Name: assay to measure nucleocytoplasmic transport in real time within motor neuron-like nsc-34 cells
Uploaded: 2017-05-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
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Ringraziamo tutti i membri del laboratorio AI per i loro utili commenti e suggerimenti. Vorremmo ringraziare il Prof. Mark Hipp (Istituto Max Planck per la Biochimica) per fornirci il vettore shuttle-GFP. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni della Fondazione israeliana di scienza (ISF # 124/14), della Fondazione Binational Science (BSF # 2013325), della FP7 Marie Curie Career Integration Grant (CIG # 333794) e dell&#39;Istituto Nazionale di Psicobiologia in Israele NIPI # b133-14 / 15).

1. Preparazione della linea cellulare <ol><li> Scavare circa 1.000.000 cellule del midollo spinale del neuroblastoma del mouse (cellule NSC-34) che sono state immagazzinate in un contenitore di azoto liquido. Usare un incubatore ad acqua di 37 ° C fino a quando le cellule sono completamente scongelate. </li><li> Aggiungere il terreno fresco e caldo (mezzo DMEM contenente 10% di siero fetale fetale (FBS), 1% di L-glutammina e 1% di antibiotici pen-strep). </li><li> Centrifugare le cellule scongelate (SL16R) a 500 xg per 5 minuti, formando un pellet di cellule. Scartare il mezzo e aggiungere 1 ml di nuovo mezzo per la risospensione cellulare. </li><li> Posizionare le cellule risospese in una pallina da 15 mL e aggiungere un ulteriore 5 mL di terreno. Incubare le cellule durante la notte in un incubatore sterile con 5% di CO 2 a 37 ° C. </li><li> Parallelamente, posizionare 8 coperchi non rivestiti (vetro di copertura: 12 mm, spessore 0,13-0,17 mm) in un piatto da 60 mm di coltura e sterilizzare utilizzando il 70% di etanolo e l&#39;esposizione a 30 minuti di luce UV finché non sia asciutta. Aggiungere il mezzo a ogni piatto e smalti per lavare l&#39;etanolo residuo.</li><li> Aggiungere il tampone di trysina (2,5 g di tripsina e 0,2 g di EDTA in 1 L di Hanks &#39;Balanced Salt Solution) alle cellule dopo aver raggiunto la confluenza del 90% (circa 6 milioni di cellule per pallone) per consentire alle cellule aderenti di dissociarsi. NOTA: Le cellule NSC-34 sono sensibili e richiedono solo 15 s di incubazione del tampone di trypsina e 1 min di incubazione aggiuntiva senza trypsina prima della dissociazione usando il mezzo. </li><li> Piattare le cellule sui piatti di coltura da 60 mm che già contengono le copertine con 3 ml di mezzo, circa 350.000 per piatto. Lasciarli nell&#39;incubatrice per 24 ore per consentire l&#39;attaccatura cellulare sui coperchi. </li></ol> 2. Trasfezione cellulare NOTA: Dopo circa 24 ore, le cellule NSC-34 raggiungeranno la confluenza del 40% (circa 800.000 celle) e saranno pronte per la transfezione. <ol><li> Preparare il mezzo puro DMEM (300 μL di media DMEM per ogni piatto di coltura da 60 mm) in vasca di microcentrifuga sterilees. </li><li> Aggiungere 2 μg di ciascun plasmo necessario per la trasfezione in ogni tubo di microcentrifuga contenente DMEM. NOTA: Il plasmide shuttle-GFP è obbligatorio in tutte le cellule. </li><li> Aggiungere il reagente di transfection a tutti i tubi di microcentrifuga che contengono i loro plasmidi necessari. Qui, aggiungere 4 μL del reagente di transfection commerciale per ogni 2 μg di DNA. </li><li> Vortice i tubi di microcentrifuga contenenti DMEM, i plasmidi e il reagente di trasfezione e incubandoli a temperatura ambiente per 25 min. </li><li> Aggiungere ogni tubo di microcentrifuga a un piatto di coltura e mescolare delicatamente il piatto per formare una soluzione omogenea. Riporre il piatto nell&#39;incubatore per 48 ore. NOTA: poiché GFP deve essere espresso in tutte le cellule, l&#39;efficienza di trasfusione shuttle-GFP può essere parzialmente esaminata e pre-testata utilizzando microscopia fluorescente dopo transfection overnight. Un esame completo delle proteine ​​espresse non fluorescenti può essere condotto utilizzando un analogo immunoblotè. </li></ol> 3. Microscopia <ol><li> Fissare le copertine contenenti le cellule NSC-34 trasfettate in un supporto per copertina e lavare delicatamente con la soluzione salina fosfatizzata (PBS) per rimuovere le cellule morte staccate. </li><li> Identificare una patch cellulare appropriata utilizzando un filtro fluorescente verde con un microscopio invertito. NOTA: Una patch cellulare appropriata è definita come un campo di visione del microscopio che mostra un gran numero di celle (20-30 celle in un campo) e in cui i nuclei sono chiaramente definiti nelle cellule. I nuclei cellulari all&#39;interno della patch cellulare vengono identificati per primo con l&#39;occhio e sono contrassegnati manualmente dal software di imaging. </li><li> Aggiungere 200 μl di un buffer di Leptomycin B (LMB) inibitore exportin-1 contenente 10 μg / ml di LMB in PBS ai coperchi, gocciolando il tampone sui coperchietti sotto il microscopio. NOTA: Questo punto nel tempo è impostato come intervallo zero. </li><li> Quantifica l&#39;intensità fluorescente dei nuclei segnati in intervalli di 3 s per circa 400-500 s. </li><li&gt; Prova tra 3 e 5 coperchi di copertura per ogni gruppo di transfection in ogni singolo esperimento. </li></ol> 4. Analisi NOTA: poiché diverse cellule esprimono diversi livelli di shuttle-GFP fluorescente, è importante normalizzare l&#39;intensità fluorescente nucleare di ogni cellula alla propria intensità fluorescente iniziale. <ol><li> Normalizzare l&#39;intensità fluorescente dei nuclei marcati dividendo l&#39;intervallo fluorescente di 3 ciascun nucleo con la media dei sei intervalli iniziali di quel nucleo. </li><li> Dopo la normalizzazione di ciascun nucleo, produrre una curva di intensità fluorescente che rappresenta la variazione della fluorescenza del nucleo in funzione del tempo per ogni patch cellulare. Per fare questo, calcolare la media di tutte le celle in ciascuna patch cellulare (composta da circa 20-30 celle in ciascuna patch). NOTA: La curva di intensità fluorescente del nucleo assomiglia a una curva di saturazione di Michaelis-Menten, che è meglio osservata inMe periodi. Ciò è dovuto a una diminuzione degli importi citosolici di shuttle-GFP con il tempo a causa del trasporto nucleare. Questa diminuzione diminuisce statisticamente la probabilità che un shuttle-GFP trasferisca nel nucleo, raggiungendo così la saturazione della fluorescenza nucleare. La pendenza derivata dalla velocità iniziale lineare della curva produce la frequenza di ingresso V max nel nucleo. </li><li> Analizzare le pendenze V max di ogni patch cellulare, derivate da tre a cinque esperimenti indipendenti, utilizzando il software di grafica per produrre una pendenza che rappresenta ciascun gruppo sperimentale. Eseguire la quantificazione utilizzando l&#39;analisi statistica ANOVA a senso unico. </li></ol> 5. Validazione della espressione della proteina <ol><li> Posizionare piatti di coltura da 60 mm contenenti le cellule residue (non utilizzate nell&#39;esperimento precedente) da ciascun gruppo sperimentale su ghiaccio. </li><li> Smaltire il mezzo e lavare le cellule due volte con PBS per diluire e lavare il mezzo rimanente. </li><li> Trattare le cellule con 200-400ΜL di tampone di lisi contenente PBS, 0,5% Triton e tablet di cocktail inibitore della proteasi (PI). Raschiare utilizzando un raschiatore di celle. </li><li> Raccogliere le cellule in tampone di lisi in un tubo di microcentrifuga e omogeneizzare con un omogeneizzatore a 4000 rpm per 1 min sotto ghiaccio. </li><li> Centrifugare le cellule omogeneizzate a 2.500 xg per 10 min. Raccogliere il surnatante, quantificare la concentrazione proteica utilizzando un dosaggio di Bradford e conservare fino all&#39;uso a -20 ° C. </li><li> Raccogliere tra 30 e 70 μg di proteina totale (a seconda della proteina) e caricarla in un gel SDS-PAGE per testare l&#39;espressione proteica utilizzando un dosaggio immunoblot. </li></ol>

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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+expanding+biology+of+the+C9orf72+nucleotide+repeat+expansion+in+neurodegenerative+disease.">The expanding biology of the C9orf72 nucleotide repeat expansion in neurodegenerative disease.</a> Nat Rev Neurosci. 17, 383-395 (2016).</li><li>Woerner, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+protein+aggregates+interfere+with+nucleocytoplasmic+transport+of+protein+and+RNA.">Cytoplasmic protein aggregates interfere with nucleocytoplasmic transport of protein and RNA.</a> Science. 351, 173-176 (2016).</li><li>Tao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleolar+stress+and+impaired+stress+granule+formation+contribute+to+C9orf72+RAN+translation-induced+cytotoxicity.">Nucleolar stress and impaired stress granule formation contribute to C9orf72 RAN translation-induced cytotoxicity.</a> Hum Mol Genet. 24, 2426-2441 (2015).</li><li>Wen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antisense+proline-arginine+RAN+dipeptides+linked+to+C9ORF72-ALS/FTD+form+toxic+nuclear+aggregates+that+initiate+in+vitro+and+in+vivo+neuronal+death.">Antisense proline-arginine RAN dipeptides linked to C9ORF72-ALS/FTD form toxic nuclear aggregates that initiate in vitro and in vivo neuronal death.</a> Neuron. 84, 1213-1225 (2014).</li></ol>

Gli autori non hanno niente da divulgare.

Questo protocollo dimostra un nuovo test molto sensibile e quantitativo per valutare i minimi cambiamenti nel trasporto nucleocitoplasmatico. Utilizzando questo sistema, è possibile osservare e misurare il trasporto nucleocitoplasmatico e la sua disfunzione in tempo reale, non solo i grandi difetti che comportano cambiamenti drammatici nella distribuzione delle proteine. Questo test non solo ha un vantaggio di sensibilità, ma richiede anche una piccola preparazione, è poco costoso ed è un saggio molto facile e poco ...

Il complesso dei pori nucleari (NPC) controlla l&#39;importazione e l&#39;esportazione di grandi molecole in e fuori dal nucleo delle cellule. Contrariamente alle piccole molecole, che possono entrare nel nucleo senza regola 1 , il trasporto di molecole più grandi è fortemente controllato dal NPC. Queste grandi molecole, come le proteine ​​e l&#39;RNA, associano fattori di trasporto, comprese le importazioni e le esportazioni, da importare ed esportare dal nucleo 2 . Per essere importato, le proteine ​​devono contenere un piccolo motivo peptidico, generalmente chiamato un segnale di localizzazione nucleare (NLS), che è vincolato dalle importanti 2 . Queste sequenze di aminoacidi agiscono come un tag e sono diverse nella composizione 3 , 4 . Le proteine ​​possono essere esportate dal nucleo al citoplasma a causa della loro associazione con l&#39;exportinS, che legano una sequenza di segnali, generalmente chiamata segnale di esportazione nucleare (NES) 2 . Entrambe le importazioni e le esportazioni sono in grado di trasportare il loro carico a causa della regolazione della piccola proteina nucleare RTP correlata GTPase (Ran) 2 . Ran ha dimostrato di esistere in diversi stati conformazionali a seconda che sia vincolato al GTP o al PIL. Quando legato a GTP, Ran può legarsi a importini o esportazioni. Dopo l&#39;adesione a RanGTP, le importazioni rilasciano il loro carico, mentre le esportazioni devono obbligare RanGTP a formare un complesso con il loro carico di esportazione. Lo stato di legame nucleotidico dominante di Ran dipende dalla sua collocazione nel nucleo (RanGTP) o nel citoplasma (RanGDP). Recentemente, un certo numero di studi hanno mostrato una connessione tra disturbi del percorso nucleocitoplasmatico e sia la sclerosi laterale amiotrofica (ALS) e la demenza frontotemporale (FTD) 5 , 6 </sup&gt; , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 . L&#39;ALS è una malattia neurodegenerativa progressiva e fatale che colpisce sia i neuroni motori superiori che inferiori (MN) 13 e provoca paralisi e, infine, nella morte, in media da 2-5 anni. La maggior parte dei casi di ALS sono classificati come sporadici (SALS), senza alcun legame genetico apparente, ma il 10% è ereditato in maniera dominante (ALS familiare; FALS). Recentemente, le espansioni di ripetizione dell&#39;esanucleotide (HRE) nel cromosoma 9 aperto frame di lettura 72 (C9orf72) sono stati identificati 14,15 come causa genetica di ALS e FTD. Questi mutanti rappresentano il 30-40% dei casi FALS 16 e diversi studi hanno sostenutoChe provocano tossicità colpendo il trasporto nucleocitoplasmico 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 . Questi studi hanno mostrato in gran parte i risultati finali e le manifestazioni degli HRE sul trasporto nucleocitoplasmatico, ma non dimostrano la rottura nucleocitoplasmatica in tempo reale. Di conseguenza, solo la mancanza di trasporto nucleocitoplasmatico grave è stata valutata 11 , 17 , 18 . Questo protocollo descrive un nuovo e vePer valutare e quantificare la disfunzione del trasporto nucleocitoplasmatico in tempo reale. Il tasso di importazione di una proteina NLS-NES-GFP (shuttle-GFP) può essere quantificato in tempo reale utilizzando microscopia fluorescente. Ciò avviene usando un inibitore dell&#39;esportin, come descritto in precedenza 18 , consentendo così al shuttle-GFP di entrare solo nel nucleo. Utilizzando la microscopia fluorescente e un software in grado di quantificare i cambiamenti fluorescenti in tempo reale, è possibile quantificare i cambiamenti graduali nell&#39;intensità di fluorescenza del shuttle-GFP, che si trova nel nucleo. Di conseguenza, può essere effettuata una curva di saturazione simile a Michaelis-Menten dell&#39;asse fluorescenza-tempo, che rappresenta la quantità di GFP nucleare in un dato momento. Utilizzando la velocità lineare iniziale delle curve, è possibile generare una pendenza che rappresenta la velocità di ingresso nel nucleo prima della saturazione della fluorescenza. Per convalidare il saggio, tradurreRipetizioni di dipeptide di C9orf72, poli (GR) e poli (PR), precedentemente riportate per interrompere il trasporto nucleocitoplasmatico, sono state utilizzate 5 , 7 , 8 , 10 , 12 . Utilizzando questo saggio, è stata osservata una diminuzione del 50% del tasso di importazione nucleare rispetto al controllo. Utilizzando questo sistema, possono essere esaminati piccoli cambiamenti nel trasporto nucleocitoplasmatico. Inoltre, può essere determinata la capacità di diversi fattori per salvare un difetto di trasporto nucleocitoplasmatico.

<table><tbody><tr><td>Mouse Motor Neuron-Like hybrid Cell Line (NSC-34)</td><td>tebu-bio</td><td>CLU140-A</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 4.5 g/L L-glucose</td><td>Biological Industries</td><td>01-055-1A</td><td></td></tr><tr><td>FBS European Grade</td><td>Biological Industries</td><td>04-007-1A</td><td></td></tr><tr><td>SL 16R Centrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004030</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Forma Series ii Water Jacketed CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; Incubator</td><td>Thermo Scientific</td><td>3111</td><td></td></tr><tr><td>Cover glass 12 mm dia., 0.13-0.17 mm thick</td><td>Bar Naor LTD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TurboFect Transfection Reagent</td><td>Thermo Scientific</td><td>&lt;a href=&quot;https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/R0531&quot;&gt;R0531&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Axiovert 100 inverted microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaging Workbench 2</td><td>Axon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leptomycin B</td><td>Sigma</td><td>L2913</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Biological Industries</td><td>02-023-1A</td><td></td></tr><tr><td>Homogenizer motor/control/chuck/90 degree clamp</td><td>Glas-Col</td><td>099C K5424CE</td><td></td></tr><tr><td>MicroCL 17R Centrifuge, Refrigerated</td><td>Thermo Scientific</td><td>75002455</td><td></td></tr></tbody></table>

assay to measure nucleocytoplasmic transport in real time within motor neuron-like nsc-34 cells

Il trasporto nucleocitoplasmatico si riferisce all&#39;importazione e all&#39;esportazione di grandi molecole dal nucleo cellulare. Recentemente, un certo numero di studi hanno mostrato una connessione tra la sclerosi laterale amyotrofica (ALS) e le alterazioni del percorso nucleocitoplasmatico. L&#39;ALS è una malattia neurodegenerativa che colpisce i neuroni motori e che porta alla paralisi e, infine, alla morte, in media di 2-5 anni. La maggior parte dei casi di ALS sono sporadici, privi di qualsiasi legame genetico apparente, ma il 10% viene ereditato in maniera dominante. Recentemente, le espansioni di ripetizione di esanucleotidi (HRE) nel cromosoma 9 aperto frame di lettura 72 (C9orf72) sono stati identificati come una causa genetica di ALS e demenza frontotemporale (FTD). Importante, diversi gruppi hanno recentemente proposto che queste mutanti influenzino il trasporto nucleocitoplasmatico. Questi studi hanno mostrato in gran parte l&#39;esito finale e le manifestazioni causate dagli HRE sul trasporto nucleocitoplasmatico, ma non dimostrano disfunzioni del trasporto nucleare intempo reale. Di conseguenza, solo la carenza nucleocitoplasmatica di trasporto può essere determinata, soprattutto a causa di un&#39;elevata espressione o di inserimento proteico esogeno. Questo protocollo descrive un nuovo e molto sensibile dosaggio per valutare e quantificare la disfunzione del trasporto nucleocitoplasmatico in tempo reale. Il tasso di importazione di una proteina NLS-NES-GFP (shuttle-GFP) può essere quantificato in tempo reale utilizzando microscopia fluorescente. Questo viene eseguito usando un inibitore dell&#39;esportin, consentendo così alla navetta GFP di entrare solo nel nucleo. Per convalidare il dosaggio, sono state utilizzate le ripetizioni dei dipeptidi tradotte da C9orf72 HRE, poli (GR) e poli (PR), che sono state precedentemente mostrate per interrompere il trasporto nucleocitoplasmico. Utilizzando il saggio descritto, è stata osservata una diminuzione del 50% del tasso di importazione nucleare rispetto al controllo. Utilizzando questo sistema, possono essere esaminati piccoli cambiamenti nel trasporto nucleocitoplasmatico e la capacità di diversi fattori di salvarlo (anche parzialmente) di un nucleo nucleotiplasmaticoPuò essere determinato il difetto di risposta.

Utilizzando la procedura qui presentata, le cellule NSC-34, come motorie neuroniche, sono state trasfettate con una proteina NLS-NES-GFP (shuttle-GFP). Questa proteina, dotata di sequenze di segnali NLS e NES ( Figura 1 ), può spostarsi tra il nucleo e il citoplasma. Generico GFP può entrare o uscire dal nucleo in assenza di un solo segnale di localizzazione solo per diffusione e viene quindi distribuito uniformemente tra il nucleo e il citoplasma ( Figura 2A</...

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Assay to Measure Nucleocytoplasmic Transport in Real Time within Motor Neuron-like NSC-34 Cells

Questo protocollo descrive un metodo per misurare sensibilmente il tasso di trasporto nucleocitoplasmatico nelle cellule NSC-34 come motori neuronali quantificando il cambiamento in tempo reale nell&#39;importazione nucleare di una proteina NLS-NES-GFP.

Analisi per misurare il trasporto nucleocitoplasmatico in tempo reale all&#39;interno di motori neuronici come le cellule NSC-34

Nucleocytoplasmic transport refers to the import and export of large molecules from the cell nucleus. Recently, a number of studies have shown a ...

assay-to-measure-nucleocytoplasmic-transport-real-time-within-motor

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.6K Views.  Ben-Gurion University of the Negev.  Questo protocollo descrive un metodo per misurare sensibilmente il tasso di trasporto nucleocitoplasmatico nelle cellule NSC-34 come motori neuronali quantificando il cambiamento in tempo reale nell'importazione nucleare di una proteina NLS-NES-GFP. 

Video: Assay to Measure Nucleocytoplasmic Transport in Real Time within Motor Neuron-like NSC-34 Cells

Nucleofection of Rodent Neuroblasts to Study Neuroblast Migration In vitro

The subventricular zone (SVZ) located in the lateral wall of the lateral ventricles plays a fundamental role in adult neurogenesis. In this restricted area of the brain, neural stem cells proliferate and constantly generate neuroblasts that migrate tangentially in chains along the rostral migratory stream (RMS) to reach the olfactory bulb (OB). Once in the OB, neuroblasts switch to radial migration and then differentiate into mature neurons able to incorporate into the preexisting neuronal network. Proper neuroblast migration is a fundamental step in neurogenesis, ensuring the correct functional maturation of newborn neurons. Given the ability of SVZ-derived neuroblasts to target injured areas in the brain, investigating the intracellular mechanisms underlying their motility will not only enhance the understanding of neurogenesis but may also promote the development of neuroregenerative strategies.
This manuscript describes a detailed protocol for the transfection of primary rodent RMS postnatal neuroblasts and the analysis of their motility using a 3D in vitro migration assay recapitulating their mode of migration observed in vivo. Both rat and mouse neuroblasts can be quickly and efficiently transfected via nucleofection with either plasmid DNA, small hairpin (sh)RNA or short interfering (si)RNA oligos targeting genes of interest. To analyze migration, nucleofected cells are reaggregated in &#39;hanging drops&#39; and subsequently embedded in a three-dimensional matrix. Nucleofection per se does not significantly impair the migration of neuroblasts. Pharmacological treatment of nucleofected and reaggregated neuroblasts can also be performed to study the role of signaling pathways involved in neuroblast migration.

Nucleofection of Rodent Neuroblasts to Study Neuroblast Migration In vitro

Neuroblast migration is a crucial step in postnatal neurogenesis. The protocol described here can be used to investigate the role of candidate regulators of neuroblast migration by employing DNA/small hairpin RNA (shRNA) nucleofection and a 3D migration assay with neuroblasts isolated from the rodent postnatal rostral migratory stream.

Nucleofection di roditori neuroblasti per studiare neuroblasti migrazione<em&gt; In vitro</em

The subventricular zone (SVZ) located in the lateral wall of the lateral ventricles plays a fundamental role in adult neurogenesis. In this restricted ...

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Neuroscienze

A High Content Imaging Assay for Identification of Botulinum Neurotoxin Inhibitors

Synaptosomal-associated protein-25 (SNAP-25) is a component of the soluble NSF attachment protein receptor (SNARE) complex that is essential for synaptic neurotransmitter release. Botulinum neurotoxin serotype A (BoNT/A) is a zinc metalloprotease that blocks exocytosis of neurotransmitter by cleaving the SNAP-25 component of the SNARE complex. Currently there are no licensed medicines to treat BoNT/A poisoning after internalization of the toxin by motor neurons. The development of effective therapeutic measures to counter BoNT/A intoxication has been limited, due in part to the lack of robust high-throughput assays for screening small molecule libraries. Here we describe a high content imaging (HCI) assay with utility for identification of BoNT/A inhibitors. Initial optimization efforts focused on improving the reproducibility of inter-plate results across multiple, independent experiments. Automation of immunostaining, image acquisition, and image analysis were found to increase assay consistency and minimize variability while enabling the multiparameter evaluation of experimental compounds in a murine motor neuron system.

Botulinum neurotoxin is one of the most potent toxins among Category-A biothreat agents, yet a post-exposure therapeutic is not available. The high content imaging approach is a powerful methodology for identifying novel inhibitors as it enables multiparameter screening using biologically relevant motor neurons, the primary target of this toxin.

Un alto dosaggio Imaging contenuti per l&#39;identificazione di neurotossina botulinica inibitori

Synaptosomal-associated protein-25 (SNAP-25) is a component of the soluble NSF attachment protein receptor (SNARE) complex that is essential for synaptic ...

Single-Molecule Imaging of Nuclear Transport

The utility of single molecule fluorescence microscopy approaches has been proven to be of a great avail in understanding biological reactions over the last decade. The investigation of molecular interactions with high temporal and spatial resolutions deep within cells has remained challenging due to the inherently weak signals arising from individual molecules. Recent works by Yang et al. demonstrated that narrow-field epifluorescence microscopy allows visualization of nucleocytoplasmic transport at the single molecule level. By the single molecule approach, important kinetics, such as nuclear transport time and efficiency, for signal-dependent and independent cargo molecules have been obtained. Here we described a protocol for the methodological approach with an improved spatiotemporal resolution of 0.4 ms and 12 nm. The improved resolution enabled us to capture transient active transport and passive diffusion events through the nuclear pore complexes (NPC) in semi-intact cells. We expect this method to be used in elucidating other binding and trafficking events within cells.

Single molecule microscopy approch provided novel insights into nuclear transport.

Singola molecola Imaging dei trasporti nucleari

The utility of single molecule fluorescence microscopy approaches has been proven to be of a great avail in understanding biological reactions over the ...

Biologia

Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, survival, and glial communications. To date, numerous studies have reported that defects in these systems cause various neuronal diseases. Thus, understanding the mechanisms underlying vesicle dynamics may provide influential clues that could aid in the treatment of several neuronal disorders. Here, we describe a method for quantifying vesicle motilities, such as motility distance and rate of movement, using a software plug-in for the ImageJ platform. To obtain images for quantification, we labeled neuronal endosome-lysosome structures with EGFP-tagged vesicle marker proteins and observed the movement of vesicles using a time-lapse microscopy. This method is highly useful and simplify measuring vesicle motility in neurites, such as axons and dendrites, as well as in the soma of both neurons and glial cells. Furthermore, this method can be applied to other cell lines, such as fibroblasts and endothelial cells. This approach could provide a valuable advancement of our understanding of membrane trafficking.

The investigation of membrane trafficking is crucial for understanding neuronal functions. Here, we introduce a method for quantifying vesicle motility in neurons. This is a convenient method that can be adapted to the quantification of membrane trafficking in the nervous system.

Quantificazione delle endosomi e dei motivi di lisosomi nei neuroni coltivati ​​utilizzando sonde fluorescenti

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, ...

A High-content Assay for Monitoring AMPA Receptor Trafficking

Postsynaptic trafficking of receptors to and from the cell surface is an important mechanism by which neurons modulate their responsiveness to different stimuli. The &#945;-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid (AMPA) receptors, which are responsible for fast excitatory synaptic transmission in neurons, are trafficked to and from the postsynaptic surface to dynamically alter neuronal excitability. AMPA receptor trafficking is essential for synaptic plasticity and can be disrupted in neurological disease. However, prevalent approaches for quantifying receptor trafficking ignore entire receptor pools, are overly time- and labor-intensive, or potentially disrupt normal trafficking mechanisms and therefore complicate the interpretation of resulting data. We present a high-content assay for the quantification of both surface and internal AMPA receptor populations in cultured primary hippocampal neurons using dual fluorescent immunolabeling and a near-infrared fluorescent 96-well microplate scanner. This approach facilitates the rapid screening of bulk internalized and surface receptor densities while minimizing sample material. However, our method has limitations in obtaining single-cell resolution or conducting live cell imaging. Finally, this protocol may be amenable to other receptors and different cell types, provided proper adjustments and optimization.

Neuronal excitability can be modulated through a dynamic process of endo- and exocytosis of excitatory ionotropic glutamate receptors. Described here is an accessible, high-content assay for quantifying surface and internal receptor population pools.

Un'analisi ad alto contenuto per monitoraggio AMPA traffico recettoriale

Postsynaptic trafficking of receptors to and from the cell surface is an important mechanism by which neurons modulate their responsiveness to different ...

Imaging and Analysis of Neurofilament Transport in Excised Mouse Tibial Nerve

Neurofilament protein polymers move along axons in the slow component of axonal transport at average speeds of ~0.35-3.5 mm/day. Until recently the study of this movement in situ was only possible using radioisotopic pulse-labeling, which permits analysis of axonal transport in whole nerves with a temporal resolution of days and a spatial resolution of millimeters. To study neurofilament transport in situ with higher temporal and spatial resolution, we developed a hThy1-paGFP-NFM transgenic mouse that expresses neurofilament protein M tagged with photoactivatable GFP in neurons. Here we describe fluorescence photoactivation pulse-escape and pulse-spread methods to analyze neurofilament transport in single myelinated axons of tibial nerves from these mice ex vivo. Isolated nerve segments are maintained on the microscope stage by perfusion with oxygenated saline and imaged by spinning disk confocal fluorescence microscopy. Violet light is used to activate the fluorescence in a short axonal window. The fluorescence in the activated and flanking regions is analyzed over time, permitting the study of neurofilament transport with temporal and spatial resolution on the order of minutes&#160;and microns, respectively. Mathematical modeling can be used to extract kinetic parameters of neurofilament transport including the velocity, directional bias and pausing behavior from the resulting data. The pulse-escape and pulse-spread methods can also be adapted to visualize neurofilament transport in other nerves. With the development of additional transgenic mice, these methods could also be used to image and analyze the axonal transport of other cytoskeletal and cytosolic proteins in axons.

We describe fluorescence photoactivation methods to analyze the axonal transport of neurofilaments in single myelinated axons of peripheral nerves from transgenic mice that express a photoactivatable neurofilament protein.

Imaging e analisi del trasporto neurofilamento nel nervo tibiale del topo escresato

Neurofilament protein polymers move along axons in the slow component of axonal transport at average speeds of ~0.35-3.5 mm/day. Until recently the study ...

Nuclear Transport Assays in Permeabilized Mouse Cortical Neurons

Disruption of nucleocytoplasmic transport is increasingly implicated in the pathogenesis of neurodegenerative diseases. Moreover, there is a growing recognition of cell-specific differences in nuclear pore complex structure, prompting a need to adapt nuclear transport methods for use in neurons. Permeabilized cell assays, in which the plasma membrane is selectively perforated by digitonin, are widely used to study passive and active nuclear transport in immortalized cell lines but have not been applied to neuronal cultures. In our initial attempts, we observed the rapid loss of nuclear membrane integrity in primary mouse cortical neurons exposed to even low concentrations of digitonin. We hypothesized that neuronal nuclear membranes may be uniquely vulnerable to the loss of cytoplasmic support. After testing multiple approaches to improve nuclear stability, we observed optimal nuclear integrity following hypotonic lysis in the presence of a concentrated bovine serum albumin cushion. Neuronal nuclei prepared by this approach reliably import recombinant fluorescent cargo in an energy-dependent manner, facilitating analysis of nuclear import by high content microscopy with automated analysis. We anticipate that this method will be broadly applicable to studies of passive and active nuclear transport in primary neurons.

We have developed a reliable method of selective plasma membrane permeabilization of primary mouse cortical neurons for high content automated analysis of neuronal nucleocytoplasmic transport.

Disruption of nucleocytoplasmic transport is increasingly implicated in the pathogenesis of neurodegenerative diseases. Moreover, there is a growing ...

Real-Time Fluorescent Measurement of Synaptic Functions in Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis

Before neuronal degeneration, the cause of motor and cognitive deficits in patients with amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and/or frontotemporal lobe dementia (FTLD) is dysfunction of communication between neurons and motor neurons and muscle. The underlying process of synaptic transmission involves membrane depolarization-dependent synaptic vesicle fusion and the release of neurotransmitters into the synapse. This process occurs through localized calcium influx into the presynaptic terminals where synaptic vesicles reside. Here, the protocol describes fluorescence-based live-imaging methodologies that reliably report depolarization-mediated synaptic vesicle exocytosis and presynaptic terminal calcium influx dynamics in cultured neurons.
Using a styryl dye that is incorporated into synaptic vesicle membranes, the synaptic vesicle release is elucidated. On the other hand, to study calcium entry, Gcamp6m is used, a genetically encoded fluorescent reporter. We employ high potassium chloride-mediated depolarization to mimic neuronal activity. To quantify synaptic vesicle exocytosis unambiguously, we measure the loss of normalized styryl dye fluorescence as a function of time. Under similar stimulation conditions, in the case of calcium influx, Gcamp6m fluorescence increases. Normalization and quantification of this fluorescence change are performed in a similar manner to the styryl dye protocol. These methods can be multiplexed with transfection-based overexpression of fluorescently tagged mutant proteins. These protocols have been extensively used to study synaptic dysfunction in models of FUS-ALS and C9ORF72-ALS, utilizing primary rodent cortical and motor neurons. These protocols easily allow for rapid screening of compounds that may improve neuronal communication. As such, these methods are valuable not only for the study of ALS but for all areas of neurodegenerative and developmental neuroscience research.

Two related methods are described to visualize subcellular events required for synaptic transmission. These protocols enable the real-time monitoring of the dynamics of presynaptic calcium influx and synaptic vesicle membrane fusion using live-cell imaging of in vitro cultured neurons.

Misurazione fluorescente in tempo reale delle funzioni sinaptiche in modelli di sclerosi laterale amiotrofica

Before neuronal degeneration, the cause of motor and cognitive deficits in patients with amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and/or frontotemporal lobe ...

Expanding the Toolkit for In Vivo Imaging of Axonal Transport

Axonal transport maintains neuronal homeostasis by enabling the bidirectional trafficking of diverse organelles and cargoes. Disruptions in axonal transport have devastating consequences for individual neurons and their networks, and contribute to a plethora of neurological disorders. As many of these conditions involve both cell autonomous and non-autonomous mechanisms, and often display a spectrum of pathology across neuronal subtypes, methods to accurately identify and analyze neuronal subsets are imperative.
This paper details protocols to assess in vivo axonal transport of signaling endosomes and mitochondria in sciatic nerves of anesthetized mice. Stepwise instructions are provided to 1) distinguish motor from sensory neurons in vivo, in situ, and ex vivo by using mice that selectively express fluorescent proteins within cholinergic motor neurons; and 2) separately or concurrently assess in vivo axonal transport of signaling endosomes and mitochondria. These complementary intravital approaches facilitate the simultaneous imaging of different cargoes in distinct peripheral nerve axons to quantitatively monitor axonal transport in health and disease.

Expanding the Toolkit for In Vivo Imaging of Axonal Transport

Using transgenic fluorescent mice, detailed protocols are described to assess in vivo axonal transport of signaling endosomes and mitochondria within motor and sensory axons of the intact sciatic nerve in live animals.

Espansione del toolkit per l'imaging in vivo del trasporto assonale

Axonal transport maintains neuronal homeostasis by enabling the bidirectional trafficking of diverse organelles and cargoes. Disruptions in axonal ...

Measuring Axonal Cargo Transport in Mouse Primary Cortical Cultured Neurons

Neuronal cells are highly polarized cells that stereotypically harbor several dendrites and an axon. The length of an axon necessitates efficient bidirectional transport by motor proteins. Various reports have suggested that defects in axonal transport are associated with neurodegenerative diseases. Also, the mechanism of the coordination of multiple motor proteins has been an attractive topic. Since the axon has uni-directional microtubules, it is easier to determine which motor proteins are involved in the movement. Therefore, understanding the mechanisms underlying the transport of axonal cargo is crucial for uncovering the molecular mechanism of neurodegenerative diseases and the regulation of motor proteins. Here, we introduce the entire process of axonal transport analysis, including the culturing of mouse primary cortical neurons, transfection of plasmids encoding cargo proteins, and directional and velocity analyses without the effect of pauses. Furthermore, the open-access software "KYMOMAKER" is introduced, which enables the generation of a kymograph to highlight transport traces according to their direction and allow easier visualization of axonal transport.

The present protocol describes the whole procedure of analysis for axonal transport. In particular, the calculation of transport velocity, not including the pausing, and the visualization method using open-access software "KYMOMAKER" are shown here.

Analisi per misurare il trasporto nucleocitoplasmatico in tempo reale all'interno di motori neuronici come le cellule NSC-34

Riepilogo

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Nucleofection di roditori neuroblasti per studiare neuroblasti migrazione

Un alto dosaggio Imaging contenuti per l'identificazione di neurotossina botulinica inibitori

Singola molecola Imaging dei trasporti nucleari

Quantificazione delle endosomi e dei motivi di lisosomi nei neuroni coltivati utilizzando sonde fluorescenti

Un'analisi ad alto contenuto per monitoraggio AMPA traffico recettoriale

Imaging e analisi del trasporto neurofilamento nel nervo tibiale del topo escresato

Nuclear Transport Assays in Permeabilized Mouse Cortical Neurons

Misurazione fluorescente in tempo reale delle funzioni sinaptiche in modelli di sclerosi laterale amiotrofica

Espansione del toolkit per l'imaging in vivo del trasporto assonale

Measuring Axonal Cargo Transport in Mouse Primary Cortical Cultured Neurons

Analisi per misurare il trasporto nucleocitoplasmatico in tempo reale all'interno di motori neuronici come le cellule NSC-34

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Un alto dosaggio Imaging contenuti per l'identificazione di neurotossina botulinica inibitori

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Quantificazione delle endosomi e dei motivi di lisosomi nei neuroni coltivati ​​utilizzando sonde fluorescenti

Un'analisi ad alto contenuto per monitoraggio AMPA traffico recettoriale

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Nuclear Transport Assays in Permeabilized Mouse Cortical Neurons

Misurazione fluorescente in tempo reale delle funzioni sinaptiche in modelli di sclerosi laterale amiotrofica

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Measuring Axonal Cargo Transport in Mouse Primary Cortical Cultured Neurons

Quantificazione delle endosomi e dei motivi di lisosomi nei neuroni coltivati utilizzando sonde fluorescenti