Questo protocollo consente l'imaging diretto della popolazione di neurofilamento negli assoni mielinati da topi giovani o adulti utilizzando la microscopia a fluorescenza, rendendo possibile misurare la direzionalità e la velocità del trasporto del neurofilamento in segmenti nervosi isolati. Questo metodo dipende dalla disponibilità di topi che esprimono una fusione fluorescente fotoattivabile della proteina di interesse, ma può essere adattato per l'uso in qualsiasi nervo prontamente sezionato. Per iniziare, versare la salina ossigenata in una siringa da 60 millilitri e assicurarsi che rimanga aria minima nella siringa.
Collegare la siringa al tubo, quindi posizionare il tubo di deflusso in un pallone di scarto. Posizionare la guarnizione esterna nell'alloggiamento della camera di perfusione, assicurando che i pali di ingresso e uscita del flusso siano allineati con i fori nella guarnizione, quindi posare la guarnizione interna su una coverlip circolare numero 1.5 e levigare con cura eventuali rughe nella guarnizione per garantire una tenuta stretta. Posizionare la busta e la guarnizione su un tovagliolo di carta o una salvietta per compiti con la guarnizione rivolta verso l'alto.
Usa un paio di grandi forbici a dissezione per fare un'incisione dorsale nella pelle vicino al centro della colonna vertebrale e continuare a tagliare intorno all'aspetto ventrale dell'animale. Allontanare lentamente la pelle dal muscolo e tagliare la fascia. Successivamente, utilizzare le forbici a microdisezione per fare un'incisione nei muscoli della coscia a metà strada tra la coda e il ginocchio per esporre il nervo sciatico.
Assicurarsi che il nervo, visibile attraverso il muscolo, non sia tagliato. Estendere l'incisione dorsalmente e ventralmente per rimuovere il muscolo, quindi rimuovere i muscoli del polpaccio, mantenendo i tagli poco profondi e corti per evitare di danneggiare i nervi. Continuare a rimuovere i muscoli fino a quando il nervo tibiale è completamente esposto dal punto in cui si ramica dal nervo sciatico al tallone.
Afferrare il nervo tibiale all'estremità prossimale della colonna vertebrale con un paio di forcep e tagliarlo con un paio di forbici di microdisezione, assicurandosi di non applicare troppa tensione al nervo. Sollevarlo con cura lontano dal muscolo e tagliare eventuali attacchi, facendo attenzione a non mettere tensione sul nervo. Tagliare l'estremità distale della colonna vertebrale del nervo tibiale e trasferirlo in una piccola piastra di Petri di soluzione salina ossigenata a temperatura ambiente.
Partendo dall'estremità prossimale del nervo, afferrare delicatamente le estremità dell'assone esposto con un paio di punte molto fini. Con un secondo paio di forcep, afferrare la torcia nervosa prossimale e tirare lentamente verso l'estremità distale del nervo assicurandosi che non si applica alcuna tensione indebita durante questo processo. Afferrare l'estremità prossimale del nervo e stenderla lentamente su un coverslip, quindi raddrizzare sotto delicata tensione.
Posizionare il microaquedotto scivolare sul nervo con lo scivolo scanalato verso il basso e posizionare la direzione del flusso parallela al nervo. Capovolgere l'assieme di coverslip e microaquedotto e posizionarlo nell'alloggiamento della camera di perfusione con lo scivolo opposto alla guarnizione esterna. Per fissare la camera di profusione, posizionarla nell'alloggiamento metallico e ruotare l'anello di bloccaggio.
Deprimere lentamente lo stantuffo della siringa salina e riempire la camera di perfusione. Mantenere sempre i tubi di ingresso e di uscita, il pallone di uscita e la siringa sopra la camera stessa durante la configurazione e l'imaging. Trasferire l'assieme di profusione in uno stadio di microscopio invertito e montare la siringa salina nella pompa della siringa, quindi avviare il motore e regolare la velocità per una portata di 0,25 millilitri al minuto.
Collegare il riscaldatore della soluzione in linea e impostarlo a 37 gradi Celsius. Collegare il riscaldatore obiettivo e impostarlo a 37 gradi Celsius. Applicare l'olio sull'obiettivo e inserire la camera di profusione nel supporto del palco.
Applicare l'olio sul riscaldatore della camera e attaccarlo alla camera di perfusione, quindi collegarlo e impostarlo a 37 gradi Celsius. Bloccare la camera di profusione nell'adattatore del palco e mettere l'olio obiettivo a contatto con la coverslip sul lato inferiore della camera. Utilizzare l'illuminazione Brightfield per concentrarsi sullo strato di assoni sulla superficie inferiore del nervo più vicino alla superficie del coverslip.
Gli assoni mielinati possono essere identificati dalla presenza di una tona mielina visibile sotto l'illuminazione della luce trasmessa da Brightfield senza miglioramento del contrasto. Acquisire un'immagine di riferimento Brightfield, registrando la direzionalità del nervo, quindi acquisire un'immagine confocale utilizzando un laser da 488 nanometri e un filtro di emissione appropriato per la GFP fotoattivabile. Impostare la potenza del laser su circa cinque volte la normale potenza di imaging e acquisire un'immagine con un tempo di esposizione da tre a quattro minuti, quindi acquisire un'altra immagine confocale per registrare l'autofluorescenza pre-attivazione dopo la fase di sbiancamento.
Disegna una linea parallela agli assoni con una lunghezza uguale alla dimensione della finestra di attivazione desiderata dell'immagine Brightfield. Usando questa linea come guida, disegna una regione rettangolare di interesse attraverso il campo visivo perpendicolare agli assoni. Attivare la fluorescenza GFP in questa regione mediante eccitazione di pattern con la luce di 405 nanometri, assicurandosi che un'immagine sia acquisita appena prima e immediatamente dopo l'attivazione.
Al termine dell'attivazione, avviare un timer di un minuto. Quando si spegne, inizia l'acquisizione di una serie timelapse. Aggiungere 250 milligrammi di polvere di fluoresceina a 0,5 millilitri di acqua distillata doppia e mescolarla fino a quando non ci sono particelle visibili, quindi ruotare la soluzione per 30 secondi in una centrifuga da tavolo per sedimentare qualsiasi materiale non dissolto.
Aggiungere otto microlitri di soluzione di fluoresceina a uno scivolo e applicare una coverlip numero 1.5. Asciugare il liquido in eccesso, sigillare il coperchio con smalto per unghie e lasciare asciugare lo scivolo. Posizionare il lato di scorrimento sul lato del microscopio invertito e regolare la messa a fuoco sul piano sottile di fluorescenza sulla superficie del coverslip.
Spostare la diapositiva per trovare un campo visivo che non contenga bolle d'aria o particelle di fluoresceina di grandi dimensioni e acquisire una pila Z che si estende su sei micrometri a intervalli di 0,2 micrometri in modo che l'immagine centrale sia il piano di messa a fuoco originale. Chiudere tutte le persiane del percorso luminoso, incluso l'otturatore della fotocamera, e impostare la potenza del laser e il tempo di esposizione a zero secondi. Acquisisci una pila di 100 immagini con queste impostazioni, che verranno mediate per generare l'immagine del campo scuro.
Qui vengono mostrate immagini rappresentative degli esperimenti di fuga e diffusione dell'impulso. Per il metodo di fuga dell'impulso, la cinetica di decadimento della fluorescenza nella regione attivata può fornire informazioni sul comportamento di sospensione a lungo e breve termine. La regione attivata può essere breve per questi esperimenti.
Una regione attivata più lunga viene utilizzata per il metodo di diffusione dell'impulso al fine di fornire un pool più ampio di neurofilamenti fluorescenti. Ciò allunga il tempo durante il quale l'aumento della fluorescenza nelle regioni di fianco rimane lineare. Qui vengono utilizzate finestre di fianco di 15 micrometri.
La fluorescenza totale dalla finestra di misura è stata quantificata. Il decadimento è bifasico per il metodo di fuga dell'impulso con un decadimento esponenziale iniziale che rappresenta la partenza di neurofilamenti in pista e un secondo decadimento esponenziale più lento a 10-20 minuti che rappresenta la partenza di filamenti fuori pista. Per la strategia di diffusione dell'impulso, i calcoli della velocità e della direzionalità del movimento dipendono solo dalle pendenze nelle finestre di fianco.
Per le lunghezze delle finestre qui utilizzate, la fase lineare si estende per circa cinque minuti. Qui viene mostrata una timelapse da un nervo glicoliticamente inibito, che dimostra un'apparente riduzione del trasporto fuori dalla regione attivata. Infatti, i pendii distale e prossimale sono significativamente più bassi nei nervi trattati con inibitore.
C'è anche una significativa diminuzione della velocità della popolazione tra queste due condizioni. Quando tenti questo protocollo, ricorda che è fondamentale essere affrettati nel condurre le porzioni di dissezione e assemblaggio della camera mentre la salute dei nervi diminuisce dopo il sacrificio dell'animale. La coltura cellulare neuronale può consentire la misurazione e l'analisi del movimento dei singoli neurofilamenti, che integrerebbe i dati della scala della popolazione raccolti utilizzando questo protocollo.
