Qui dimostriamo un saggio di traffico di recettori ad alto contenuto compatibile con la preparazione primaria della coltura neuronale. Questo metodo etichetta separatamente la superficie come pool di recettori inter cantina di neuroni fissi. Consentire la presentazione dei dati come rapporto tra la superficie normalizzata o la densità internata del recettore alla densità complessiva di tale recettore.
Il saggio di traffico di alti contenuti e recettori fornisce un mezzo efficace per misurare i cambiamenti di massa nei profili di traffico dei recettori all'interno di una rete neurale in risposta a vari fattori. Consumare molto meno tempo e materiali rispetto ai metodi alternativi. Le interruzioni e il traffico di precettori sono stati collegati a molteplici disturbi neurologici e sono considerati obiettivi interessanti per la terapia farmacologica.
Ad esempio, studi hanno mostrato che uno dei primi segni del morbo di Alzheimer è la perdita sinaptica e le piscine sinaptiche e precetcettiche diminuite. Questa tecnica richiede molti passaggi diversi di varia difficoltà. Soprattutto perché maneggiare la piastra del pozzo 96 e manipolare i pozzi può rivelarsi difficile per qualcuno senza esperienza.
E poiché i risultati dell'esperimento sono altamente sensibili alla manipolazione impropria, è utile visualizzare i vari passaggi eseguiti. Istruttore Per iniziare, nutrire i neuroni nella piastra del pozzo 96 rimuovendo 100 microlitri dei supporti preesistenti da ogni pozzo. E sostituirlo con 100 microlitri di supporti pre-riscaldati a 37 gradi Celsius.
Ogni tre o quattro giorni. Un giorno in vitro 14, utilizzare un multi-pipet per rimuovere 100 microlitri di supporti da ogni pozzo e mettere in comune il supporto. Aggiungere due microlitri di soluzione TTX Stock a un millilitro del supporto condizionato in pool per creare una soluzione micromolare a quattro micromolari di TTX.
Trattare i neuroni in ogni pozzo con 100 microlitri di quattro soluzione TTX micromolare. Se non è disponibile un numero sufficiente di supporti di condizione in pool, aggiungere alcuni dei supporti memorizzati in precedenza. Incubare in un incubatore di CO2 al 5% a 37 gradi Celsius per quattro ore.
Successivamente rimuovere il TTX esistente contenente il supporto e aggiungere 200 microlitri di mezzi neuronali pre-riscaldati e incubare la micro piastra a temperatura ambiente per quindici minuti. Per prima cosa rimuovere il supporto neuronale dalla micro piastra. Aggiungere cinquanta microlitri della soluzione anticorpale anti gluA1 o anti gluA2 ai pozzi corrispondenti della micro piastra.
Aggiungere cinquanta microlitri di mezzi neuronali all'anticorpo secondario solo pozzi di controllo. Incubare a temperatura ambiente per venti minuti per consentire il legame anticorpale. Successivamente rimuovere i supporti esistenti dai pozzi.
Lavare la micro piastra tre volte con 100 microlitri di mezzi neuronali a temperatura ambiente per pozzo per rimuovere eventuali anticorpi non vincolati. Quindi aggiungere 100 microlitri 100 micromolari di soluzione stock DHPG ad ogni pozzo. Incubare in un incubatore di anidride carbonica al 5% a 37 gradi Celsius per dieci minuti.
Rimuovere quindi la soluzione DHPG e aggiungere 100 microlitri di mezzi neuronali a ciascun pozzo. Ripetere questo processo una seconda volta. Quindi incubare nell'incubatore di anidride carbonica al 5% a 37 gradi Celsius per cinque minuti.
Il giorno dell'esperimento preparare una soluzione di paraformaldeide al 4% e 4% di saccarosio NPBS. Rimuovere il supporto da ogni pozzo e sostituirlo con 100 microlitri della soluzione di paraformaldeide e saccarosio. Ripetere questo processo per ogni punto di tempo di addizione.
Incubare la micro piastra a 4 gradi Celsius per venti minuti. Quindi rimuovere il fissatore e aggiungere 100 microlitri di DPBS ad ogni pozzo. Rimuovere il DPBS e aggiungere 150 microlitri di buffer di blocco a ciascun pozzo.
Incubare a temperatura ambiente per novanta minuti. Rimuovere il tampone di blocco e aggiungere 50 microlitri della soluzione anticorpale secondaria ad ogni pozzo. Incubare a temperatura ambiente per sessanta minuti mantenendo la piastra protetta dalla luce.
Rimuovere la soluzione anticorpale e aggiungere 100 microlitri di TBS ad ogni pozzo. Incubare a temperatura ambiente per cinque minuti. Ripetere questo processo, rimuovendo il supporto dai pozzi aggiungendo TBS e incubando a temperatura ambiente altre quattro volte.
Successivamente, rimuovere il TBS dalla micro piastra. Aggiungere 100 microlitri di una soluzione di paraformaldeide al 4% e 4% di saccarosio in PBS a ciascun pozzo. Incubare a temperatura ambiente per quindici minuti.
Rimuovere la soluzione di paraformaldeide e aggiungere 100 microlitri di TBS in ogni pozzo e incubare a temperatura ambiente per cinque minuti. Ripetere questo passaggio due volte in più. Preparare innanzitutto una soluzione di TBS contenente 2%saponina e vortice la soluzione brevemente per sciogliere completamente la polvere di saponina.
Utilizzando un filtro a 2 micrometri, filtrare la soluzione per rimuovere eventuali particelle che potrebbero causare autofluorescenza. Aggiungere 150 microlitri di questa soluzione di saponina al 2% ad ogni pozzo e incubare a temperatura ambiente per quindici minuti. Quindi rimuovere la soluzione di saponina e aggiungere 150 microlitri di tampone di blocco ad ogni pozzo.
Incubare a temperatura ambiente per novanta minuti. Successivamente rimuovere il tampone di blocco e aggiungere cinquanta microlitri della soluzione anticorpale secondaria ad ogni pozzo. Incubare a temperatura ambiente per sessanta minuti.
Quindi aggiungere 100 microlitri di TBS ad ogni pozzo e incubare a temperatura ambiente per cinque minuti. Ripetere questo processo aggiungendo TBS e incubando a temperatura ambiente altre quattro volte. Utilizzando un sistema di imaging laser a infrarossi, l'immagine della microschedre da 96 pozzi secondo le istruzioni dei produttori.
Impostare la risoluzione di scansione su 84 micrometri. La qualità della scansione a medio e l'offset di messa a fuoco in base all'altezza di base della microstra di 96 pozzi utilizzata. Fare clic sul pulsante del menu Image Studio, esportare l'immagine per i supporti digitali ed esportare le immagini con una risoluzione di 300 dpi in formato TIFF.
Aprite l'immagine in ImageJ Fiji. Dividere i canali di colore facendo clic sul menu immagine e quindi colorare, dividere i canali. Quindi apri il gestore del ROI da analisi, strumenti.
Selezionare la casella per le etichette nel gestore del ROI, per classificare i cerchi con i numeri. Nel canale 6 80, o rosso, selezionare la regione di interesse selezionando lo strumento cerchio e disegnando un cerchio che si adatta accuratamente al primo pozzo. Quindi premere CTRL più T, trascinando il cerchio al pozzo successivo.
Ripetere questo processo fino a quando tutti i pozzi non sono cerchiati. Dal gestore del ROI fare clic su misura. Selezionare i valori visualizzati e copiarli in un foglio di diffusione.
Fare quindi clic sul canale verde e trasporre le ROM selezionate nell'immagine. Dal gestore del ROI fare clic su misura. Selezionare i valori visualizzati e copiarli in un foglio di diffusione.
Successivamente calcola le modifiche dell'espressione del recettore della superficie come delineato nel protocollo di testo. In questa procedura la persistenza dell'arco nella regolazione del traffico del recettore ampa viene esaminata utilizzando il traffico e il dosaggio del recettore degli amplificatori ad alto contenuto. I neuroni sono trattati con il bloccante del canale sodio-ioni TTX che inibisce i potenziali d'azione e riduce i livelli di arco.
Seguito dal DHPG che induce la traduzione e l'ubiquitinazione dell'arco. Sia le piscine superficiali che internezzate di gluA1 e gluA2 contenenti subunità del recettore apa sono state misurate a cinque e quindici minuti dopo il lavaggio dhpg. I neuroni ArcKR mostrano un aumento dell'endositosi gluA1 se trattati con DHPG, rispetto ai neuroni di tipo mentre.
Questo effetto non si vede quando i neuroni vengono trattati solo con TTX. L'espressione superficiale della subunità gluA2 è aumentata significativamente in brevi punti di tempo rispetto ai neuroni di tipo wile. Indica una potenziale sostituzione della subunità.
Assicurarsi che le cellule siano paraformaldeide fissa illiquide deve essere preparato fresco il giorno dell'esperimento. Le cellule devono essere riparato dopo l'etichettatura per i recettori superficiali. Altri metodi come la microscopia confocale saranno in grado di fornire una risoluzione a singola cellula per caratterizzare ulteriormente i cambiamenti correlati nella struttura neuronale e nella localizzazione del recettore.
Interrompere la dinamica temporale dell'arco altera il traffico di recettori ampa in risposta a MgluR mediato LTD. Le direzioni future saranno misurare il traffico di recettori ampa in risposta ad altri stimoli. Questo saggio può essere adattabile ad altri tipi di cellule, trattamenti e recettori, a condizione che la procedura sia accuratamente regolata e adeguatamente convalidata.
È necessario fare attenzione a garantire che densità cellulari, tempi di trattamento, passaggi di fissazione, passaggi di permeabilizzazione e selezioni di reagenti siano ottimizzati il sistema di interesse. Per un completamento efficace ed efficiente del saggio è importante preparare la soluzione DHPG e la soluzione di paraformaldeide 4%, 4% di saccarosio il giorno dell'esperimento. Il controllo ben trattato con vakeel o TTX è necessario per garantire che gli effetti osservati siano specifici del trattamento.
È anche fondamentale includere pozzi trattati con solo gli anticorpi secondari per il controllo della fluorescenza di fondo prodotti da attacchi non specifici.
