione anticorpale

Drosophila embryos between stages 14 and 17 of embryonic development can be readily dissected to generate "fillet" preparations.  In these preparations, ...

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

Within multicellular organisms, mature tissues and organs display high degrees of order in the spatial arrangements of their constituent cells. A remarkable example is given by sensory epithelia, where cells of the same or distinct identities are brought together via cell-cell adhesion showing highly organized planar patterns. Cells align to one another in the same direction and display equivalent polarity over large distances. This organization of the mature epithelia is established over the course of morphogenesis. To understand how the planar arrangement of the mature epithelia is achieved, it is crucial to track cell orientation and growth dynamics with high spatiotemporal fidelity during development in vivo. Robust analytical tools are also essential to identify and characterize local-to-global transitions. The Drosophila pupa is an ideal system to evaluate oriented cell shape changes underlying epithelial morphogenesis. The pupal developing epithelium constitutes the external surface of the immobile body, allowing long-term imaging of intact animals. The protocol described here is designed to image and analyze cell behaviors at both global and local levels in the pupal abdominal epidermis as it grows. The methodology described can be easily adapted to the imaging of cell behaviors at other developmental stages, tissues, subcellular structures, or model organisms.

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

This protocol is designed for the imaging and analysis of the dynamics of cell orientation and tissue growth in the Drosophila abdominal epithelia as the fruit fly undergoes metamorphosis. The methodology described here can be applied to the study of different developmental stages, tissues, and subcellular structures in Drosophila or other model organisms.

Imaging e analisi dell'orientamento dei tessuti e delle dinamiche di crescita nell'epiteliale della Drosophila in via di sviluppo durante le fasi pupali

Within multicellular organisms, mature tissues and organs display high degrees of order in the spatial arrangements of their constituent cells. A ...

Imaging di espianti cerebrali vivi da larve di Drosophila melanogaster terzo stadio

Live-Cell Imaging of Drosophila melanogaster Third Instar Larval Brains

Drosophila neural stem cells (neuroblasts, NBs hereafter) undergo asymmetric divisions, regenerating the self-renewing neuroblast, while also forming a differentiating ganglion mother cell (GMC), which will undergo one additional division to give rise to two neurons or glia. Studies in NBs have uncovered the molecular mechanisms underlying cell polarity, spindle orientation, neural stem cell self-renewal, and differentiation. These asymmetric cell divisions are readily observable via live-cell imaging, making larval NBs ideally suited for investigating the spatiotemporal dynamics of asymmetric cell division in living tissue. When properly dissected and imaged in nutrient-supplemented medium, NBs in explant brains robustly divide for 12-20 h. Previously described methods are technically difficult and may be challenging to those new to the field. Here, a protocol is described for the preparation, dissection, mounting, and imaging of live third-instar larval brain explants using fat body supplements. Potential problems are also discussed, and examples are provided for how this technique can be used.

Autore in primo piano: Indagine sulle dinamiche di divisione cellulare asimmetrica: un protocollo per l'imaging dal vivo di espianti di cervello larvale di Drosophila 

Here, we discuss a workflow to prepare, dissect, mount, and image live explant brains from Drosophila melanogaster third instar larvae to observe the cellular and subcellular dynamics under physiological conditions.

Imaging delle cellule vive di Drosophila melanogaster Terzo stadio Larvale Cervelli

Drosophila neural stem cells (neuroblasts, NBs hereafter) undergo asymmetric divisions, regenerating the self-renewing neuroblast, while also forming a ...

Real-Time Imaging of Germline Stem Cells in Drosophila Ex Vivo Germaria Culture

Extended Live Imaging of Female Drosophila melanogaster Germline Stem Cell Niches

Live imaging methods allow the analysis of dynamic cellular processes in detail and in real-time. The Drosophila ovary represents an excellent model to explore the dynamics of a myriad of developmental processes, such as cell division, stemness, differentiation, migration, apoptosis, autophagy, cellular adhesion, etc., over time. Recently, we have implemented an extended ex vivo culture and live imaging of the female Drosophila GSC niche. Using a Drosophila line harboring a GFP::Par-1 transgene as an example, this method allows the visualization of the GSCs&#39; asymmetric division within their niche and the description of the changes in the spectrosome morphology along the cell cycle. Here, we present a detailed protocol for the ex vivo culture of Drosophila germaria, enabling prolonged visualization of the female GSC niche. Importantly, this protocol is broadly applicable to live imaging GSCs with multiple fluorescently tagged proteins of interest that are available in stock centers and/or in the Drosophila research community.

Here, we provide a detailed protocol to perform live imaging of the asymmetric division of germline stem cells (GSCs) in the Drosophila ovarian niche. We use a transgenic line that ubiquitously expresses a green fluorescent protein (GFP) fusion of the spectrosome protein Par-1.

Live imaging methods allow the analysis of dynamic cellular processes in detail and in real-time. The Drosophila ovary represents an excellent model to ...

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

The establishment of functional neuromuscular circuits relies on precise connections between developing motor axons and target muscles. Motor neurons extend growth cones to navigate along specific pathways by responding to a large number of axon guidance cues that emanate from the surrounding extracellular environment. Growth cone target recognition also plays a critical role in neuromuscular specificity. This work presents a standard immunohistochemistry protocol to visualize motor neuron projections of late stage-16 Drosophila melanogaster embryos. This protocol includes a few key steps, including a genotyping procedure, to sort the desired mutant embryos; an immunostaining procedure, to tag embryos with fasciclin II (FasII) antibody; and a dissection procedure, to generate filleted preparations from fixed embryos. Motor axon projections and muscle patterns in the periphery are much better visualized in flat preparations of filleted embryos than in whole-mount embryos. Therefore, the filleted preparation of fixed embryos stained with FasII antibody provides a powerful tool to characterize the genes required for motor axon pathfinding and target recognition, and it can also be applied to both loss-of-function and gain-of-function genetic screens.

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

This work details a standard immunohistochemistry method to visualize motor neuron projections of late stage-16 Drosophila melanogaster embryos. The filleted preparation of fixed embryos stained with FasII antibody provides a powerful tool to characterize the genes required for motor axon pathfinding and target recognition during neural development.

Visualizzazione del modello di proiezione Axonal dei motoni embrionali in<em&gt; Drosophila</em

The establishment of functional neuromuscular circuits relies on precise connections between developing motor axons and target muscles. Motor neurons ...

Dissezione e Live-Imaging della Drosophila Gonad embrionale tardiva

Riepilogo

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Live-imaging del

Vivere Imaging della migrazione cellule gliali nella Eye Disco Drosophila immaginale

Mesoscopici fluorescenza per Tomografia In-vivo Imaging di sviluppo Drosophila

Dissezione di vivere Drosophila Embrioni: Metodi semplificati per lo screening Collezioni Mutant dalla colorazione anticorpale

Imaging e analisi dell'orientamento dei tessuti e delle dinamiche di crescita nell'epiteliale della Drosophila in via di sviluppo durante le fasi pupali

Imaging delle cellule vive di Drosophila melanogaster Terzo stadio Larvale Cervelli

Imaging delle cellule vive di Drosophila melanogaster Terzo stadio Larvale Cervelli

Imaging delle cellule vive di Drosophila melanogaster Terzo stadio Larvale Cervelli

Extended Live Imaging of Female Drosophila melanogaster Germline Stem Cell Niches

Visualizzazione del modello di proiezione Axonal dei motoni embrionali in