Utilizzando il nostro protocollo, possiamo visualizzare e valutare quantitativamente la dinamica degli endosomi e dei mitocondri di segnalazione all'interno degli assoni dai neuroni motori e sensoriali di topi vivi anestetizzati. Questo metodo che può essere utilizzato per comprendere la fisiologia basale degli assoni in vivo e rivelare un importante meccanismo patologico che guida la neurodegenerazione periferica nel modello murino di malattia. La nostra tecnica può essere utilizzata per valutare l'effetto di potenziali trattamenti come agenti farmacologici e terapie geniche sul trasporto assonale nei neuroni motori e sensoriali vivi.
Questa tecnica può essere utilizzata per visualizzare contemporaneamente diversi organelli in uno specifico assone del nervo periferico e trasmettere lo studio dei modelli di malattia motoria e l'invecchiamento. Iniziare i preparativi tirando una micropipetta di vetro graduato per iniezioni intramuscolari ottimali nei muscoli più piccoli. Per l'intervento chirurgico, fissare un telo chirurgico sterile su un tappetino termico impostato a 37 gradi Celsius e posizionare e mettere a fuoco il microscopio operatorio.
Quindi, disimballare tutti gli strumenti chirurgici e gli strumenti necessari come descritto nel manoscritto. Al termine dei preparativi, trasferire il topo anestetizzato sul boccaglio situato in un'area separata dello spazio chirurgico e assicurarsi che i riflessi di astinenza sia corneale che pedale siano assenti prima di radere la pelliccia dall'area chirurgica. Quindi, rimuovere la pelliccia rasata dal mouse usando il lato appiccicoso del nastro chirurgico.
Quindi, posizionare il mouse sulla bilancia per registrare il peso pre-chirurgico. Quindi, utilizzare un batuffolo di cotone per applicare lubrificante per gli occhi e trasferire il topo e il boccaglio nell'area chirurgica. Per iniettare il tibiale anteriore, o muscolo TA, posizionare il mouse sulla schiena e allungare l'arto posteriore a 10 gradi dalla linea mediana.
Quando l'arto posteriore è nella posizione corretta, posizionare un nastro chirurgico sul piede. Sterilizzare l'area rasata utilizzando un etanolo al 70% o una soluzione equivalente. Aspirare il frammento atossico funzionante di tetano, neurotossina o soluzione di HcT in una micropipetta di vetro tirata.
Quindi, fai una piccola incisione sul muscolo di interesse nell'area che corrisponde alle regioni motorie e della piastra. Allora. perforare la fascia esterna sul muscolo per iniettare l'HcT. Lasciare la micropipetta in posizione per cinque-10 secondi prima di ritirarsi lentamente.
Dopo l'iniezione, chiudere le incisioni con uno o due punti. Quindi, trasferire il mouse in una gabbia di recupero isolata sotto osservazione per 30 minuti. Prepararsi a esporre il nervo sciatico disponendo gli strumenti chirurgici e gli strumenti intorno all'area chirurgica.
Creare un cuneo tagliando il parafilm in uno stretto rettangolo di larghezza di un centimetro con una punta angolata per facilitare il processo di imaging. Una volta terminati i preparativi, trasferire il mouse al boccaglio nell'area chirurgica e utilizzare il nastro chirurgico per fissare la testa al boccaglio. Estendere e fissare l'arto posteriore mirato a 45 gradi dalla linea mediana con nastro chirurgico.
Se i riflessi di astinenza corneale e del pedale sono assenti, tagliare la pelle sovrastante il nervo sciatico usando le forbici. Quindi, rimuovere il muscolo e la muscolatura o il tessuto connettivo del bicipite sovrastante femorale senza danneggiare il nervo sciatico e i vasi sanguigni. Quando il nervo sciatico intatto è sufficientemente esposto, applicare soluzione salina sterile preriscaldata nell'area intorno al nervo sciatico per prevenire l'essiccazione.
Quindi, utilizzare una pinza curva per interrompere il tessuto connettivo profondo e posizionare il cuneo parafilm pre-preparato sotto il nervo. Posizionare un batuffolo di cotone imbevuto di soluzione salina sull'area esposta prima di spostare il mouse sopra il tappetino termico nella camera di induzione piena di isoflurano e ossigeno. Per l'imaging, posizionare un vetro di copertura da 22 x 64 millimetri sullo stadio del microscopio personalizzato e fissare la posizione del vetro di copertura con un nastro.
Dopo aver applicato l'olio per immersione all'obiettivo, collegare lo stadio del microscopio al microscopio invertito e sollevare lentamente l'obiettivo immerso nell'olio per contattare il vetro di copertura. Quando la configurazione è pronta, fissare il boccaglio anestetico sul palco del microscopio usando del nastro adesivo. Quindi, rimuovere il batuffolo di cotone dal nervo sciatico e trasferire il mouse dalla camera di induzione al boccaglio con il nervo esposto rivolto verso il vetro di copertura.
Fissare la testa del topo al boccaglio e, pur mantenendo il livello più basso adeguato di anestesia, sollevare delicatamente il mouse per la coda per aggiungere soluzione salina sterile allo scivolamento di copertura vicino al nervo sciatico esposto. Con l'aiuto degli oculari, individuare il nervo sciatico per determinare il punto focale ottimale e selezionare un'area di interesse contenente organelli assonali mobili. Quindi, passa al software del computer facendo clic sul pulsante Acquisizione e selezionando un'area di interesse.
Usa lo zoom digitale per ottenere un ingrandimento di 80 volte e ruota l'area selezionata per visualizzare gli assoni orizzontalmente Fai clic sulla casella Regioni e seleziona una regione rettangolare di interesse. Nella modalità di acquisizione, impostate le dimensioni del fotogramma su un minimo di 1024 x 1024 pixel e iniziate l'acquisizione time lapse da 100 a 1.000 fotogrammi. Cattura un minimo di 10 carichi mobili dai tre assoni per topo.
Nello studio, l'etichettatura in vivo degli assoni specifici del motore è stata ottenuta utilizzando topi transgenici. La proteina di florescenza verde potenziata, o espressione di eGFP, negli assoni motori colinergici è stata osservata da un ChAT vivo anestetizzato. Mouse eGFP.
Con il metodo alternativo, l'espressione di tdTomato in un nervo appena asportato da un ChAT. tdTomato mouse è stato raggiunto senza ulteriore elaborazione tissutale. Inoltre, gli assoni sono stati identificati iniettando traccianti o marcatori come HcT o adenovirus che codificano eGFP nei muscoli scheletrici.
L'analisi rappresentativa dimostra una serie di immagini time lapse che rappresentano il trasporto assonale in vivo degli endosomi di segnalazione nei motoneuroni vivi di un HB9. Mouse GFP. Il GFP aveva un modello più granulare in HB9.
Assoni GFP. L'allevamento di Mito. Topi CFP con ChAT.
I topi tdTomato hanno permesso la visualizzazione dei mitocondri negli assoni motori. Inoltre, il Nodo di Ranvier potrebbe anche essere identificato. L'iniezione di HcT nei muscoli del Mito.
I topi CFP hanno permesso la visualizzazione simultanea di endosomi e mitocondri di segnalazione all'interno degli stessi assoni in vivo. Sono stati osservati organelli in movimento anterogrado e retrogrado, così come organelli in stallo. L'anestesia ridotta durante il processo di imaging è vantaggiosa perché può limitare l'impatto di grandi artefatti respiratori e quindi semplificare il tracciamento e l'analisi del trasporto assonale.
I nervi sciatici possono essere istruttivi per l'analisi dell'RNA e delle proteine per correlare la dinamica degli organelli con i componenti chiave del meccanismo di trasporto assonale, come le proteine motorie e gli adattatori specifici del carico.
