Name: assay to measure nucleocytoplasmic transport in real time within motor neuron-like nsc-34 cells
Uploaded: 2017-05-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
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AIラボのメンバー全員に、有益なご意見とご提案をいただき、ありがとうございます。私たちはシャトル-GFPベクターを提供してくれたMark Hipp教授（Max Planck生化学研究所）に感謝します。この作業は、イスラエル科学財団（ISF＃124/14）、Binational Science Foundation（BSF＃2013325）、FP7 Marie Curie Career Integration Grant（CIG＃333794）、イスラエルの精神生物学研究所NIPI＃b133-14 / 15）。

1.細胞株の調製<ol><li>液体窒素容器に保存されたマウス神経芽細胞腫脊髄細胞（NSC-34細胞）を約1,000,000個解凍。細胞が完全に解凍するまで、37°C​​の水インキュベーターを使用してください。 </li><li>新鮮な暖かい培地（10％ウシ胎仔血清（FBS）、1％L-グルタミン、および1％ペン - ストレプト系抗生物質を含むDMEM培地）を加える。 </li><li>解凍した細胞（SL16R）を500×gで5分間遠心分離し、細胞ペレットを形成する。培地を捨て、細胞再懸濁のために新しい培地1 mLを加える。 </li><li>再懸濁した細胞を15mLフラスコに入れ、培地5mLを追加する。 37℃で5％CO 2を含む無菌インキュベーターで細胞を一晩インキュベートする。 </li><li>平行して、60mmの培養皿に8枚の被覆されていないカバーガラス（カバーガラス：12mm、0.13-0.17mm厚）を置き、70％エタノールを用いて滅菌し、乾燥するまで30分間UV光に暴露する。各ディッシュに培地を加え、処分して残留エタノールを洗い流す。</li><li>接着細胞が解離するのを可能にするために約90％コンフルエンス（約600万細胞/フラスコ）に到達した後、細胞にトリプシン緩衝液（2.5gのトリプシンおよび0.2gのEDTAを1Lのハンクス平衡塩溶液中に加える。 注：NSC-34細胞は高感度であり、培地を使用して解離する前に、トリプシン緩衝液インキュベーション15秒およびトリプシンを含まないインキュベーション1分を必要とするのみである。 </li><li> 1枚のプレートにつき約35万の培地3mLを含むカバースリップを既に含む60mm培養皿上に細胞をプレートする。インキュベーターに24時間放置し、カバースリップ上に細胞を付着させます。 </li></ol> 2.細胞トランスフェクション注：約24時間後、NSC-34細胞は40％コンフルエンシー（約800,000細胞）に達し、トランスフェクションの準備が整うでしょう。 <ol><li>純粋なDMEM培地（各60mm培養皿のための300μLのDMEM培地）を滅菌微量遠心分離槽es。 </li><li>各DMEM含有マイクロ遠心チューブにトランスフェクションに必要な各プラスミド2μgを加えます。 注：シャトル-GFPプラスミドは、すべての細胞トランスフェクションにおいて必須です。 </li><li>必要なプラスミドを含むすべてのマイクロ遠心チューブにトランスフェクション試薬を加えます。ここでは、市販のトランスフェクション試薬4μLを2μgのDNAごとに添加します。 </li><li> DMEM、プラスミド、トランスフェクション試薬を含むマイクロ遠心チューブをボルテックスし、室温で25分間インキュベートする。 </li><li>各微量遠心チューブを培養皿に加え、皿を静かに攪拌して均質な溶液を形成させる。 48時間インキュベーターに皿を戻します。 注：shuttle-GFPはすべての細胞で発現する必要があるため、シャトル-GFPトランスフェクション効率は、一晩のトランスフェクション後に部分的に検査し、蛍光顕微鏡を使用して事前試験することができます。非蛍光発現タンパク質の完全な検査は、イムノブロット分析です。 </li></ol> 3.顕微鏡検査<ol><li>トランスフェクションされたNSC-34細胞を含むカバースリップをカバースリップホルダーに取り付け、リン酸緩衝化生理食塩水（PBS）で穏やかに洗って、剥がれた死細胞を除去する。 </li><li>倒立顕微鏡を備えた緑色蛍光フィルターを使用して、適切な細胞パッチを同定する。 注：適切な細胞パッチは、多数の細胞（野外で20〜30個の細胞）を示し、細胞内で核が明確に定義されている顕微鏡視野と定義されています。細胞パッチ内の細胞核は、最初に目で同定され、イメージングソフトウェアによって手動でマークされる。 </li><li>顕微鏡下でカバーガラス上にバッファーを滴下することによってカバースリップにPBS中10ng / mL LMBを含む200μLのexportin-1阻害剤Leptomycin B（LMB）バッファーを加える。 注：この時点は間隔ゼロとして設定されます。 </li><li>約400〜500秒間、3秒間隔でマークされた核の蛍光強度を定量する。 </li><li&gt;個々の実験において、各トランスフェクショングループについて3〜5枚のカバースリップをテストする。 </li></ol> 4.分析注：異なる細胞は異なるレベルの蛍光シャトル-GFPを発現するので、各細胞の核蛍光強度をそれ自身の初期蛍光強度に正規化することが重要である。 <ol><li>各核の3秒間の蛍光間隔をその核の最初の6回の間隔の平均で割ることによって、マークされた核の蛍光強度を標準化する。 </li><li>各核の正規化の後、各細胞パッチの時間の関数としての核の蛍光の変化を表す蛍光強度曲線を生成する。これを行うには、各細胞パッチ（各パッチで約20〜30個の細胞からなる）のすべての細胞の平均を計算する。 注：核の蛍光強度曲線はミカエリス - メンテン飽和曲線に似ていますが、これは増加したti内でよりよく観察されます私の時代。これは、核輸送による経時的なシャトル-GFPの細胞質ゾル量の減少によるものである。この減少は、シャトル-GFPが核に輸送される確率を統計的に低下させ、したがって核蛍光の飽和に達する。曲線の線形初期速度から導出された勾配は、核へのV max入射速度をもたらす。 </li><li>グラフ作成ソフトウェアを使用して、3〜5回の独立した実験から得られた各細胞パッチのV max勾配を分析して、各実験群を表す1つの勾配を生成する。一元配置ANOVA統計分析を使用して定量を行います。 </li></ol> 5.タンパク質発現の確認<ol><li>氷上で各実験群からの残存細胞（上記の実験では使用されていない）を含む60mm培養皿を置く。 </li><li>培地を廃棄し、細胞をPBSで2回洗浄し、残りの培地を希釈して洗浄する。 </li><li>細胞を200〜400で処理するPBS、0.5％トリトン、およびプロテアーゼ阻害剤カクテル錠剤（PI）を含有する溶解緩衝液μL。セルスクレーパーを使用してスクレーピングする。 </li><li>マイクロ遠心チューブ中で細胞を溶解緩衝液に集め、氷下で4,000rpmで1分間ホモジナイザーでホモジナイズする。 </li><li>ホモジナイズした細胞を2,500 xgで10分間遠心分離する。上清を回収し、Bradfordアッセイを用いてタンパク質濃度を定量し、-20℃で使用するまで保存する。 </li><li> 30〜70μgの全タンパク質（タンパク質に依存する）を収集し、SDS-PAGEゲルにロードして、イムノブロットアッセイを用いてタンパク質発現を試験する。 </li></ol>

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	<li>Alberts, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular biology of the cell. , (2002).</li><li>Freitas, N., Cunha, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+and+signals+for+the+nuclear+import+of+proteins.">Mechanisms and signals for the nuclear import of proteins.</a> Curr Genomics. 10, 550-557 (2009).</li><li>Kalderon, D., Roberts, B. L., Richardson, W. D., Smith, A. 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D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GGGGCC+repeat+expansion+in+C9orf72+compromises+nucleocytoplasmic+transport.">GGGGCC repeat expansion in C9orf72 compromises nucleocytoplasmic transport.</a> Nature. 525, 129-133 (2015).</li><li>Jovicic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modifiers+of+C9orf72+dipeptide+repeat+toxicity+connect+nucleocytoplasmic+transport+defects+to+FTD/ALS.">Modifiers of C9orf72 dipeptide repeat toxicity connect nucleocytoplasmic transport defects to FTD/ALS.</a> Nat Neurosci. 18, 1226-1229 (2015).</li><li>Kwon, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly-dipeptides+encoded+by+the+C9orf72+repeats+bind+nucleoli,+impede+RNA+biogenesis,+and+kill+cells.">Poly-dipeptides encoded by the C9orf72 repeats bind nucleoli, impede RNA biogenesis, and kill cells.</a> Science. 345, 1139-1145 (2014).</li><li>Rossi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+accumulation+of+mRNAs+underlies+G4C2-repeat-induced+translational+repression+in+a+cellular+model+of+C9orf72+ALS.">Nuclear accumulation of mRNAs underlies G4C2-repeat-induced translational repression in a cellular model of C9orf72 ALS.</a> J Cell Sci. 128, 1787-1799 (2015).</li><li>Shi, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxic+PRn+poly-dipeptides+encoded+by+the+C9orf72+repeat+expansion+block+nuclear+import+and+export.">Toxic PRn poly-dipeptides encoded by the C9orf72 repeat expansion block nuclear import and export.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. , (2017).</li><li>Zhang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C9orf72+repeat+expansion+disrupts+nucleocytoplasmic+transport.">The C9orf72 repeat expansion disrupts nucleocytoplasmic transport.</a> Nature. 525, 56-61 (2015).</li><li>Zhang, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C9ORF72+poly(GA)+aggregates+sequester+and+impair+HR23+and+nucleocytoplasmic+transport+proteins.">C9ORF72 poly(GA) aggregates sequester and impair HR23 and nucleocytoplasmic transport proteins.</a> Nat Neurosci. 19, 668-677 (2016).</li><li>Cleveland, D. W., Rothstein, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+Charcot+to+Lou+Gehrig:+deciphering+selective+motor+neuron+death+in+ALS.">From Charcot to Lou Gehrig: deciphering selective motor neuron death in ALS.</a> Nat Rev Neurosci. 2, 806-819 (2001).</li><li>DeJesus-Hernandez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanded+GGGGCC+hexanucleotide+repeat+in+noncoding+region+of+C9ORF72+causes+chromosome+9p-linked+FTD+and+ALS.">Expanded GGGGCC hexanucleotide repeat in noncoding region of C9ORF72 causes chromosome 9p-linked FTD and ALS.</a> Neuron. 72, 245-256 (2011).</li><li>Renton, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hexanucleotide+repeat+expansion+in+C9ORF72+is+the+cause+of+chromosome+9p21-linked+ALS-FTD.">A hexanucleotide repeat expansion in C9ORF72 is the cause of chromosome 9p21-linked ALS-FTD.</a> Neuron. 72, 257-268 (2011).</li><li>Boeve, B. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+frontotemporal+dementia+and/or+amyotrophic+lateral+sclerosis+associated+with+the+GGGGCC+repeat+expansion+in+C9ORF72.">Characterization of frontotemporal dementia and/or amyotrophic lateral sclerosis associated with the GGGGCC repeat expansion in C9ORF72.</a> Brain. 135, 765-783 (2012).</li><li>Haeusler, A. R., Donnelly, C. J., Rothstein, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+expanding+biology+of+the+C9orf72+nucleotide+repeat+expansion+in+neurodegenerative+disease.">The expanding biology of the C9orf72 nucleotide repeat expansion in neurodegenerative disease.</a> Nat Rev Neurosci. 17, 383-395 (2016).</li><li>Woerner, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+protein+aggregates+interfere+with+nucleocytoplasmic+transport+of+protein+and+RNA.">Cytoplasmic protein aggregates interfere with nucleocytoplasmic transport of protein and RNA.</a> Science. 351, 173-176 (2016).</li><li>Tao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleolar+stress+and+impaired+stress+granule+formation+contribute+to+C9orf72+RAN+translation-induced+cytotoxicity.">Nucleolar stress and impaired stress granule formation contribute to C9orf72 RAN translation-induced cytotoxicity.</a> Hum Mol Genet. 24, 2426-2441 (2015).</li><li>Wen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antisense+proline-arginine+RAN+dipeptides+linked+to+C9ORF72-ALS/FTD+form+toxic+nuclear+aggregates+that+initiate+in+vitro+and+in+vivo+neuronal+death.">Antisense proline-arginine RAN dipeptides linked to C9ORF72-ALS/FTD form toxic nuclear aggregates that initiate in vitro and in vivo neuronal death.</a> Neuron. 84, 1213-1225 (2014).</li></ol>

著者は何も開示することはありません。

このプロトコールは、核細胞質輸送における微小変化を評価するための、高感度かつ定量的な新しいアッセイを実証している。このシステムを使用すると、蛋白質の分布に劇的な変化をもたらす大きな欠損だけでなく、リアルタイムで核細胞質輸送およびその機能不全を観察および測定することが可能である。このアッセイは、感度優位性を有するばかりでなく、調製もほとんど必要とせず?...

核細孔複合体（NPC）は、細胞核に出入りする大分子の輸出入を制御する。第1規則なしで核に入ることができる小分子とは対照的に、より大きな分子の輸送はNPCによって強く制御される。タンパク質やRNAなどのこれらの大きな分子は、輸入や輸出を含む輸送要因と関連して核2から輸入され、輸出されます2 。輸入するためには、蛋白質には、一般に核局在化シグナル（NLS）と呼ばれる小さなペプチドモチーフが含まれていなければならない。これらのアミノ酸配列はタグとして作用し、組成物3,4 において多様である。タンパク質は、それらのエクスポージャーとの関連性のために、核から細胞質に輸出することができる一般に核輸出シグナル（NES） 2と呼ばれるシグナル配列に結合する。輸入業者と輸出業者の両方は、小型Ras関連核タンパク質GTPアーゼ（Ran） 2の調節のために貨物を輸送することができる。 Ranは、それがGTPまたはGDPに結合しているかどうかによって、異なる立体構造状態で存在することが示されている。 GTPに結合すると、Ranはimportinまたはexportinにバインドできます。 RanGTPに結合すると、インポートインはそれらの貨物を放出するが、輸出はRanGTPに結合して輸出貨物と複合体を形成しなければならない。 Ranの優勢なヌクレオチド結合状態は、核（RanGTP）または細胞質（RanGDP）におけるその位置に依存する。 最近、いくつかの研究が、核細胞質経路の障害と筋萎縮性側索硬化症（ALS）および前頭側頭型痴呆（FTD）の両方の間の関連を示している5,6 </sup&gt; 、 7、8、9、10、11、12 。 ALSは、上下運動ニューロン（MN） 13に影響を及ぼし、麻痺をもたらし、最終的には死亡し、平均で2〜5年以内に進行する致死的な神経変性疾患である。 ALSのほとんどの症例は散発性（SALS）と分類され、明らかな遺伝的連鎖はないが、10％が優性遺伝（家族性ALS; FALS）で遺伝する。最近、ALSおよびFTDの遺伝的原因として、第9染色体のオープンリーディングフレーム72（C9orf72）遺伝子におけるヘキサヌクレオチド反復増幅（HRE）が14,15であることが同定された。これらの突然変異体は、FALS症例の30〜40％を占め、異なる研究が争われているそれらが核細胞質輸送5,6,7,8,9,10,11,12に影響を及ぼすことによって毒性を引き起こすことを示している。 これらの研究は、核細胞質輸送に関するHREの最終的な結果および発現をほとんど示しているが、リアルタイムで核細胞質崩壊を示さない。その結果、重度の核細胞質輸送の欠損のみが評価された11,17,18。 このプロトコルは、新しいとveリアルタイムで核細胞輸送機能不全を評価および定量するためのry感受性アッセイ。 NLS-NES-GFPタンパク質（シャトル-GFP）の輸入率は、蛍光顕微鏡を用いてリアルタイムで定量することができる。これは、以前に記載されているように、exportinインヒビターを用いて行われ、シャトル-GFPのみが核に入ることを可能にする。蛍光顕微鏡およびリアルタイムで蛍光変化を定量化することができるソフトウェアを使用して、核内に位置するシャトル-GFPの蛍光強度の段階的変化を定量化することが可能である。結果として、任意の所与の時間における核シャトル-GFPの量を表す、蛍光対時間軸のミカエリス - メンテン様の飽和曲線を作成することができる。曲線の初期線形速度を用いることにより、蛍光飽和前に核への進入速度を表す勾配を生成することが可能である。 アッセイを検証するために、翻訳以前に核細胞質輸送を破壊すると報告されているd C9orf72ジペプチドリピート、ポリ（GR）およびポリ（PR）を5,7,8,10,12で使用した。このアッセイを用いて、対照と比較して核の輸入率の50％の減少が観察された。このシステムを用いて、核細胞質輸送の微小な変化を調べることができる。さらに、核細胞質輸送欠陥を救済する異なる因子の能力を決定することができる。

<table><tbody><tr><td>Mouse Motor Neuron-Like hybrid Cell Line (NSC-34)</td><td>tebu-bio</td><td>CLU140-A</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 4.5 g/L L-glucose</td><td>Biological Industries</td><td>01-055-1A</td><td></td></tr><tr><td>FBS European Grade</td><td>Biological Industries</td><td>04-007-1A</td><td></td></tr><tr><td>SL 16R Centrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004030</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Forma Series ii Water Jacketed CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; Incubator</td><td>Thermo Scientific</td><td>3111</td><td></td></tr><tr><td>Cover glass 12 mm dia., 0.13-0.17 mm thick</td><td>Bar Naor LTD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TurboFect Transfection Reagent</td><td>Thermo Scientific</td><td>&lt;a href=&quot;https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/R0531&quot;&gt;R0531&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Axiovert 100 inverted microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaging Workbench 2</td><td>Axon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leptomycin B</td><td>Sigma</td><td>L2913</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Biological Industries</td><td>02-023-1A</td><td></td></tr><tr><td>Homogenizer motor/control/chuck/90 degree clamp</td><td>Glas-Col</td><td>099C K5424CE</td><td></td></tr><tr><td>MicroCL 17R Centrifuge, Refrigerated</td><td>Thermo Scientific</td><td>75002455</td><td></td></tr></tbody></table>

assay to measure nucleocytoplasmic transport in real time within motor neuron-like nsc-34 cells

核細胞質輸送は、細胞核からの大きな分子の輸入および輸出を指す。最近、多くの研究が、筋萎縮性側索硬化症（ALS）と核細胞質経路における障害との関連を示している。 ALSは、運動ニューロンに影響を及ぼし、麻痺をもたらし、最終的には死亡し、2〜5年以内に平均して起こる神経変性疾患である。 ALSのほとんどの症例は散発的であり、明らかな遺伝的連鎖を欠いているが、10％が優勢に遺伝する。最近、第9染色体のオープンリーディングフレーム72（C9orf72）遺伝子におけるヘキサヌクレオチド反復増幅（HRE）が、ALSおよび前頭側頭型痴呆（FTD）の遺伝的原因として同定された。重要なことに、異なるグループは最近、これらの突然変異体が核細胞質輸送に影響を及ぼすことを提案している。これらの研究は、核細胞質輸送に関するHREによって引き起こされる最終的な結果および徴候をほとんど示しているが、核内輸送機能障害を示さないリアルタイム。結果として、重度の核細胞質輸送の欠損のみが、主に高過剰発現または外因性タンパク質挿入のために決定され得る。 このプロトコルは、リアルタイムでnucleocytoplasmic輸送機能不全を評価し定量化するための新しい非常に敏感なアッセイを記述します。 NLS-NES-GFPタンパク質（シャトル-GFP）の輸入率は、蛍光顕微鏡を用いてリアルタイムで定量することができる。これは、exportinインヒビターを用いて行われ、シャトルGFPのみが核に入ることを可能にする。アッセイを有効にするために、以前に核細胞質輸送を破壊することが示されているC9orf72 HRE翻訳ジペプチドリピート、ポリ（GR）およびポリ（PR）を使用した。記載されたアッセイを用いて、対照と比較して核輸入率の50％の減少が観察された。このシステムを用いて、核細胞質輸送の微小な変化を調べることができ、異なる因子が核細胞質trを（部分的に）救済する能力欠陥を判定することができる。

ここに示した手順を用いて、運動ニューロン様NSC-34細胞を、NLS-NES-GFP（シャトル-GFP）タンパク質でトランスフェクトした。 NLSおよびNESシグナル配列を有するこのタンパク質（ 図1 ）は、核と細胞質との間を行き来することができる。一般的なGFPは、拡散によってのみ局在化シグナルタグが存在しない場合に核に出入りすることができ、従って、核と細胞?...

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Assay to Measure Nucleocytoplasmic Transport in Real Time within Motor Neuron-like NSC-34 Cells

このプロトコルは、NLS-NES-GFPタンパク質の核内取り込みにおけるリアルタイム変化を定量化することにより、運動ニューロン様NSC-34細胞内の核細胞質輸送速度を敏感に測定する方法を記載する。

運動ニューロン様NSC-34細胞内のリアルタイムでの核細胞質輸送を測定するアッセイ

Nucleocytoplasmic transport refers to the import and export of large molecules from the cell nucleus. Recently, a number of studies have shown a ...

assay-to-measure-nucleocytoplasmic-transport-real-time-within-motor

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.6K ビュー.  Ben-Gurion University of the Negev. このプロトコルは、NLS-NES-GFPタンパク質の核内取り込みにおけるリアルタイム変化を定量化することにより、運動ニューロン様NSC-34細胞内の核細胞質輸送速度を敏感に測定する方法を記載する。 

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Nucleofection of Rodent Neuroblasts to Study Neuroblast Migration In vitro

The subventricular zone (SVZ) located in the lateral wall of the lateral ventricles plays a fundamental role in adult neurogenesis. In this restricted area of the brain, neural stem cells proliferate and constantly generate neuroblasts that migrate tangentially in chains along the rostral migratory stream (RMS) to reach the olfactory bulb (OB). Once in the OB, neuroblasts switch to radial migration and then differentiate into mature neurons able to incorporate into the preexisting neuronal network. Proper neuroblast migration is a fundamental step in neurogenesis, ensuring the correct functional maturation of newborn neurons. Given the ability of SVZ-derived neuroblasts to target injured areas in the brain, investigating the intracellular mechanisms underlying their motility will not only enhance the understanding of neurogenesis but may also promote the development of neuroregenerative strategies.
This manuscript describes a detailed protocol for the transfection of primary rodent RMS postnatal neuroblasts and the analysis of their motility using a 3D in vitro migration assay recapitulating their mode of migration observed in vivo. Both rat and mouse neuroblasts can be quickly and efficiently transfected via nucleofection with either plasmid DNA, small hairpin (sh)RNA or short interfering (si)RNA oligos targeting genes of interest. To analyze migration, nucleofected cells are reaggregated in &#39;hanging drops&#39; and subsequently embedded in a three-dimensional matrix. Nucleofection per se does not significantly impair the migration of neuroblasts. Pharmacological treatment of nucleofected and reaggregated neuroblasts can also be performed to study the role of signaling pathways involved in neuroblast migration.

Nucleofection of Rodent Neuroblasts to Study Neuroblast Migration In vitro

Neuroblast migration is a crucial step in postnatal neurogenesis. The protocol described here can be used to investigate the role of candidate regulators of neuroblast migration by employing DNA/small hairpin RNA (shRNA) nucleofection and a 3D migration assay with neuroblasts isolated from the rodent postnatal rostral migratory stream.

神経芽細胞の移行を検討するために、げっ歯類神経芽細胞のクレオ<em&gt;インビトロ</em

The subventricular zone (SVZ) located in the lateral wall of the lateral ventricles plays a fundamental role in adult neurogenesis. In this restricted ...

神経科学

A High Content Imaging Assay for Identification of Botulinum Neurotoxin Inhibitors

Synaptosomal-associated protein-25 (SNAP-25) is a component of the soluble NSF attachment protein receptor (SNARE) complex that is essential for synaptic neurotransmitter release. Botulinum neurotoxin serotype A (BoNT/A) is a zinc metalloprotease that blocks exocytosis of neurotransmitter by cleaving the SNAP-25 component of the SNARE complex. Currently there are no licensed medicines to treat BoNT/A poisoning after internalization of the toxin by motor neurons. The development of effective therapeutic measures to counter BoNT/A intoxication has been limited, due in part to the lack of robust high-throughput assays for screening small molecule libraries. Here we describe a high content imaging (HCI) assay with utility for identification of BoNT/A inhibitors. Initial optimization efforts focused on improving the reproducibility of inter-plate results across multiple, independent experiments. Automation of immunostaining, image acquisition, and image analysis were found to increase assay consistency and minimize variability while enabling the multiparameter evaluation of experimental compounds in a murine motor neuron system.

Botulinum neurotoxin is one of the most potent toxins among Category-A biothreat agents, yet a post-exposure therapeutic is not available. The high content imaging approach is a powerful methodology for identifying novel inhibitors as it enables multiparameter screening using biologically relevant motor neurons, the primary target of this toxin.

ボツリヌス神経毒素阻害剤の同定のためのハイコンテントイメージングアッセイ

Synaptosomal-associated protein-25 (SNAP-25) is a component of the soluble NSF attachment protein receptor (SNARE) complex that is essential for synaptic ...

Single-Molecule Imaging of Nuclear Transport

The utility of single molecule fluorescence microscopy approaches has been proven to be of a great avail in understanding biological reactions over the last decade. The investigation of molecular interactions with high temporal and spatial resolutions deep within cells has remained challenging due to the inherently weak signals arising from individual molecules. Recent works by Yang et al. demonstrated that narrow-field epifluorescence microscopy allows visualization of nucleocytoplasmic transport at the single molecule level. By the single molecule approach, important kinetics, such as nuclear transport time and efficiency, for signal-dependent and independent cargo molecules have been obtained. Here we described a protocol for the methodological approach with an improved spatiotemporal resolution of 0.4 ms and 12 nm. The improved resolution enabled us to capture transient active transport and passive diffusion events through the nuclear pore complexes (NPC) in semi-intact cells. We expect this method to be used in elucidating other binding and trafficking events within cells.

Single molecule microscopy approch provided novel insights into nuclear transport.

核輸送の1分子イメージング

The utility of single molecule fluorescence microscopy approaches has been proven to be of a great avail in understanding biological reactions over the ...

生物学

Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, survival, and glial communications. To date, numerous studies have reported that defects in these systems cause various neuronal diseases. Thus, understanding the mechanisms underlying vesicle dynamics may provide influential clues that could aid in the treatment of several neuronal disorders. Here, we describe a method for quantifying vesicle motilities, such as motility distance and rate of movement, using a software plug-in for the ImageJ platform. To obtain images for quantification, we labeled neuronal endosome-lysosome structures with EGFP-tagged vesicle marker proteins and observed the movement of vesicles using a time-lapse microscopy. This method is highly useful and simplify measuring vesicle motility in neurites, such as axons and dendrites, as well as in the soma of both neurons and glial cells. Furthermore, this method can be applied to other cell lines, such as fibroblasts and endothelial cells. This approach could provide a valuable advancement of our understanding of membrane trafficking.

The investigation of membrane trafficking is crucial for understanding neuronal functions. Here, we introduce a method for quantifying vesicle motility in neurons. This is a convenient method that can be adapted to the quantification of membrane trafficking in the nervous system.

蛍光プローブを用いた培養ニューロンにおけるエンドソームおよびリソソームの動力学の定量

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, ...

A High-content Assay for Monitoring AMPA Receptor Trafficking

Postsynaptic trafficking of receptors to and from the cell surface is an important mechanism by which neurons modulate their responsiveness to different stimuli. The &#945;-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid (AMPA) receptors, which are responsible for fast excitatory synaptic transmission in neurons, are trafficked to and from the postsynaptic surface to dynamically alter neuronal excitability. AMPA receptor trafficking is essential for synaptic plasticity and can be disrupted in neurological disease. However, prevalent approaches for quantifying receptor trafficking ignore entire receptor pools, are overly time- and labor-intensive, or potentially disrupt normal trafficking mechanisms and therefore complicate the interpretation of resulting data. We present a high-content assay for the quantification of both surface and internal AMPA receptor populations in cultured primary hippocampal neurons using dual fluorescent immunolabeling and a near-infrared fluorescent 96-well microplate scanner. This approach facilitates the rapid screening of bulk internalized and surface receptor densities while minimizing sample material. However, our method has limitations in obtaining single-cell resolution or conducting live cell imaging. Finally, this protocol may be amenable to other receptors and different cell types, provided proper adjustments and optimization.

Neuronal excitability can be modulated through a dynamic process of endo- and exocytosis of excitatory ionotropic glutamate receptors. Described here is an accessible, high-content assay for quantifying surface and internal receptor population pools.

AMPA の監視用高コンテンツ受容体トラフィッ キング

Postsynaptic trafficking of receptors to and from the cell surface is an important mechanism by which neurons modulate their responsiveness to different ...

Imaging and Analysis of Neurofilament Transport in Excised Mouse Tibial Nerve

Neurofilament protein polymers move along axons in the slow component of axonal transport at average speeds of ~0.35-3.5 mm/day. Until recently the study of this movement in situ was only possible using radioisotopic pulse-labeling, which permits analysis of axonal transport in whole nerves with a temporal resolution of days and a spatial resolution of millimeters. To study neurofilament transport in situ with higher temporal and spatial resolution, we developed a hThy1-paGFP-NFM transgenic mouse that expresses neurofilament protein M tagged with photoactivatable GFP in neurons. Here we describe fluorescence photoactivation pulse-escape and pulse-spread methods to analyze neurofilament transport in single myelinated axons of tibial nerves from these mice ex vivo. Isolated nerve segments are maintained on the microscope stage by perfusion with oxygenated saline and imaged by spinning disk confocal fluorescence microscopy. Violet light is used to activate the fluorescence in a short axonal window. The fluorescence in the activated and flanking regions is analyzed over time, permitting the study of neurofilament transport with temporal and spatial resolution on the order of minutes&#160;and microns, respectively. Mathematical modeling can be used to extract kinetic parameters of neurofilament transport including the velocity, directional bias and pausing behavior from the resulting data. The pulse-escape and pulse-spread methods can also be adapted to visualize neurofilament transport in other nerves. With the development of additional transgenic mice, these methods could also be used to image and analyze the axonal transport of other cytoskeletal and cytosolic proteins in axons.

We describe fluorescence photoactivation methods to analyze the axonal transport of neurofilaments in single myelinated axons of peripheral nerves from transgenic mice that express a photoactivatable neurofilament protein.

切除されたマウス脛骨神経におけるニューロフィラメント輸送のイメージングと解析

Neurofilament protein polymers move along axons in the slow component of axonal transport at average speeds of ~0.35-3.5 mm/day. Until recently the study ...

Nuclear Transport Assays in Permeabilized Mouse Cortical Neurons

Disruption of nucleocytoplasmic transport is increasingly implicated in the pathogenesis of neurodegenerative diseases. Moreover, there is a growing recognition of cell-specific differences in nuclear pore complex structure, prompting a need to adapt nuclear transport methods for use in neurons. Permeabilized cell assays, in which the plasma membrane is selectively perforated by digitonin, are widely used to study passive and active nuclear transport in immortalized cell lines but have not been applied to neuronal cultures. In our initial attempts, we observed the rapid loss of nuclear membrane integrity in primary mouse cortical neurons exposed to even low concentrations of digitonin. We hypothesized that neuronal nuclear membranes may be uniquely vulnerable to the loss of cytoplasmic support. After testing multiple approaches to improve nuclear stability, we observed optimal nuclear integrity following hypotonic lysis in the presence of a concentrated bovine serum albumin cushion. Neuronal nuclei prepared by this approach reliably import recombinant fluorescent cargo in an energy-dependent manner, facilitating analysis of nuclear import by high content microscopy with automated analysis. We anticipate that this method will be broadly applicable to studies of passive and active nuclear transport in primary neurons.

We have developed a reliable method of selective plasma membrane permeabilization of primary mouse cortical neurons for high content automated analysis of neuronal nucleocytoplasmic transport.

Disruption of nucleocytoplasmic transport is increasingly implicated in the pathogenesis of neurodegenerative diseases. Moreover, there is a growing ...

Real-Time Fluorescent Measurement of Synaptic Functions in Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis

Before neuronal degeneration, the cause of motor and cognitive deficits in patients with amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and/or frontotemporal lobe dementia (FTLD) is dysfunction of communication between neurons and motor neurons and muscle. The underlying process of synaptic transmission involves membrane depolarization-dependent synaptic vesicle fusion and the release of neurotransmitters into the synapse. This process occurs through localized calcium influx into the presynaptic terminals where synaptic vesicles reside. Here, the protocol describes fluorescence-based live-imaging methodologies that reliably report depolarization-mediated synaptic vesicle exocytosis and presynaptic terminal calcium influx dynamics in cultured neurons.
Using a styryl dye that is incorporated into synaptic vesicle membranes, the synaptic vesicle release is elucidated. On the other hand, to study calcium entry, Gcamp6m is used, a genetically encoded fluorescent reporter. We employ high potassium chloride-mediated depolarization to mimic neuronal activity. To quantify synaptic vesicle exocytosis unambiguously, we measure the loss of normalized styryl dye fluorescence as a function of time. Under similar stimulation conditions, in the case of calcium influx, Gcamp6m fluorescence increases. Normalization and quantification of this fluorescence change are performed in a similar manner to the styryl dye protocol. These methods can be multiplexed with transfection-based overexpression of fluorescently tagged mutant proteins. These protocols have been extensively used to study synaptic dysfunction in models of FUS-ALS and C9ORF72-ALS, utilizing primary rodent cortical and motor neurons. These protocols easily allow for rapid screening of compounds that may improve neuronal communication. As such, these methods are valuable not only for the study of ALS but for all areas of neurodegenerative and developmental neuroscience research.

Two related methods are described to visualize subcellular events required for synaptic transmission. These protocols enable the real-time monitoring of the dynamics of presynaptic calcium influx and synaptic vesicle membrane fusion using live-cell imaging of in vitro cultured neurons.

筋萎縮性側索硬化症のモデルにおけるシナプス機能のリアルタイム蛍光測定

Before neuronal degeneration, the cause of motor and cognitive deficits in patients with amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and/or frontotemporal lobe ...

Expanding the Toolkit for In Vivo Imaging of Axonal Transport

Axonal transport maintains neuronal homeostasis by enabling the bidirectional trafficking of diverse organelles and cargoes. Disruptions in axonal transport have devastating consequences for individual neurons and their networks, and contribute to a plethora of neurological disorders. As many of these conditions involve both cell autonomous and non-autonomous mechanisms, and often display a spectrum of pathology across neuronal subtypes, methods to accurately identify and analyze neuronal subsets are imperative.
This paper details protocols to assess in vivo axonal transport of signaling endosomes and mitochondria in sciatic nerves of anesthetized mice. Stepwise instructions are provided to 1) distinguish motor from sensory neurons in vivo, in situ, and ex vivo by using mice that selectively express fluorescent proteins within cholinergic motor neurons; and 2) separately or concurrently assess in vivo axonal transport of signaling endosomes and mitochondria. These complementary intravital approaches facilitate the simultaneous imaging of different cargoes in distinct peripheral nerve axons to quantitatively monitor axonal transport in health and disease.

Expanding the Toolkit for In Vivo Imaging of Axonal Transport

Using transgenic fluorescent mice, detailed protocols are described to assess in vivo axonal transport of signaling endosomes and mitochondria within motor and sensory axons of the intact sciatic nerve in live animals.

軸索輸送の In Vivo イメージングのためのツールキットの拡張

Axonal transport maintains neuronal homeostasis by enabling the bidirectional trafficking of diverse organelles and cargoes. Disruptions in axonal ...

Measuring Axonal Cargo Transport in Mouse Primary Cortical Cultured Neurons

Neuronal cells are highly polarized cells that stereotypically harbor several dendrites and an axon. The length of an axon necessitates efficient bidirectional transport by motor proteins. Various reports have suggested that defects in axonal transport are associated with neurodegenerative diseases. Also, the mechanism of the coordination of multiple motor proteins has been an attractive topic. Since the axon has uni-directional microtubules, it is easier to determine which motor proteins are involved in the movement. Therefore, understanding the mechanisms underlying the transport of axonal cargo is crucial for uncovering the molecular mechanism of neurodegenerative diseases and the regulation of motor proteins. Here, we introduce the entire process of axonal transport analysis, including the culturing of mouse primary cortical neurons, transfection of plasmids encoding cargo proteins, and directional and velocity analyses without the effect of pauses. Furthermore, the open-access software "KYMOMAKER" is introduced, which enables the generation of a kymograph to highlight transport traces according to their direction and allow easier visualization of axonal transport.

The present protocol describes the whole procedure of analysis for axonal transport. In particular, the calculation of transport velocity, not including the pausing, and the visualization method using open-access software "KYMOMAKER" are shown here.

運動ニューロン様NSC-34細胞内のリアルタイムでの核細胞質輸送を測定するアッセイ

要約

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神経芽細胞の移行を検討するために、げっ歯類神経芽細胞のクレオ

ボツリヌス神経毒素阻害剤の同定のためのハイコンテントイメージングアッセイ

核輸送の1分子イメージング

蛍光プローブを用いた培養ニューロンにおけるエンドソームおよびリソソームの動力学の定量

AMPA の監視用高コンテンツ受容体トラフィッキング

切除されたマウス脛骨神経におけるニューロフィラメント輸送のイメージングと解析

Nuclear Transport Assays in Permeabilized Mouse Cortical Neurons

筋萎縮性側索硬化症のモデルにおけるシナプス機能のリアルタイム蛍光測定

軸索輸送の In Vivo イメージングのためのツールキットの拡張

Measuring Axonal Cargo Transport in Mouse Primary Cortical Cultured Neurons

運動ニューロン様NSC-34細胞内のリアルタイムでの核細胞質輸送を測定するアッセイ

要約

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神経芽細胞の移行を検討するために、げっ歯類神経芽細胞のクレオ

ボツリヌス神経毒素阻害剤の同定のためのハイコンテントイメージングアッセイ

核輸送の1分子イメージング

蛍光プローブを用いた培養ニューロンにおけるエンドソームおよびリソソームの動力学の定量

AMPA の監視用高コンテンツ受容体トラフィッ キング

切除されたマウス脛骨神経におけるニューロフィラメント輸送のイメージングと解析

Nuclear Transport Assays in Permeabilized Mouse Cortical Neurons

筋萎縮性側索硬化症のモデルにおけるシナプス機能のリアルタイム蛍光測定

軸索輸送の In Vivo イメージングのためのツールキットの拡張

Measuring Axonal Cargo Transport in Mouse Primary Cortical Cultured Neurons

AMPA の監視用高コンテンツ受容体トラフィッキング