Gli autori riconoscono l'assistenza tecnica di Abigail Harris. Essi riconoscono anche Paula Cohen e Kim Holloway per aiutare ad ottimizzare il protocollo di preparazione di superficie-diffusione nuclei da spermatociti di mouse. Gli autori hanno anche apprezzano la lettura critica del manoscritto da Karen Schindler.
Questo lavoro è stato supportato da NIH R01 GM106262 a K.M.B.

Tutti i metodi che coinvolgono topi utilizzati alti standard etici e benessere e sono stati approvati dal comitato di uso al Drexel University College of Medicine e istituzionali Animal Care.
1. preparazione di soluzioni e strumenti necessari
<ol><li>Preparare il tampone di estrazione ipotonico (EB) in 50 mL di acqua ultrapura laboratorio grado, pH 8,2-8,4 (tabella 1). Rendono la soluzione fresco ogni volta, tenere sul ghiaccio ed utilizzare entro 2 h di preparazione spread; Ciò è necessario per ottimizzare la riduzione e la proteasi inibendo attività di DTT e PMSF, rispettivamente. Utilizzare 10 mL di EB per ogni coppia di testicoli del topo.</li>
	<li>Preparare una soluzione di saccarosio di 100mm (fresco ogni volta) aggiungendo 0,342 g di saccarosio a 10 mL di laboratorio ultrapura acqua di grado. Aggiustare il pH a 8.2</li>
	<li>Preparare soluzione fissante (1% paraformaldeide (PFA), 0,15% Triton X-100, pH regolato a 9,2 con 1 N HCl o NaOH N 1) mensile fresco e store è a temperatura ambiente al riparo dalla luce. Diluire un 16% commercialmente PFA partenza stock disponibile al 4% in 1X PBS per uso come un magazzino di lavoro e quindi memorizzare 4% aliquote a-20 ° C.<ol>
<li>Per preparare la soluzione fissante, aggiungere 10 mL di soluzione al 4% PFA e 600 µ l di 10% Triton X-100 a 30 mL di 1X PBS, mescolare bene e regolare il pH a 9,2 con 1 N HCl o NaOH N 1. Conservare la soluzione fissativa in una provetta conica da 50 mL avvolta nella carta stagnola a temperatura ambiente (per non più di 4 settimane).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparare soluzioni di lavaggio (mentre scivoli stanno asciugando gli ultimi 30 minuti) con 200 Photo-Flo: 0,4% Photo-Flo 200/PBS (320 µ l di Photo-Flo 200 in 80 mL di 1X PBS) e 0,4% Photo-Flo 200/dH2O (160 µ l di Photo-Flo 200 in 40 mL di acqua ultrapura laboratorio). Utilizzare una finestra di Coplin 50 mL riempita con 40 mL di soluzioni per lavare i vetrini 10 o meno in un momento.</li>
	<li>Preparare i seguenti strumenti: 1 paio di forbici chirurgiche (di incidere la pelle), 1 paio di forbici chirurgiche punta fine (di incidere il peritoneo), 2 paia di pinze a punta dritto fine (per sezionare ogni testicolo), 1 lama di rasoio regolo (di incidere ogni testicolo), 2 paia di punta forcipe (per immobilizzare ogni testicolo e spremere i tubuli seminiferi) curvo, barattoli di Coplin 50ml, Teflon stampato 3 anello scivoli, 1 bisturi con lama taglia 11, camera umidificata, 100 x 15 mm piastre Petri, pennarello a punta fine o una matita e un shaker a piattaforma rotante.<ol>
<li>Premium posto uncharged vetrino smerigliato fine diapositive di vetro in posizione verticale in una vaschetta di Coplin 50 mL riempita con soluzione fissante fino all'utilizzo. Nota: La matita è comodo se diapositive verranno successivamente utilizzate nelle procedure che richiedono di etanolo, come l'ibridazione in situ di fluorescenza.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. i nuclei di spermatocita diffusione
<ol><li>Eutanasia di un topo maschio secondo le linee guida istituzionali (ad es., dislocazione cervicale con o senza CO2 asfissia).</li>
	<li>Utilizzare P10 - P20 maschi per valutare meiotiche celle nella prima ondata della spermatogenesi; Utilizziamo abitualmente P15 - P17 maschi per ottenere cellule da tutti i sottostadi della Profase I. adulti testicoli fornirà cellule da Profase I troppo, ma anche essi produrranno più postmeiotiche cellule, quali spermatidi.</li>
	<li>Raccolto e pesare i testicoli (registrare i pesi associati); quindi inserirli in una piastra Petri contenente poche gocce di freddo HEB per tenerli umidi.</li>
	<li>Tenere testicolo contro il fondo del piatto con una pinza a punta ricurva e utilizzare una lama di rasoio regolo per fare un'incisione del midline verticale piccolo attraverso la capsula del testicolo. Mentre ancora in mano il testicolo contro il fondo del piatto con un forcipe, utilizzare un secondo set di pinze punta ricurva o lama di rasoio regolo per spremere delicatamente i tubuli seminiferi dal testicolo.<ol>
<li>Inserire i tubuli in una provetta conica da 15 mL contenente 10 mL di HEB freddo, avendo cura di evitare di mettere i pezzi della capsula nel tubo. Ripetere la procedura con il secondo testicolo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incubare i tubuli seminiferi decapsulato nel tubo conico contenente HEB in ghiaccio per 30-60 min, a seconda delle dimensioni dei testicoli. Incubare i tubuli seminiferi da un paio di testicoli pesa 30 mg o meno per 30 min, tubuli da un paio di testicoli pesatura 31 a 50 mg per 30-45 minuti e testicoli più grandi per 60 minuti. Non alterare i tempi per un solo testicolo. Nota: Il tempo di incubazione ottimali può variare a seconda dell'esperienza di sperimentatore, i reagenti utilizzati e i topi analizzati.</li>
	<li>Mentre i tubuli seminiferous sono incubando in EB, è possibile utilizzare un pennarello o una matita per etichettare le estremità glassate di vetrino diapositive con mouse numero, data e numero della diapositiva. Quindi è possibile porre i vetrini pre-puliti in una vaschetta di Coplin contenente la soluzione fissante.</li>
	<li>A seguito di incubazione, versare tubuli ed EB in una capsula Petri pulita e tubuli separate in circa ciuffi di diametro di 3 mm. Ogni ciuffo produce 2 scivoli e il numero di diapositive ha reso dipende dalla dimensione dei testicoli. Nota: Possiamo ottenere 8 scivoli da wild-type e 6 diapositive da subfertile Chtf18-null testicoli P16 (che sono più piccoli a causa di numeri in diminuzione delle cellule di germe meiotica e mitotica8). Un testicolo adulto pesa 100 mg o più dovrebbe produrre 16 vetrini.</li>
	<li>Posto 23 µ l di soluzione di saccarosio di 100 mM in un anello di Teflon stampato, 3 anello scorrevole e aggiungere un ciuffo di tubuli seminiferi sul ring.  Quindi usando curve suggerimento pinze per tenere il ciuffo, delicatamente tritare i tubuli con una lama di rasoio taglia 11 fino a quando la soluzione diventa torbida. Nota: Non overmince come questo si tradurrà in cromosomi frammentati. Si noti che cromosomi frammentati potrebbero anche essere indicativi di un fenotipo mutante.</li>
	<li>Rimuovere i detriti, aggiungere un altro 23 µ l di soluzione di saccarosio e utilizzare una micropipetta delicatamente dispensazione la miscela su e giù un paio di volte per aiutare a separare le cellule in sospensione.</li>
	<li>Rimuovere un vetrino ammollo nel Vaso Coplin contenente soluzione fissante e inclinare la diapositiva sopra il vaso, in modo che una gocciolina generosa raccoglie nell'angolo inferiore della diapositiva.<ol>
<li>Pipettare 20 µ l di sospensione cellulare saccarosio dall'anello della diapositiva stampata 3 anello Teflon in fissativa gocciolina su un premio glassato di vetrino e dispensare la sospensione su e giù per 2 - 3 volte. Nota: La goccia fissativa deve essere abbastanza grande nel volume affinché aggiunta di 20 μL della sospensione delle cellule di saccarosio ad esso permette la copertura attraverso l'intera diapositiva quando la miscela è diffuso (Vedi 2.11 qui sotto).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lentamente inclinare la diapositiva al lato opposto la goccia per diffondere la sospensione cellulare lungo la lunghezza della diapositiva. Poi lentamente inclinare la diapositiva torna a diffondere la sospensione cellulare lungo la larghezza della diapositiva per coprirlo completamente. Evitare di diffondere la sospensione sulla stessa area della diapositiva più di una volta altrimenti che le celle si sovrappongono tra loro.</li>
	<li>Immediatamente porre il vetrino in una camera umidificata e ripetere i passaggi da 2.8 a 2.11 fino a quando tutti i grumi di tubuli seminiferi sono stati utilizzati per rendere diapositive. È importante non spostare la camera umidificata durante il processo di essiccazione per evitare lo strappo e la sovrapposizione di cellule.</li>
	<li>Lasciare i vetrini Incubare in una camera umidificata coperta a temperatura ambiente per 2,5 h in modo che si asciugano lentamente e non completamente. Umidità elevata e lenta essiccazione in questo passaggio sono importanti per garantire un'adeguata diffusione della cromatina. Quindi rimuovere il coperchio dell'alloggiamento e vetrini asciugare completamente altri 30 min.</li>
	<li>Mettere i vetrini (retro o in un modello di zigzag) in una vaschetta di Coplin contenente 0,4% di soluzione di Photo-Flo 200/1 X PBS e lavare i vetrini due volte, 5 minuti ciascuno, agitando delicatamente la Coplin jar su una piattaforma rotante shaker. Utilizzare la soluzione fresca per ogni lavaggio e mantenere diapositive da diversi topi in vasi separati per ciascuno dei lavaggi.</li>
	<li>Lavare i vetrini in una vaschetta di Coplin contenenti 0,4% Photo-Flo 200/dH2O soluzione per 5 min una volta durante l'agitazione.</li>
	<li>Rimuovere diapositive dal Coplin jar (ultimo lavaggio), accuratamente pulire i bordi e le parti inferiori delle diapositive per eliminare il liquido in eccesso e mettere i vetrini in una posizione angolata, quasi-montante ad asciugare. Uno sperimentatore che è abile in questa tecnica può elaborare e preparare i nuclei superficie-diffusione dai topi di 4 o 5 in un giorno.</li>
	<li>Una volta asciutto (15-20 min), processo diapositive immediatamente per immunofluorescenza o conservare a-80 ° C in una scatola di diapositive ben chiuso al riparo dalla luce per un massimo di 3 settimane (a seconda delle proteine bersaglio valutandi; risultati ottimali possono essere ottenuti se macchiato lo stesso giorno o entro 2 settimane).<ol>
<li>Se conservati a-80 ° C, quindi lasciare vetrini a temperatura ambiente e lavare in una vaschetta di Coplin contenente 1 X PBS o blocco per 5 min prima della colorazione. Nota: Molti protocolli di colorazione di immunofluorescenza diversi fornirà buoni risultati; per un protocollo di immunostaining8, fare riferimento a Berkowitz et al.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Handel, M. A., Schimenti, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+mammalian+meiosis:+regulation,+dynamics+and+impact+on+fertility.">Genetics of mammalian meiosis: regulation, dynamics and impact on fertility.</a> Nat Rev Genet. 11, 124-136 (2010).</li><li>Peters, A. H., Plug, A. W., van Vugt, M. J., de Boer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+drying-down+technique+for+the+spreading+of+mammalian+meiocytes+from+the+male+and+female+germline.">A drying-down technique for the spreading of mammalian meiocytes from the male and female germline.</a> Chromosome Res. 5, 66-68 (1997).</li><li>Counce, S. J., Meyer, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+the+synaptonemal+complex+and+the+kinetochore+in+Locusta+spermatocytes+studied+by+whole+mount+electron+microscopy.">Differentiation of the synaptonemal complex and the kinetochore in Locusta spermatocytes studied by whole mount electron microscopy.</a> Chromosoma. 44, 231-253 (1973).</li><li>Speed, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiosis+in+the+foetal+mouse+ovary.+I.+An+analysis+at+the+light+microscope+level+using+surface-spreading.">Meiosis in the foetal mouse ovary. I. An analysis at the light microscope level using surface-spreading.</a> Chromosoma. 85, 427-437 (1982).</li><li>Ashley, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+changes+in+Rad51+distribution+on+chromatin+during+meiosis+in+male+and+female+vertebrates.">Dynamic changes in Rad51 distribution on chromatin during meiosis in male and female vertebrates.</a> Chromosoma. 104, 19-28 (1995).</li><li>Baker, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+mouse+mLh1+in+DNA+mismatch+repair+and+meiotic+crossing+over.">Involvement of mouse mLh1 in DNA mismatch repair and meiotic crossing over.</a> Nat Genet. 13, 336-342 (1996).</li><li>Plug, A. W., Xu, J., Reddy, G., Golub, E. I., Ashley, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+association+of+Rad51+protein+with+selected+sites+in+meiotic+chromatin.">Presynaptic association of Rad51 protein with selected sites in meiotic chromatin.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 5920-5924 (1996).</li><li>Berkowitz, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+CHTF18+causes+defective+meiotic+recombination+in+male+mice.">Disruption of CHTF18 causes defective meiotic recombination in male mice.</a> PLoS Genet. 8, e1002996 (2012).</li><li>Gomez, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sororin+loads+to+the+synaptonemal+complex+central+region+independently+of+meiotic+cohesin+complexes.">Sororin loads to the synaptonemal complex central region independently of meiotic cohesin complexes.</a> EMBO Rep. 17, 695-707 (2016).</li><li>Brooker, A. S., Berkowitz, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+roles+of+cohesins+in+mitosis,+meiosis,+and+human+health+and+disease.">The roles of cohesins in mitosis, meiosis, and human health and disease.</a> Methods Mol Biol. 1170, 229-266 (2014).</li><li>McNicoll, F., Stevense, M., Jessberger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cohesin+in+gametogenesis.">Cohesin in gametogenesis.</a> Curr Top Dev Biol. 102, 1-34 (2013).</li><li>Rankin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+elaboration:+making+sense+of+meiotic+cohesin+dynamics.">Complex elaboration: making sense of meiotic cohesin dynamics.</a> FEBS J. 282, 2426-2443 (2015).</li><li>Holloway, J. K., Sun, X., Yokoo, R., Villeneuve, A. M., Cohen, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+CNTD1+is+critical+for+meiotic+crossover+maturation+and+deselection+of+excess+precrossover+sites.">Mammalian CNTD1 is critical for meiotic crossover maturation and deselection of excess precrossover sites.</a> J Cell Biol. 205, 633-641 (2014).</li><li>La Salle, S., Sun, F., Handel, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+short-term+culture+of+mouse+spermatocytes+for+analysis+of+meiosis.">Isolation and short-term culture of mouse spermatocytes for analysis of meiosis.</a> Methods Mol Biol. 558, 279-297 (2009).</li><li>Wiltshire, T., Park, C., Caldwell, K. A., Handel, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+premature+G2/M-phase+transition+in+pachytene+spermatocytes+includes+events+unique+to+meiosis.">Induced premature G2/M-phase transition in pachytene spermatocytes includes events unique to meiosis.</a> Dev Biol. 169, 557-567 (1995).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Per ottenere un numero elevato di nuclei spermatocita ben diffusa, di buona qualità, le fasi più critiche del presente protocollo includono il tempo di incubazione appropriato dei tubuli seminiferi in EB, appropriata macinazione dei tubuli seminiferi, e la tecnica impiegata per si sono diffuse la sospensione cellulare di saccarosio attraverso le diapositive rivestite con fissativa. Noi incubare tubuli seminiferi dai testicoli dei maschi di tipo selvaggio che vanno da postnatale giorno 15 all'età adulta in EB per 45 mi...

Topi sono utilizzati estesamente come organismo modello per lo studio di meiosi nei mammiferi. Possono essere valutati sia i normali processi di sviluppo e difetti che si verificano durante la meiosi. La linea temporale e la progressione delle caratteristiche salienti che si verificano durante la profase I e sottostadi, come pure una moltitudine di specifiche proteine coinvolte in processi cruciali per la regolazione della meiosi può essere caratterizzati in wild type e topi mutanti. Diversi processi specializzati che si verificano durante la meiosi che ho posso essere studiato in dettaglio (rivisto in Handel e Schimenti1). Questi includono la formazione di rotture a doppio filamento (DSB) del DNA e riparazione, ricombinazione, la formazione di Complesso Sinaptonemale e segregazione del cromosoma.
Un aspetto importante di studiare processi meiotici è la capacità di esaminare i nuclei contenenti cromosomi omologhi sono risolti, visivamente e otticamente, per meglio distinguono e identificano i sottostadi della profase I. profase è composto da 5 sottostadi che sono caratterizzati da specifiche caratteristiche tra cui la formazione del complesso synaptonemal (SC). Lo SC è un'impalcatura di proteina tripartita che consente l'accoppiamento e la riparazione di rotture a doppio filamento del DNA degli omologhi. Durante leptonema, omologhi allineare come gli elementi assiali di SC sono fissati. Quindi allegato di elementi centrali del complesso synaptonemal durante zygonema facilita la connessione fisica e accoppiamento (sinapsi) tra coppie di omologhi di. Durante pachynema, sinapsi degli omologhi diventa completo e crossover di DNA sono formate dalla riparazione di una popolazione di seleziona delle rotture del doppio filamento di DNA tramite ricombinazione omologa. La SC Disassembla durante diplonema, permettendo per omologhi di desynapse ma rimangono attaccati ai loro centromeri ed ai luoghi dei crossover di DNA. Infine durante diacinesi, omologhi ricondenseranno e si verifica la transizione alla metafase1.
Storicamente, superficie-diffusione della cromatina meiotica ha reso alcuni nuclei, particolarmente quelle dalle prime fasi della Profase I2. Di conseguenza, questi metodi sono stati modificati per migliorare la separazione delle cellule dai tessuti (cioè testicolo o dell'ovaio), la tecnica di diffusione della cromatina meiotica e la resa dei nuclei meiotic di alta qualità per valutazione2,3, 4. Inoltre, questo metodo si è rivelato utile nel preservare nucleare e cromatina associata proteine nei nuclei meiotici, come dimostrato da immunolocalizzazione pubblicati tecniche5,6,7. Di conseguenza, il metodo inizialmente descritto da Peters2 e dimostrato qui rese molti nuclei di spermatocita scoppio separata contenente gli omologhi che subiscono i sottostadi leptotene, zigotene, pachitene, diplotene e diacinesi della Profase I.
La tecnica della preparazione di superficie-diffusione nuclei (chiamati anche analisi di diffusione della cromatina) è ampiamente usata per lo studio di meiosi nei campi della biologia riproduttiva e cella. Diapositive che contengono i nuclei superficie-diffusione possono essere successivamente immunostained con gli anticorpi alle proteine di interesse o sottoposti a macchiatura d'argento e poi analizzati con microscopia. Il metodo è simile per i topi maschi e femminili, anche se le modifiche sono state descritte per topi femmina2. È fondamentale non overmince tubuli seminiferi. I nuclei devono anche essere ben distribuiti affinché seguendo immunostaining omologhi e proteine associate sono chiaramente visibili con la microscopia. Superficie-diffusione nuclei possono essere preparati in poche ore ed entrambi immunostained immediatamente o conservati a-80 ° C per un massimo di 3 settimane prima di scongelamento e immunostaining. Tuttavia, risultati ottimali si ottengono migliori per alcune proteine se immunostaining viene eseguita immediatamente o entro 2 settimane di preparazione di superficie-diffusione nuclei. I vetrini possono essere immunostained con un protocollo standard usando gli anticorpi alle proteine di interesse, seguita da incubazione con gli anticorpi secondari coniugati a fluorescente proteine o coloranti, allora imaged con microscopia di fluorescenza8. Al giorno postnatale 15-21 c'è tessuto sufficiente per ogni coppia di tipo selvaggio testicoli per produrre 6-10 diapositive e più vecchi topi (compresi gli adulti) produrrà più diapositive. Tuttavia, topi wild type 6 settimane di età ed oltre anche resa più post-meiotiche cellule (cioè spermatidi) sui vetrini seguendo immunostaining. Inoltre, tutti i sottostadi della profase io posso essere osservato in topi giovanili e adulti. Testicoli da maschi a giorni postnatali 10 a 15 produrrà molti più cellule leptotene e zigotene. Topi oltre postnatale giorno 14 a 15 anni di età produrrà più nuclei di pachitene e diplotene.
Qui descriviamo e dimostrare un metodo ampiamente usato della preparazione di superficie-diffusione nuclei da spermatociti di mouse.

<table><tbody><tr><td>Photo-Flo 200</td><td>Kodak</td><td>1464510</td><td></td></tr><tr><td>16% Paraformaldehyde (formaldehyde aqueous solution)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>RT 15710</td><td>Dilute 16% solution into 4% working stocks with 1X PBS and freeze aliquots at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Teflon printed 3 ring slides</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>63418-11</td><td></td></tr><tr><td>Premium uncharged frosted end glass slides</td><td>Several commercial brands</td><td></td><td>Clean slides in ethyl or isopropyl alcohol and allow to drip dry prior to use; label slides on frosted end with a permanent marker or pencil depending on subsequent use of slides</td></tr><tr><td>Surgical scissors (sharp and blunt tips)</td><td>Fine Science Tools</td><td>14001-12</td><td>Different brand of a similar type will work</td></tr><tr><td>Fine tip surgical scissors (sharp tips)</td><td>Fine Science Tools</td><td>14058-11</td><td>Different brand of a similar type will work</td></tr><tr><td>Straight fine tip forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11050-10</td><td>Different brand of a similar type will work</td></tr><tr><td>Curved medium tip forceps</td><td>Fisher</td><td>16100110</td><td>Different brand of a similar type will work</td></tr><tr><td>Scalpel handle</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td>Different brand of a similar type will work</td></tr><tr><td>Mouse anti-SYCP3</td><td>Abcam</td><td>ab97672</td><td>Use at 1:300</td></tr><tr><td>Anti-centromere protein (derived from human CREST patient serum)</td><td>Antibodies Incorporated</td><td>15-234-0001</td><td>Use at 1:50</td></tr><tr><td>Humidified chamber</td><td></td><td></td><td>We use Nunc square culture dishes 500 cm2/well with moistened paper towels</td></tr><tr><td>Widefield microscope with epifluorescence</td><td>Leica microsystems</td><td></td><td>Any standard model</td></tr><tr><td>Coplin jars</td><td>Several commercial brands</td><td></td><td>50 ml capacity; 40 mm (1.6 in.) diameter, holds 10 slides (back to back)</td></tr><tr><td>Petri dishes</td><td>Several commercial brands</td><td></td><td>100 x 15 mm diameter, polystyrene sterile untreated</td></tr></tbody></table>

preparation of meiotic chromosome spreads from mouse spermatocytes

Meiosi nei mammiferi sono un processo di sviluppo dinamico che si verifica nelle cellule germinali e possa essere studiato e caratterizzato. Utilizzando un metodo per diffondere i nuclei sulla superficie delle diapositive (piuttosto che farli cadere da un'altezza), dimostriamo una tecnica ottimizzata su spermatociti del mouse che è stato descritto nel 1997. Questo metodo è ampiamente usato nei laboratori per lo studio dei mammiferi meiosi perché produce una pletora di nuclei di alta qualità in fase di sottostadi della profase I. seminiferi tubuli si inserisce in una soluzione ipotonica a gonfiarsi spermatociti. Poi spermatociti vengono rilasciati in una soluzione di saccarosio per creare una sospensione cellulare e i nuclei sono sparsi su vetrini imbevuta di fissativo. A seguito di immunostaining, può essere esaminata una diversità delle proteine attinente a processi meiotici. Ad esempio, proteine del complesso synaptonemal, una struttura tripartita che collega i cromosoma assi e nuclei degli omologhi insieme possono essere facilmente visualizzate. Proteine di ricombinazione meiotic, che sono coinvolti nella riparazione di rotture a doppio filamento del DNA tramite la ricombinazione omologa, possono anche essere immunostained per valutare la progressione della Profase I. Qui descriviamo e dimostrare dettagliatamente una tecnica ampiamente utilizzata per lo studio dei mammiferi meiosi in spermatociti da topo maschio giovanile o adulta.

La capacità di questo metodo per fornire un numero elevato di superficie sviluppa nuclei che contengono gli omologhi intatti dipende da tre fattori principali: 1) tempo di incubazione appropriato di tubuli seminiferi in buffer ipotonico (cioè EB) per ottenere adeguatamente si gonfiò spermatocita i nuclei che scoppiano ma non si disintegrano da prolungata incubazione in EB, 2) micropipetting le goccioline di saccarosio di cellule per ottenere una sospensione separata dei nuclei che non ...

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Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Mouse Spermatocytes

Meiosi sono il processo di sviluppo da cui i gameti sono formate attraverso un singolo ciclo di replicazione del DNA e due successivi turni di segregazione del cromosoma. Meiosi mammiferi possono essere esaminate utilizzando una tecnica per preparare cromosomici meiotica. Qui, noi dimostrare un metodo di preparazione di superficie-diffusione nuclei da spermatociti di mouse.

Preparazione del cromosoma meiotico si diffonde da Mouse spermatociti

Mammalian meiosis is a dynamic developmental process that occurs in germ cells and can be studied and characterized. Using a method to spread nuclei on ...

preparation-of-meiotic-chromosome-spreads-from-mouse-spermatocytes

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Step-specific Sorting of Mouse Spermatids by Flow Cytometry

The differentiation of mouse spermatids is one critical process for the production of a functional male gamete with an intact genome to be transmitted to the next generation. So far, molecular studies of this morphological transition have been hampered by the lack of a method allowing adequate separation of these important steps of spermatid differentiation for subsequent analyses. Earlier attempts at proper gating of these cells using flow cytometry may have been difficult because of a peculiar increase in DNA fluorescence in spermatids undergoing chromatin remodeling. Based on this observation, we provide details of a simple flow cytometry scheme, allowing reproducible purification of four populations of mouse spermatids fixed with ethanol, each representing a different state in the nuclear remodeling process. Population enrichment is confirmed using step-specific markers and morphological criterions. The purified spermatids can be used for genomic and proteomic analyses.

We describe a sorting strategy for mouse spermatids using flow cytometry. Spermatids are sorted into four highly pure populations, including round (spermiogenesis steps 1-9), early elongating (spermiogenesis steps 10-12), late elongating (spermiogenesis steps 13-14) and elongated spermatids (spermiogenesis steps 15-16). DNA staining, size and granulosity are used as selection parameters.

Specifiche Step-ordinamento di mouse spermatidi mediante citometria di flusso

The differentiation of mouse spermatids is one critical process for the production of a functional male gamete with an intact genome to be transmitted to ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Chromatin Spread Preparations for the Analysis of Mouse Oocyte Progression from Prophase to Metaphase II

Chromatin spread techniques have been widely used to assess the dynamic localization of various proteins during gametogenesis, particularly for spermatogenesis. These techniques allow for visualization of protein and DNA localization patterns during meiotic events such as homologous chromosome pairing, synapsis and DNA repair. While a few protocols have been described in the literature, general chromatin spread techniques using mammalian prophase oocytes are limited and difficult due to the timing of meiosis initiation in fetal ovaries. In comparison, prophase spermatocytes can be collected from juvenile male mice with higher yields without the need for microdissection. However, it is difficult to obtain a pure synchronized population of cells at specific stages due to the heterogeneity of meiotic and post-meiotic germ cell populations in the juvenile and adult testis. For later stages of meiosis, it is advantageous to assess oocytes undergoing meiosis I (MI) or meiosis II (MII), because groups of mature oocytes can be collected from adult female mice and stimulated to resume meiosis in culture. Here, methods for meiotic chromatin spread preparations using oocytes dissected from fetal, neonatal and adult ovaries are described with accompanying video demonstrations. Chromosome missegregation events in mammalian oocytes are frequent, particularly during MI. These techniques can be used to assess and characterize the effects of different mutations or environmental exposures during various stages of oogenesis. As there are distinct differences between oogenesis and spermatogenesis, the techniques described within are invaluable to increase our understanding of mammalian oogenesis and the sexually dimorphic features of chromosome and protein dynamics during meiosis.

Oogenesis in mammals is known to be error-prone, particularly due to chromosome missegregation. This manuscript describes chromatin spread preparation methods for mouse prophase, metaphase I and II-staged oocytes. These fundamental techniques allow for the study of chromatin-bound proteins and chromosome morphology throughout mammalian oogenesis.

Cromatina diffusa i preparativi per l'analisi della progressione di ovocita Mouse dalla profase alla metafase II

Chromatin spread techniques have been widely used to assess the dynamic localization of various proteins during gametogenesis, particularly for ...

Genetica

Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Zebrafish Spermatocytes

Meiosis is the key cellular process required to create haploid gametes for sexual reproduction. Model organisms have been instrumental in understanding the chromosome events that take place during meiotic prophase, including the pairing, synapsis, and recombination events that ensure proper chromosome segregation. While the mouse has been an important model for understanding the molecular mechanisms underlying these processes, not all meiotic events in this system are analogous to human meiosis. We recently demonstrated the exciting potential of the zebrafish as a model of human spermatogenesis. Here we describe, in detail, our methods to visualize meiotic chromosomes and associated proteins in chromosome spread preparations. These preparations have the advantage of allowing high resolution analysis of chromosome structures. First, we describe the procedure for dissecting testes from adult zebrafish, followed by cell dissociation, lysis, and spreading of the chromosomes. Next, we describe the procedure for detecting the localization of meiotic chromosome proteins, by immunofluorescence detection, and nucleic acid sequences, by fluorescence in situ hybridization (FISH). These techniques comprise a useful set of tools for the cytological analysis of meiotic chromatin architecture in the zebrafish system. Researchers in the zebrafish community should be able to quickly master these techniques and incorporate them into their standard analyses of reproductive function.

Nuclear surface spreads are an indispensable tool for studying chromosome events during meiosis. Here we demonstrate a method to prepare and visualize meiotic chromosomes during prophase I from zebrafish spermatocytes.

Preparazione delle scime cromosomiche meiotiche da Spermatociti di pesce zebra

Meiosis is the key cellular process required to create haploid gametes for sexual reproduction. Model organisms have been instrumental in understanding ...

A Seminiferous Tubule Squash Technique for the Cytological Analysis of Spermatogenesis Using the Mouse Model

Meiotic progression in males is a process that requires the concerted action of a number of highly regulated cellular events. Errors occurring during meiosis can lead to infertility, pregnancy loss or genetic defects. Commencing at the onset of puberty and continuing throughout adulthood, continuous semi-synchronous waves of spermatocytes undergo spermatogenesis and ultimately form haploid sperm. The first wave of mouse spermatocytes undergoing meiotic initiation appear at day 10 post-partum (10 dpp) and are released into the lumen of seminiferous tubules as mature sperm at 35 dpp. Therefore, it is advantageous to utilize mice within this developmental time-window in order to obtain highly enriched populations of interest. Analysis of rare cell stages is more difficult in older mice due to the contribution of successive spermatogenic waves, which increase the diversity of the cellular populations within the tubules. The method described here is an easily implemented technique for the cytological evaluation of the cells found within the seminiferous tubules of mice, including spermatogonia, spermatocytes, and spermatids. The tubule squash technique maintains the integrity of isolated male germ cells and allows examination of cellular structures that are not easily visualized with other techniques. To demonstrate the possible applications of this tubule squash technique, spindle assembly was monitored in spermatocytes progressing through the prophase to metaphase I transition (G2/MI transition). In addition, centrosome duplication, meiotic sex chromosome inactivation (MSCI), and chromosome bouquet formation were assessed as examples of the cytological structures that can be observed using this tubule squash method. This technique can be used to pinpoint specific defects during spermatogenesis that are caused by mutation or exogenous perturbation, and thus, contributes to our molecular understanding of spermatogenesis.

The goal of this tubule squash technique is to rapidly assess cytological features of developing mouse spermatocytes while preserving cellular integrity. This method allows for the study of all stages of spermatogenesis, and can be easily implemented alongside other biochemical and molecular biological approaches for the study of mouse meiosis.

Una tecnica di Squash tubulo seminifero per l'analisi citologica della spermatogenesi utilizzando il modello di Mouse

Meiotic progression in males is a process that requires the concerted action of a number of highly regulated cellular events. Errors occurring during ...

Chromosomal Spread Preparation of Human Embryonic Stem Cells for Karyotyping

Although human embryonic stem cells (hESC) have been shown to present a stable diploid karyotype 1, many studies have reported that depending on culture conditions they become prone to acquire chromosomal anomalies such as addition of whole or parts of chromosomes. Indeed, during long-term culture, karyotypic alterations are observed when enzymatic or chemical dissociation are used 2,3,4, while manual dissection of colonies for passaging retains a stable karyotype 5. Besides, changes in the environment such as the removal of feeder cells also seem to compromise the genetic integrity of hESC 3,6. Once chromosomal alterations could affect cellular physiology, the characterization of the genetic integrity of hESC in vitro is crucial considering hESC as an essential tool in embryogenesis studies and drug testing. Furthermore, for future therapeutic purposes chromosomal changes are a real concern as it is frequently associated to carcinogenesis.
Here we show a simple and useful method to obtain high quality chromosome spreads for subsequent analysis of chromosome set by G-banding, FISH, SKY or CGH techniques 7,8. We recommend checking the chromosomal status routinely with intervals of 5 passages in order to monitor the appearance of translocations and aneuploidies
Priscila Britto and Rafaela Sartore contributed equally to the paper.

Karyotyping is a simple and useful technique widely used for detecting genetic alterations. Here we describe a step by step protocol for chromosome spread preparation of human embryonic stem cells for monitoring the chromosomal status of these cells maintained in culture.

Preparazione Stendere cromosomiche di cellule staminali embrionali umane per cariotipo

Although human embryonic stem cells (hESC) have been shown to present a stable diploid karyotype 1, many studies have reported that depending on culture ...

Biologia

Enrichment of Pachytene Spermatocytes and Spermatids from Mouse Testes Using Standard Laboratory Equipment

To characterize each step of spermatogenesis, researchers must separate different subpopulations of germ cells from testes. However, isolating discrete populations is challenging, because the adult testis contains a complex mix of germ cells from all steps of spermatogenesis along with certain populations of somatic cells. Over the past few decades, different techniques such as centrifugal elutriation, fluorescence-activated cell sorting (FACS), and STA-PUT have been successfully applied to the isolation of germ cells. A drawback is that they all require dedicated devices and specialized training. Following principles underlying the STA-PUT method, a simple protocol has been developed for the isolation of pachytene spermatocytes, round spermatids, and elongating spermatids from mouse testes. After preparing a single cell suspension of testicular cells, specific cell populations are enriched by gravity sedimentation through a discontinuous bovine serum albumin (BSA) density gradient. The cell fractions are then manually collected and microscopically analysed. This modified density gradient for round spermatids (MDR) sedimentation protocol can be widely applied, because it requires only standard laboratory equipment. Furthermore, the protocol requires minimal starting materials, reducing its cost and use of laboratory animals.

Presented here is a protocol for enriching pachytene spermatocytes, round spermatids, and elongating spermatids from adult mouse testes using a discontinuous bovine serum albumin density gradient with standard laboratory equipment.

Arricchimento di spermatociti pachytene e Spermatidi da test del mouse utilizzando attrezzature di laboratorio standard

To characterize each step of spermatogenesis, researchers must separate different subpopulations of germ cells from testes. However, isolating discrete ...

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with development, tissue homeostasis, and disease processes. Drosophila spermatocytes undergoing meiosis are ideal for this analysis because (1) whole Drosophila testes containing spermatocytes are relatively easy to prepare for microscopy, (2) the spermatocytes&#8217; large size makes them well suited for high resolution imaging, and (3) powerful Drosophila genetic tools can be integrated with in vivo analysis. Here, we present a readily accessible protocol for the preparation of whole testes from Drosophila third instar larvae and early pupae. We describe how to identify meiotic spermatocytes in prepared whole testes and how to image them live by time-lapse microscopy. Protocols for fixation and immunostaining whole testes are also provided. The use of larval testes has several advantages over available protocols that use adult testes for spermatocyte analysis. Most importantly, larval testes are smaller and less crowded with cells than adult testes, and this greatly facilitates high resolution imaging of spermatocytes. To demonstrate these advantages and the applications of the protocols, we present results showing the redistribution of the endoplasmic reticulum with respect to spindle microtubules during cell division in a single spermatocyte imaged by time-lapse confocal microscopy. The protocols can be combined with expression of any number of fluorescently tagged proteins or organelle markers, as well as gene mutations and other genetic tools, making this approach especially powerful for analysis of cell division mechanisms in the physiological context of whole tissues and organs.

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

The goal of this protocol is to analyze cell division in intact tissue by live and fixed cell microscopy using Drosophila meiotic spermatocytes. The protocol demonstrates how to isolate whole, intact testes from Drosophila larvae and early pupae, and how to process and mount them for microscopy.

Preparazione dei test di Drosophila Larval e Pupal per l'analisi della divisione cellulare in live, tessuto intatto

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with ...

Isolation of Murine Spermatogenic Cells using a Violet-Excited Cell-Permeable DNA Binding Dye

Isolation of meiotic spermatocytes is essential to investigate molecular mechanisms underlying meiosis and spermatogenesis. Although there are established cell isolation protocols using Hoechst 33342 staining in combination with fluorescence-activated cell sorting, it requires cell sorters equipped with an ultraviolet laser. Here we describe a cell isolation protocol using the DyeCycle Violet (DCV) stain, a low cytotoxicity DNA binding dye structurally similar to Hoechst 33342. DCV can be excited by both ultraviolet and violet lasers, which improves the flexibility of equipment choice, including a cell sorter not equipped with an ultraviolet laser. Using this protocol, one can isolate three live-cell subpopulations in meiotic prophase I, including leptotene/zygotene, pachytene, and diplotene spermatocytes, as well as post-meiotic round spermatids. We also describe a protocol to prepare single-cell suspension from mouse testes. Overall, the procedure requires a short time to complete (4-5 hours depending on the number of needed cells), which facilitates many downstream applications.

Here we present a simple and efficient method to isolate live meiotic and post-meiotic germ cells from adult mouse testes. Using a low-cytotoxicity, violet-excited DNA binding dye and fluorescence-activated cell sorting, one can isolate highly enriched spermatogenic cell populations for many downstream applications.

Isolamento delle cellule spermatogeniche murine utilizzando un colorante legante del DNA permeabile alle cellule violetto

Isolation of meiotic spermatocytes is essential to investigate molecular mechanisms underlying meiosis and spermatogenesis. Although there are established ...

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the unique differentiation programs that are manifest during meiosis. Two principal methods have been developed to purify, to varying degrees, various meiotic fractions from both adult and immature animals: elutriation or Staput (sedimentation) using BSA and/or percoll gradients. Both of these methods rely on cell size and density to separate meiotic cells1-5. Overall, except for few cell populations6, these protocols fail to yield sufficient purity of the numerous meiotic cell populations that are necessary for detailed molecular analyses. Moreover, with such methods usually one type of meiotic cells can be purified at a given time, which adds an extra level of complexity regarding the reproducibility and homogeneity when comparing meiotic cell samples.
Here, we describe a refined method that allows one to easily visualize, identify, and purify meiotic cells, from germ cells to round spermatids, using FACS combined with Hoechst 33342 staining7,8. This method provides an overall snapshot of the entire meiotic process and allows one to highly purify viable cells from most stage of meiosis. These purified cells can then be analyzed in detail for molecular changes that accompany progression through meiosis, for example changes in gene expression9,10and the dynamics of nucleosome occupancy at hotspots of meiotic recombination11.

An efficient method to obtain highly purified viable meiotic fractions from mouse testis is described, which combines a refined cell dissociation protocol with fluorescent activated cell sorting (FACS). This method takes advantage of differences in the DNA content and nuclear density of discrete meiotic fractions.

Purificazione Citometria a flusso di cellule di topo Meiotic

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

<meta charset="utf8"></head><body>Procedura di iniezione di spermatidi rotondi murini per studiare lo sviluppo embrionale

Mouse Round Spermatid Injection

Round spermatids, characterized by their haploid genetic content, represent the precursor cells to mature spermatozoa. Through the innovative technique of round spermatid injection (ROSI), oocytes can be successfully fertilized and developed into viable fetuses. In a groundbreaking milestone achieved in 1995, the first mouse fetus was born through ROSI technology. ROSI has since emerged as a pivotal tool for unraveling the intricate mechanisms governing embryonic development and holds significant potential in various applications, including the acceleration of mouse generation and the production of genetically modified mice. In 1996, a milestone was reached when the first human fetus was born through ROSI technology. However, the clinical applications of this method have shown a fluctuating pattern of success and failure. To date, ROSI technology has not found widespread application in clinical practice, primarily due to its low birth efficiency and insufficient validation of fetal safety. This article provides a comprehensive account of the precise methods of performing ROSI in mice, aiming to shed new light on basic research and its potential clinical applications.

<meta charset="utf8"></head><body>Iniezione di spermatide rotondo di topo

Here, we introduce a method for performing round spermatid injection (ROSI) in mice, a technique with promising clinical applications and utility for investigating the mechanisms underlying embryonic development.

Iniezione di spermatide rotondo di topo

Round spermatids, characterized by their haploid genetic content, represent the precursor cells to mature spermatozoa. Through the innovative technique of ...