Name: preparation of meiotic chromosome spreads from mouse spermatocytes
Uploaded: 2017-11-22T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 38 s
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Die Autoren erkennen die technische Unterstützung von Abigail Harris. Sie erkennen auch Paula Cohen und Kim Holloway für die Hilfe, das Protokoll der Oberfläche verbreitet Kerne aus Maus Spermatozyten Vorbereitung zu optimieren. Die Autoren schätzen auch kritische Lektüre des Manuskripts von Karen Schindler.
Diese Arbeit wurde von NIH R01 GM106262, K.M.B unterstützt.

Alle Methoden, bei denen Mäuse genutzt hohe ethische und Tierschutzstandards und wurden durch die institutionelle Animal Care and Use Committee am Drexel University College of Medicine genehmigt.
1. Vorbereitung der Lösungen und Instrumente
<ol><li>Bereiten Sie hypotone Extraktion Puffer (HEB) in 50 mL Reinstwasser Labor Grad Wasser, pH 8,2-8,4 (Tabelle 1). Stellen Sie die Lösung frisch jedes Mal halten Sie auf dem Eis, und innerhalb von 2 h breitet sich vorzubereiten; Dies ist notwendig, die Reduzierung und Protease hemmende Aktivitäten von DVB-t und PMSF, bzw. zu optimieren. Verwenden Sie 10 mL HEB für jedes Paar der Maus Hoden.</li>
	<li>Bereiten Sie eine 100 mM-Zuckerlösung (frisch jedes Mal) durch Zugabe von 0,342 g Saccharose, 10 mL von hochreinen Labor Grad Wasser. Stellen Sie den pH-Wert auf 8.2</li>
	<li>Bereiten Sie Fixativ Lösung (1 % Paraformaldehyd (PFA), 0,15 % Triton x-100, pH 9.2 mit 1 N HCl oder 1 N NaOH angepasst) frische Monats- und laden es bei Raumtemperatur vor Licht geschützt. Verdünnen Sie eine 16 % im Handel erhältlichen PFA ab Lager auf 4 % mit 1 X PBS-Puffer für den Einsatz als Lager arbeiten und anschließend speichern Sie 4 % Aliquote bei-20 ° C.<ol>
<li>Um die Fixativ Lösung vorzubereiten, fügen Sie 10 mL 4 % PFA-Lösung und 600 µL 10 % Triton x-100, 30 mL 1 X PBS, gut mischen und anpassen den pH-Wert 9,2 mit 1 N HCl oder 1 N NaOH. Speichern Sie die Fixativ Lösung in einem 50 mL konische Röhrchen eingewickelt in Alufolie bei Raumtemperatur (für nicht mehr als 4 Wochen).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiten Sie Waschlösungen (während Folien die letzte 30 min Trocknen sind) mit Foto-Flo 200: 0,4 % Foto-Flo 200/PBS (320 µL von Foto-Flo 200 in 80 mL 1 X PBS) und 0,4 % Foto-Flo 200/dH2O (160 µL von Foto-Flo 200 in 40 mL Reinstwasser Labor Grad Wasser). Verwenden Sie ein 50 mL Coplin Glas, gefüllt mit 40 mL der Lösungen zu höchstens 10 Folien gleichzeitig waschen.</li>
	<li>Bereiten Sie die folgenden Instrumente: 1 paar chirurgische Schere (auf die Haut einzuschneiden), 1 paar feine Spitze chirurgische Schere (auf das Peritoneum einschneiden), 2 Paar gerade feine Spitze Pinzette (aus jedem Hoden sezieren), 1 gerade Kante Rasierklinge (zu jedem Hoden einschneiden), 2 Paar gebogene Spitze Pinzette (jeder Hoden zu immobilisieren und squeeze-out die seminiferous Röhrchen), 50 mL Gläser Coplin, Teflon gedruckt 3 Ring Rutschen, 1 Skalpell mit Größe 11 Messer, feuchte Kammer, 100 x 15 mm Petrischalen, feine Spitze permanent-Marker oder Bleistift, und eine rotierende Plattform Shaker.<ol>
<li>Platz Premium ungeladenen vorgereinigt mattierte Ende Glas-Objektträger aufrecht in ein 50 mL Coplin Glas, gefüllt mit Fixativ Lösung bis zur Verwendung. Hinweis: Bleistift wird bevorzugt, wenn Dias anschließend in Verfahren, die Ethanol, wie Fluoreszenz in Situ Hybridisierung verwendet werden.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Spermatocyte Kernen verbreiten
<ol><li>Eine männliche Maus nach institutionellen Richtlinien (z.B. zervikale Dislokation mit oder ohne CO2 Erstickung) einschläfern.</li>
	<li>Verwenden Sie P10 - P20 Männchen meiotische Zellen in der ersten Welle der Spermatogenese zu bewerten; Wir verwenden routinemäßig P15 - P17 Männchen Zellen von allen Subverteiler Prophase i. bieten Erwachsenen Hoden erhalten Zellen von Prophase ich auch, aber sie ergeben auch mehr postmeiotic Zellen, wie z. B. Spermatids.</li>
	<li>Ernte und wiegen die Hoden (Aufzeichnen der gekoppelten Gewichte); dann legen Sie sie in eine Petrischale mit ein paar Tropfen kalt HEB um sie feucht zu halten.</li>
	<li>Halten Sie die Hoden gegen den Boden der Schale mit gebogene Spitze Pinzette und verwenden Sie eine geraden Kante Rasierklinge, um einen kleinen vertikalen Mittellinie Schnitt durch die Kapsel der Hoden zu machen. Während noch in der Hand des Hodens gegen den Boden der Schale mit einer Pinzette, mit einen zweiten Satz von gebogene Spitze Pinzette oder einer geraden Kante Rasierklinge drücken Sie vorsichtig die seminiferous Röhrchen aus den Hoden.<ol>
<li>Legen Sie die Röhrchen in eine 15 mL konische Röhrchen mit 10 mL kalte HEB, kümmert sich um zu vermeiden, dass Teile der Kapsel in die Röhre. Wiederholen Sie diese Schritte mit dem zweiten Hoden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inkubieren Sie die Decapsulated seminiferous Röhrchen in das konische Rohr mit HEB für 30-60 min, abhängig von der Größe der Hoden auf Eis. Inkubieren seminiferous Röhrchen aus einem Paar Hoden mit einem Gewicht von 30 mg oder weniger für 30 min, Tubuli von ein paar Hoden mit einem Gewicht von 31 bis 50 mg für 30-45 Minuten und größere Hoden für 60 Minuten. Verändern Sie die Zeiten für einen einzigen Hoden nicht. Hinweis: Die optimale Inkubationszeit variieren abhängig von der Erfahrung der Experimentator, der verwendeten Reagenzien und die Mäuse, die analysiert wird.</li>
	<li>Während seminiferous Röhrchen in HEBR Inkubation sind, verwenden Sie einen Marker oder Bleistift die mattierten Enden der vorgereinigten Folien mit Maus, Foliennummer, und Datum beschriften. Dann legen Sie die vorgereinigten Folien in einem Coplin JAR-Datei mit dem Fixativ Lösung.</li>
	<li>Gießen Sie nach Inkubation Tubuli und HEB in einer sauberen Petrischale und separate Tubuli ca. 3 mm Durchmesser Klumpen. Jede Strähne ergibt 2 Rutschen und die Anzahl der Folien ergab hängt von der Größe der Hoden. Hinweis: Wir erhalten 8 Dias von Wildtyp und 6 Dias von subfertilen Chtf18-null-P16 Hoden (die durch verminderte Anzahl von meiotischen und mitotischen Keimzellen8kleiner sind). Ein Erwachsener Hoden mit einem Gewicht von 100 mg oder mehr würde voraussichtlich 16 Folien ergeben.</li>
	<li>Platz 23 µL 100 mM Saccharose-Lösung in einem Ring eine Teflon gedruckt, 3 ring Folie und fügen Sie ein Büschel von seminiferous Röhrchen in den Ring.  Dann mit gebogene Spitze Pinzette halten die Klumpen, die Tubuli mit einer Größe 11 Rasierklinge sanft zerkleinern, bis die Lösung trüb wird. Hinweis: Nicht overmince, da dies in den zersplitterten Chromosomen führt. Beachten Sie, dass fragmentierte Chromosomen einen mutierten Phänotyp auch hindeuten könnte.</li>
	<li>Entfernen Sie Fremdkörper, fügen Sie ein weiteres 23 µL Saccharoselösung und mithilfe einer Mikropipette sanft die Mischung ein paar Mal rauf und runter, pipette helfen die Zellen in der Suspension zu trennen.</li>
	<li>Entfernen Sie eine Folie in die Coplin JAR-Datei mit Fixativ Lösung einweichen und kippen Sie die Folie über das Glas zu, so dass eine großzügige Tröpfchen in der unteren Ecke der Folie sammelt.<ol>
<li>Pipettieren 20 µL Zellsuspension Saccharose aus dem Ring der Teflon gedruckte 3 Ring Folie in das Fixativ Tröpfchen auf eine Prämie gefrostet Objektträger und Pipettieren der Suspension nach oben und unten 2 - 3 Mal. Hinweis: Das Fixativ Tröpfchen sollte groß genug Volumen sein, so dass die Zugabe von 20 μl Zellsuspension Saccharose, es ermöglicht Berichterstattung über die gesamte Folie, wenn die Mischung verteilt ist (siehe unten 2.11).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Langsam kippen der Folie auf der Gegenseite der Tropfen, die Zellsuspension entlang der Länge der Folie zu verbreiten. Neigen Sie dann langsam die Folie zurück zu verbreiten die Zellsuspension entlang der Breite der Folie um es vollständig zu bedecken. Vermeiden Sie die Verbreitung der Suspension über den gleichen Bereich der Folie mehr als einmal sonst die Zellen mit einander überlappen.</li>
	<li>Sofort legen Sie Folie flach in eine feuchte Kammer, und wiederholen Sie Schritte 2,8 bis 2.11, bis alle Klumpen von seminiferous Röhrchen verwendet wurden, um Dias zu machen. Es ist wichtig nicht zu bewegen, die feuchte Kammer während des Trocknungsprozesses reißen und überlappenden Zellen zu vermeiden.</li>
	<li>Lassen Sie die Folien in einer überdachten feuchte Kammer bei Raumtemperatur für 2,5 h auszubrüten, so dass sie langsam und nicht vollständig trocknen. Hohe Luftfeuchtigkeit und langsame Trocknung in diesem Schritt sind wichtig für angemessene Verbreitung des Chromatins. Dann entfernen Sie den Deckel der Kammer und lassen Sie Folien komplett eine zusätzliche 30 Minuten an der Luft trocknen.</li>
	<li>Folien (Rücken an Rücken oder in einem Zick-Zack-Muster) in einem Coplin Glas mit 0,4 % Foto-Flo 200/1 X PBS-Lösung legen und waschen Sie die Folien zweimal, 5 min, durch Rühren sanft die Coplin jar auf einer Plattform drehen Shaker. Verwenden Sie frische Lösung für jede Wäsche und verschiedene Mäuse in separaten Gläsern aller Waschungen verhindern Sie Folien.</li>
	<li>Waschen Sie die Folien in einem Coplin Glas mit 0,4 % Foto-Flo 200/dH2O Lösung für 5 min einmal beim Rühren.</li>
	<li>Entfernen Sie Folien aus der Coplin jar (letzten waschen), sorgfältig wischen Sie die Kanten und Böden der Folien, überschüssige Flüssigkeit zu entfernen und Folien an einer abgewinkelten, fast aufrechten Position zum Trocknen legen. Ein Experimentator, der beherrschen diese Technik verarbeiten und Oberfläche-Ausbreitung Kerne von 4 oder 5 Mäuse an einem Tag vorzubereiten.</li>
	<li>Einmal trocken (15-20 min), verarbeiten Folien sofort für Immunfluoreszenz-Färbung oder Speicher bei-80 ° C in einer dicht verschlossenen Folie Box lichtgeschützt für maximal 3 Wochen (abhängig von der Zielproteine evaluiert; optimale Ergebnisse können erreicht werden, wenn gefärbt, die gleichen Tag oder innerhalb von 2 Wochen).<ol>
<li>Werden Sie bei-80 ° C gelagert, dann Folien auf Raumtemperatur kommen und waschen in einem Coplin JAR-Datei mit 1 X PBS oder Block für 5 min vor der Färbung. Hinweis: Viele verschiedene Immunfluoreszenz-Färbung-Protokolle werden gute Ergebnisse liefern; finden Sie Immunostaining Protokoll8, Berkowitz Et Al..</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Handel, M. A., Schimenti, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+mammalian+meiosis:+regulation,+dynamics+and+impact+on+fertility.">Genetics of mammalian meiosis: regulation, dynamics and impact on fertility.</a> Nat Rev Genet. 11, 124-136 (2010).</li><li>Peters, A. H., Plug, A. W., van Vugt, M. J., de Boer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+drying-down+technique+for+the+spreading+of+mammalian+meiocytes+from+the+male+and+female+germline.">A drying-down technique for the spreading of mammalian meiocytes from the male and female germline.</a> Chromosome Res. 5, 66-68 (1997).</li><li>Counce, S. J., Meyer, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+the+synaptonemal+complex+and+the+kinetochore+in+Locusta+spermatocytes+studied+by+whole+mount+electron+microscopy.">Differentiation of the synaptonemal complex and the kinetochore in Locusta spermatocytes studied by whole mount electron microscopy.</a> Chromosoma. 44, 231-253 (1973).</li><li>Speed, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiosis+in+the+foetal+mouse+ovary.+I.+An+analysis+at+the+light+microscope+level+using+surface-spreading.">Meiosis in the foetal mouse ovary. I. An analysis at the light microscope level using surface-spreading.</a> Chromosoma. 85, 427-437 (1982).</li><li>Ashley, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+changes+in+Rad51+distribution+on+chromatin+during+meiosis+in+male+and+female+vertebrates.">Dynamic changes in Rad51 distribution on chromatin during meiosis in male and female vertebrates.</a> Chromosoma. 104, 19-28 (1995).</li><li>Baker, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+mouse+mLh1+in+DNA+mismatch+repair+and+meiotic+crossing+over.">Involvement of mouse mLh1 in DNA mismatch repair and meiotic crossing over.</a> Nat Genet. 13, 336-342 (1996).</li><li>Plug, A. W., Xu, J., Reddy, G., Golub, E. I., Ashley, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+association+of+Rad51+protein+with+selected+sites+in+meiotic+chromatin.">Presynaptic association of Rad51 protein with selected sites in meiotic chromatin.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 5920-5924 (1996).</li><li>Berkowitz, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+CHTF18+causes+defective+meiotic+recombination+in+male+mice.">Disruption of CHTF18 causes defective meiotic recombination in male mice.</a> PLoS Genet. 8, e1002996 (2012).</li><li>Gomez, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sororin+loads+to+the+synaptonemal+complex+central+region+independently+of+meiotic+cohesin+complexes.">Sororin loads to the synaptonemal complex central region independently of meiotic cohesin complexes.</a> EMBO Rep. 17, 695-707 (2016).</li><li>Brooker, A. S., Berkowitz, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+roles+of+cohesins+in+mitosis,+meiosis,+and+human+health+and+disease.">The roles of cohesins in mitosis, meiosis, and human health and disease.</a> Methods Mol Biol. 1170, 229-266 (2014).</li><li>McNicoll, F., Stevense, M., Jessberger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cohesin+in+gametogenesis.">Cohesin in gametogenesis.</a> Curr Top Dev Biol. 102, 1-34 (2013).</li><li>Rankin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+elaboration:+making+sense+of+meiotic+cohesin+dynamics.">Complex elaboration: making sense of meiotic cohesin dynamics.</a> FEBS J. 282, 2426-2443 (2015).</li><li>Holloway, J. K., Sun, X., Yokoo, R., Villeneuve, A. M., Cohen, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+CNTD1+is+critical+for+meiotic+crossover+maturation+and+deselection+of+excess+precrossover+sites.">Mammalian CNTD1 is critical for meiotic crossover maturation and deselection of excess precrossover sites.</a> J Cell Biol. 205, 633-641 (2014).</li><li>La Salle, S., Sun, F., Handel, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+short-term+culture+of+mouse+spermatocytes+for+analysis+of+meiosis.">Isolation and short-term culture of mouse spermatocytes for analysis of meiosis.</a> Methods Mol Biol. 558, 279-297 (2009).</li><li>Wiltshire, T., Park, C., Caldwell, K. A., Handel, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+premature+G2/M-phase+transition+in+pachytene+spermatocytes+includes+events+unique+to+meiosis.">Induced premature G2/M-phase transition in pachytene spermatocytes includes events unique to meiosis.</a> Dev Biol. 169, 557-567 (1995).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Um hohe Zahlen der Spermatocyte Kerne gut verteilt, gute Qualität zu erhalten, sind die wichtigsten Schritte dieses Protokolls geeignete Inkubationszeit von seminiferous Röhrchen in HEB, geeignete Zerkleinerung von seminiferous Röhrchen und die Technik eingesetzt, um das Fixativ beschichtete Dias die Saccharose Zellsuspension verteilt sind. Wir inkubieren seminiferous Röhrchen aus Hoden Wildtyp Männchen von postnatale Tag 15 bis zum Erwachsenenalter in HEB für 45 min, während Hoden aus vergleichsweise Alter Ch...

Mäuse werden weitgehend als Modellorganismus zur Meiose bei Säugetieren zu studieren. Die normalen Entwicklungsprozesse und Mängel, die während der Meiose auftreten können ausgewertet werden. Die Timeline und Fortschreiten der hervorstechenden Merkmale, die während der Prophase I und Subverteiler auftreten, sowie eine Vielzahl von bestimmten Proteinen, die in Prozessen entscheidend zur Regulierung der Meiose kann bei Wildtyp und Mutanten Mäusen charakterisiert werden. Mehrere spezielle Prozesse, die während der Meiose auftreten, die ich im Detail (rezensiert in Händel und Schimenti1) studiert werden kann. Dazu gehören DNA Double-Strand Break (DSB) Bildung und Reparatur, Rekombination, synaptonemalen Komplex-Bildung und Chromosom Abtrennung.
Ein wichtiger Aspekt des Studiums meiotische Prozesse ist die Fähigkeit, Kerne zu untersuchen, mit homologe Chromosomen, die visuell und optisch besser gelöst werden zu unterscheiden und identifizieren die Subverteiler Prophase I. Prophase ich besteht aus 5 Subverteiler Das zeichnen sich durch Besonderheiten einschließlich der Bildung des synaptonemalen Komplexes (SC). Der SC ist eine dreigliedrige Protein-Gerüst, das ermöglicht die Kopplung und DNA Double-Strand Break Reparatur von homologe. Während Leptonema richten Sie homologe wie axiale Elemente des SC niedergelegt sind. Dann erleichtert die Befestigung der zentralen Elemente des synaptonemalen komplexes während Zygonema Paarung und physische Verbindung (Synapsis) zwischen Paaren von homologen. Während Pachynema Synapsis homologe wird vollständig und DNA-Frequenzweichen werden von der Reparatur einer ausgewählten Population von DNA-Doppel-Strangbrüchen durch homologe Rekombination gebildet. Der SC zerlegt in Diplonema, so dass homologe zu desynapse, sondern bleiben an ihren Zentromere und an Standorten der DNA Frequenzweichen verbunden. Schließlich während Diakinesis, homologe erneut und die Umstellung auf Metaphase erfolgt in1.
Historisch, Oberfläche-Verbreitung von meiotischen Chromatin ergab einige Kerne, insbesondere von frühen Stadien der Prophase ich2. Infolgedessen wurden diese Methoden geändert, um zu verbessern, die Trennung von Zellen aus dem Gewebe (Hoden oder Eierstöcke), die Technik des sich ausbreitenden meiotische Chromatin und die Ausbeute an qualitativ hochwertigen meiotische Kerne für Auswertung2,3, 4. Darüber hinaus diese Methode erwies sich als nützlich bei der Erhaltung nuklearen und Chromatin Proteine in meiotischen Kerne gebunden, wie veröffentlichten Immunolocalization Techniken5,6,7gezeigt. Daher die Methode zunächst von Peters2 beschrieben und gezeigt hier Erträge viele separate platzen Spermatocyte Kerne enthalten homologe durchläuft die Leptotän, Zygotene, Pachytene, Diplotene und Diakinesis Subverteiler Prophase ich.
Die Technik der Vorbereitung der Oberfläche verbreitet Kerne (auch genannt Chromatin Verbreitung Analyse) ist weit verbreitet, Meiose in den Bereichen der Fortpflanzungs- und Zelle Biologie zu studieren. Folien mit Oberfläche verbreitet Kernen können anschließend Immunostained mit Antikörpern gegen interessierender Proteine oder silberne Färbung unterzogen, und dann analysiert werden mit Mikroskopie. Die Methode ist ähnlich bei männlichen und weiblichen Mäusen, obwohl Änderungen für weibliche Mäuse2beschrieben worden sind. Es ist nicht unbedingt seminiferous Röhrchen overmince. Kerne müssen auch gut verteilt, so dass nach Immunostaining homologe und damit verbundenen Proteine sind deutlich mit Mikroskopie zu sehen. Oberfläche-Ausbreitung Kerne können bereit sofort in ein paar Stunden und entweder Immunostained oder bei-80 ° C für maximal 3 Wochen vor dem Auftauen und Immunostaining gespeichert werden. Jedoch werden optimale Ergebnisse für einige Proteine am besten erreicht, wenn Immunostaining sofort oder innerhalb von 2 Wochen der Vorbereitung der Oberfläche verbreitet Kernen durchgeführt wird. Folien können sein Immunostained mit einem Standardprotokoll mit Antikörper gegen Proteine des Interesses, gefolgt von Inkubation mit Sekundärantikörper konjugierten, fluoreszierende Proteine oder Farbstoffe, dann mit Fluoreszenz-Mikroskopie8abgebildet. Um postnatale Tag 15-21 Uhr gibt es ausreichend Gewebe pro paar Wildtyp Hoden um 6 bis 10 Folien zu erzielen, und ältere Mäuse (auch Erwachsene) erbringt weitere Folien. Allerdings werden Wildtyp-Mäusen 6 Wochen auch mehr Post-meiotische Zellen (d.h. Spermatids) auf den Folien nach Immunostaining liefern. Darüber hinaus können alle Subverteiler Prophase ich bei Jugendlichen und Erwachsenen Mäusen beobachtet werden. Hoden von männlichen postnatalen Tage 10 bis 15 ergibt viel mehr Leptotän und Zygotene Zellen. Mäuse, die älter als postnatale Tag 14 bis 15 erbringt mehr Pachytene und Diplotene Kerne.
Hier wir beschreiben und zeigen eine weit verbreitete Methode zur Vorbereitung Oberfläche verbreitet Kerne aus Maus Spermatozyten.

<table><tbody><tr><td>Photo-Flo 200</td><td>Kodak</td><td>1464510</td><td></td></tr><tr><td>16% Paraformaldehyde (formaldehyde aqueous solution)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>RT 15710</td><td>Dilute 16% solution into 4% working stocks with 1X PBS and freeze aliquots at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Teflon printed 3 ring slides</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>63418-11</td><td></td></tr><tr><td>Premium uncharged frosted end glass slides</td><td>Several commercial brands</td><td></td><td>Clean slides in ethyl or isopropyl alcohol and allow to drip dry prior to use; label slides on frosted end with a permanent marker or pencil depending on subsequent use of slides</td></tr><tr><td>Surgical scissors (sharp and blunt tips)</td><td>Fine Science Tools</td><td>14001-12</td><td>Different brand of a similar type will work</td></tr><tr><td>Fine tip surgical scissors (sharp tips)</td><td>Fine Science Tools</td><td>14058-11</td><td>Different brand of a similar type will work</td></tr><tr><td>Straight fine tip forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11050-10</td><td>Different brand of a similar type will work</td></tr><tr><td>Curved medium tip forceps</td><td>Fisher</td><td>16100110</td><td>Different brand of a similar type will work</td></tr><tr><td>Scalpel handle</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td>Different brand of a similar type will work</td></tr><tr><td>Mouse anti-SYCP3</td><td>Abcam</td><td>ab97672</td><td>Use at 1:300</td></tr><tr><td>Anti-centromere protein (derived from human CREST patient serum)</td><td>Antibodies Incorporated</td><td>15-234-0001</td><td>Use at 1:50</td></tr><tr><td>Humidified chamber</td><td></td><td></td><td>We use Nunc square culture dishes 500 cm2/well with moistened paper towels</td></tr><tr><td>Widefield microscope with epifluorescence</td><td>Leica microsystems</td><td></td><td>Any standard model</td></tr><tr><td>Coplin jars</td><td>Several commercial brands</td><td></td><td>50 ml capacity; 40 mm (1.6 in.) diameter, holds 10 slides (back to back)</td></tr><tr><td>Petri dishes</td><td>Several commercial brands</td><td></td><td>100 x 15 mm diameter, polystyrene sterile untreated</td></tr></tbody></table>

preparation of meiotic chromosome spreads from mouse spermatocytes

Säugetier-Meiose ist eine dynamische Entwicklungsprozess, der tritt in Keimzellen untersucht und charakterisiert. Mit einer Methode, um Kerne auf der Oberfläche der Folien zu verbreiten (anstatt Fallenlassen aus großer Höhe), zeigen wir eine optimierte Technik, die auf Maus Spermatozyten wurde 1997 erstmals beschrieben. Diese Methode ist weit verbreitet in Laboratorien, Säugetier-Meiose zu studieren, denn es ergibt sich eine Fülle von hochwertigen Kernen unterziehen Subverteiler Prophase I. Seminiferous Röhrchen zuerst befinden sich in eine Hypotonische Lösung Spermatozyten anschwellen. Dann in einer Saccharoselösung erstelle ich eine Zellsuspension Spermatozyten freigesetzt werden, und Kerne verteilen sich auf Fixiermittel getränkten Objektträger. Nach Immunostaining kann eine Vielfalt von Proteinen germane zu meiotische Prozesse untersucht werden. Zum Beispiel können Proteine des synaptonemalen komplexes, eine dreigliedrige Struktur, die das Chromosom Achsen/Kerne der homologen miteinander verbindet einfach visualisiert werden. Meiotischen Rekombination Proteine, die durch homologe Rekombination in der Reparatur von DNA-Doppel-Strangbrüchen beteiligt sind, kann auch Immunostained Fortschreiten der Prophase bewerten ich. Hier wir beschreiben und zeigen im Detail eine Technik weit verbreitet, Säugetier-Meiose in Spermatozyten von Jugendlichen oder erwachsenen männlichen Mäusen zu studieren.

Die Fähigkeit dieser Methode, bieten zahlreiche Oberfläche verbreiten Kerne mit intakten homologen hängt von drei Faktoren: 1) geeignete Inkubationszeit von seminiferous Röhrchen in hypotone Puffer (d.h. HEBR) angemessen zu schwoll Spermatocyte Kerne, die platzen, aber nicht zerfallen von längerer Inkubation in HEBR, 2) Micropipetting der Saccharose-Tröpfchen von Zellen zu einer getrennten Aussetzung der Kerne, die nicht miteinander verklumpt sind und 3) kippen jedes Fixiermittel be...

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Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Mouse Spermatocytes

Meiose ist der Entwicklungsprozess durch den Gameten durch eine einzelne Runde der DNA-Replikation und zwei aufeinanderfolgenden Runden Chromosom Segregation gebildet werden. Säugetier-Meiose kann untersucht werden, durch die Verwendung einer Technik um meiotische Chromosomen breitet sich vorzubereiten. Hier zeigen wir einen Weg der Vorbereitung der Oberfläche verbreitet Kerne aus Maus Spermatozyten.

Vorbereitung der meiotischen Chromosom erstreckt sich von Maus Spermatozyten

Mammalian meiosis is a dynamic developmental process that occurs in germ cells and can be studied and characterized. Using a method to spread nuclei on ...

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Serie: Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Mouse Spermatocytes

Step-specific Sorting of Mouse Spermatids by Flow Cytometry

The differentiation of mouse spermatids is one critical process for the production of a functional male gamete with an intact genome to be transmitted to the next generation. So far, molecular studies of this morphological transition have been hampered by the lack of a method allowing adequate separation of these important steps of spermatid differentiation for subsequent analyses. Earlier attempts at proper gating of these cells using flow cytometry may have been difficult because of a peculiar increase in DNA fluorescence in spermatids undergoing chromatin remodeling. Based on this observation, we provide details of a simple flow cytometry scheme, allowing reproducible purification of four populations of mouse spermatids fixed with ethanol, each representing a different state in the nuclear remodeling process. Population enrichment is confirmed using step-specific markers and morphological criterions. The purified spermatids can be used for genomic and proteomic analyses.

We describe a sorting strategy for mouse spermatids using flow cytometry. Spermatids are sorted into four highly pure populations, including round (spermiogenesis steps 1-9), early elongating (spermiogenesis steps 10-12), late elongating (spermiogenesis steps 13-14) and elongated spermatids (spermiogenesis steps 15-16). DNA staining, size and granulosity are used as selection parameters.

Schritt spezifische Sortierung der Maus Spermatiden durch Durchflusszytometrie

The differentiation of mouse spermatids is one critical process for the production of a functional male gamete with an intact genome to be transmitted to ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Chromatin Spread Preparations for the Analysis of Mouse Oocyte Progression from Prophase to Metaphase II

Chromatin spread techniques have been widely used to assess the dynamic localization of various proteins during gametogenesis, particularly for spermatogenesis. These techniques allow for visualization of protein and DNA localization patterns during meiotic events such as homologous chromosome pairing, synapsis and DNA repair. While a few protocols have been described in the literature, general chromatin spread techniques using mammalian prophase oocytes are limited and difficult due to the timing of meiosis initiation in fetal ovaries. In comparison, prophase spermatocytes can be collected from juvenile male mice with higher yields without the need for microdissection. However, it is difficult to obtain a pure synchronized population of cells at specific stages due to the heterogeneity of meiotic and post-meiotic germ cell populations in the juvenile and adult testis. For later stages of meiosis, it is advantageous to assess oocytes undergoing meiosis I (MI) or meiosis II (MII), because groups of mature oocytes can be collected from adult female mice and stimulated to resume meiosis in culture. Here, methods for meiotic chromatin spread preparations using oocytes dissected from fetal, neonatal and adult ovaries are described with accompanying video demonstrations. Chromosome missegregation events in mammalian oocytes are frequent, particularly during MI. These techniques can be used to assess and characterize the effects of different mutations or environmental exposures during various stages of oogenesis. As there are distinct differences between oogenesis and spermatogenesis, the techniques described within are invaluable to increase our understanding of mammalian oogenesis and the sexually dimorphic features of chromosome and protein dynamics during meiosis.

Oogenesis in mammals is known to be error-prone, particularly due to chromosome missegregation. This manuscript describes chromatin spread preparation methods for mouse prophase, metaphase I and II-staged oocytes. These fundamental techniques allow for the study of chromatin-bound proteins and chromosome morphology throughout mammalian oogenesis.

Chromatin verteilt die Vorbereitungen für die Analyse der Maus Eizelle Progression von Prophase, Metaphase II

Chromatin spread techniques have been widely used to assess the dynamic localization of various proteins during gametogenesis, particularly for ...

Genetik

Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Zebrafish Spermatocytes

Meiosis is the key cellular process required to create haploid gametes for sexual reproduction. Model organisms have been instrumental in understanding the chromosome events that take place during meiotic prophase, including the pairing, synapsis, and recombination events that ensure proper chromosome segregation. While the mouse has been an important model for understanding the molecular mechanisms underlying these processes, not all meiotic events in this system are analogous to human meiosis. We recently demonstrated the exciting potential of the zebrafish as a model of human spermatogenesis. Here we describe, in detail, our methods to visualize meiotic chromosomes and associated proteins in chromosome spread preparations. These preparations have the advantage of allowing high resolution analysis of chromosome structures. First, we describe the procedure for dissecting testes from adult zebrafish, followed by cell dissociation, lysis, and spreading of the chromosomes. Next, we describe the procedure for detecting the localization of meiotic chromosome proteins, by immunofluorescence detection, and nucleic acid sequences, by fluorescence in situ hybridization (FISH). These techniques comprise a useful set of tools for the cytological analysis of meiotic chromatin architecture in the zebrafish system. Researchers in the zebrafish community should be able to quickly master these techniques and incorporate them into their standard analyses of reproductive function.

Nuclear surface spreads are an indispensable tool for studying chromosome events during meiosis. Here we demonstrate a method to prepare and visualize meiotic chromosomes during prophase I from zebrafish spermatocytes.

Zubereitung von meiotischen Chromosomenaufstrichen aus Zebrafisch Spermatozyten

Meiosis is the key cellular process required to create haploid gametes for sexual reproduction. Model organisms have been instrumental in understanding ...

A Seminiferous Tubule Squash Technique for the Cytological Analysis of Spermatogenesis Using the Mouse Model

Meiotic progression in males is a process that requires the concerted action of a number of highly regulated cellular events. Errors occurring during meiosis can lead to infertility, pregnancy loss or genetic defects. Commencing at the onset of puberty and continuing throughout adulthood, continuous semi-synchronous waves of spermatocytes undergo spermatogenesis and ultimately form haploid sperm. The first wave of mouse spermatocytes undergoing meiotic initiation appear at day 10 post-partum (10 dpp) and are released into the lumen of seminiferous tubules as mature sperm at 35 dpp. Therefore, it is advantageous to utilize mice within this developmental time-window in order to obtain highly enriched populations of interest. Analysis of rare cell stages is more difficult in older mice due to the contribution of successive spermatogenic waves, which increase the diversity of the cellular populations within the tubules. The method described here is an easily implemented technique for the cytological evaluation of the cells found within the seminiferous tubules of mice, including spermatogonia, spermatocytes, and spermatids. The tubule squash technique maintains the integrity of isolated male germ cells and allows examination of cellular structures that are not easily visualized with other techniques. To demonstrate the possible applications of this tubule squash technique, spindle assembly was monitored in spermatocytes progressing through the prophase to metaphase I transition (G2/MI transition). In addition, centrosome duplication, meiotic sex chromosome inactivation (MSCI), and chromosome bouquet formation were assessed as examples of the cytological structures that can be observed using this tubule squash method. This technique can be used to pinpoint specific defects during spermatogenesis that are caused by mutation or exogenous perturbation, and thus, contributes to our molecular understanding of spermatogenesis.

The goal of this tubule squash technique is to rapidly assess cytological features of developing mouse spermatocytes while preserving cellular integrity. This method allows for the study of all stages of spermatogenesis, and can be easily implemented alongside other biochemical and molecular biological approaches for the study of mouse meiosis.

Eine Seminiferous Röhrchen-Squash-Technik für die zytologische Analyse der Spermatogenese mit dem Maus-Modell

Meiotic progression in males is a process that requires the concerted action of a number of highly regulated cellular events. Errors occurring during ...

Chromosomal Spread Preparation of Human Embryonic Stem Cells for Karyotyping

Although human embryonic stem cells (hESC) have been shown to present a stable diploid karyotype 1, many studies have reported that depending on culture conditions they become prone to acquire chromosomal anomalies such as addition of whole or parts of chromosomes. Indeed, during long-term culture, karyotypic alterations are observed when enzymatic or chemical dissociation are used 2,3,4, while manual dissection of colonies for passaging retains a stable karyotype 5. Besides, changes in the environment such as the removal of feeder cells also seem to compromise the genetic integrity of hESC 3,6. Once chromosomal alterations could affect cellular physiology, the characterization of the genetic integrity of hESC in vitro is crucial considering hESC as an essential tool in embryogenesis studies and drug testing. Furthermore, for future therapeutic purposes chromosomal changes are a real concern as it is frequently associated to carcinogenesis.
Here we show a simple and useful method to obtain high quality chromosome spreads for subsequent analysis of chromosome set by G-banding, FISH, SKY or CGH techniques 7,8. We recommend checking the chromosomal status routinely with intervals of 5 passages in order to monitor the appearance of translocations and aneuploidies
Priscila Britto and Rafaela Sartore contributed equally to the paper.

Karyotyping is a simple and useful technique widely used for detecting genetic alterations. Here we describe a step by step protocol for chromosome spread preparation of human embryonic stem cells for monitoring the chromosomal status of these cells maintained in culture.

Chromosomale Spread-Vorbereitung von humanen embryonalen Stammzellen für die Karyotypisierung

Although human embryonic stem cells (hESC) have been shown to present a stable diploid karyotype 1, many studies have reported that depending on culture ...

Biologie

Enrichment of Pachytene Spermatocytes and Spermatids from Mouse Testes Using Standard Laboratory Equipment

To characterize each step of spermatogenesis, researchers must separate different subpopulations of germ cells from testes. However, isolating discrete populations is challenging, because the adult testis contains a complex mix of germ cells from all steps of spermatogenesis along with certain populations of somatic cells. Over the past few decades, different techniques such as centrifugal elutriation, fluorescence-activated cell sorting (FACS), and STA-PUT have been successfully applied to the isolation of germ cells. A drawback is that they all require dedicated devices and specialized training. Following principles underlying the STA-PUT method, a simple protocol has been developed for the isolation of pachytene spermatocytes, round spermatids, and elongating spermatids from mouse testes. After preparing a single cell suspension of testicular cells, specific cell populations are enriched by gravity sedimentation through a discontinuous bovine serum albumin (BSA) density gradient. The cell fractions are then manually collected and microscopically analysed. This modified density gradient for round spermatids (MDR) sedimentation protocol can be widely applied, because it requires only standard laboratory equipment. Furthermore, the protocol requires minimal starting materials, reducing its cost and use of laboratory animals.

Presented here is a protocol for enriching pachytene spermatocytes, round spermatids, and elongating spermatids from adult mouse testes using a discontinuous bovine serum albumin density gradient with standard laboratory equipment.

Anreicherung von Pachyten-Spermatozyten und Spermatien aus Maushoden mit Standard-Laborgeräten

To characterize each step of spermatogenesis, researchers must separate different subpopulations of germ cells from testes. However, isolating discrete ...

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with development, tissue homeostasis, and disease processes. Drosophila spermatocytes undergoing meiosis are ideal for this analysis because (1) whole Drosophila testes containing spermatocytes are relatively easy to prepare for microscopy, (2) the spermatocytes&#8217; large size makes them well suited for high resolution imaging, and (3) powerful Drosophila genetic tools can be integrated with in vivo analysis. Here, we present a readily accessible protocol for the preparation of whole testes from Drosophila third instar larvae and early pupae. We describe how to identify meiotic spermatocytes in prepared whole testes and how to image them live by time-lapse microscopy. Protocols for fixation and immunostaining whole testes are also provided. The use of larval testes has several advantages over available protocols that use adult testes for spermatocyte analysis. Most importantly, larval testes are smaller and less crowded with cells than adult testes, and this greatly facilitates high resolution imaging of spermatocytes. To demonstrate these advantages and the applications of the protocols, we present results showing the redistribution of the endoplasmic reticulum with respect to spindle microtubules during cell division in a single spermatocyte imaged by time-lapse confocal microscopy. The protocols can be combined with expression of any number of fluorescently tagged proteins or organelle markers, as well as gene mutations and other genetic tools, making this approach especially powerful for analysis of cell division mechanisms in the physiological context of whole tissues and organs.

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

The goal of this protocol is to analyze cell division in intact tissue by live and fixed cell microscopy using Drosophila meiotic spermatocytes. The protocol demonstrates how to isolate whole, intact testes from Drosophila larvae and early pupae, and how to process and mount them for microscopy.

Vorbereitung von Drosophila Larval und Pupal Hoden für die Analyse der Zellteilung in Leben, intaktes Gewebe

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with ...

Isolation of Murine Spermatogenic Cells using a Violet-Excited Cell-Permeable DNA Binding Dye

Isolation of meiotic spermatocytes is essential to investigate molecular mechanisms underlying meiosis and spermatogenesis. Although there are established cell isolation protocols using Hoechst 33342 staining in combination with fluorescence-activated cell sorting, it requires cell sorters equipped with an ultraviolet laser. Here we describe a cell isolation protocol using the DyeCycle Violet (DCV) stain, a low cytotoxicity DNA binding dye structurally similar to Hoechst 33342. DCV can be excited by both ultraviolet and violet lasers, which improves the flexibility of equipment choice, including a cell sorter not equipped with an ultraviolet laser. Using this protocol, one can isolate three live-cell subpopulations in meiotic prophase I, including leptotene/zygotene, pachytene, and diplotene spermatocytes, as well as post-meiotic round spermatids. We also describe a protocol to prepare single-cell suspension from mouse testes. Overall, the procedure requires a short time to complete (4-5 hours depending on the number of needed cells), which facilitates many downstream applications.

Here we present a simple and efficient method to isolate live meiotic and post-meiotic germ cells from adult mouse testes. Using a low-cytotoxicity, violet-excited DNA binding dye and fluorescence-activated cell sorting, one can isolate highly enriched spermatogenic cell populations for many downstream applications.

Isolierung von murinen Spermatogenic Cells mit einem violett-erregten Zellpermeable DNA Binding Dye

Isolation of meiotic spermatocytes is essential to investigate molecular mechanisms underlying meiosis and spermatogenesis. Although there are established ...

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the unique differentiation programs that are manifest during meiosis. Two principal methods have been developed to purify, to varying degrees, various meiotic fractions from both adult and immature animals: elutriation or Staput (sedimentation) using BSA and/or percoll gradients. Both of these methods rely on cell size and density to separate meiotic cells1-5. Overall, except for few cell populations6, these protocols fail to yield sufficient purity of the numerous meiotic cell populations that are necessary for detailed molecular analyses. Moreover, with such methods usually one type of meiotic cells can be purified at a given time, which adds an extra level of complexity regarding the reproducibility and homogeneity when comparing meiotic cell samples.
Here, we describe a refined method that allows one to easily visualize, identify, and purify meiotic cells, from germ cells to round spermatids, using FACS combined with Hoechst 33342 staining7,8. This method provides an overall snapshot of the entire meiotic process and allows one to highly purify viable cells from most stage of meiosis. These purified cells can then be analyzed in detail for molecular changes that accompany progression through meiosis, for example changes in gene expression9,10and the dynamics of nucleosome occupancy at hotspots of meiotic recombination11.

An efficient method to obtain highly purified viable meiotic fractions from mouse testis is described, which combines a refined cell dissociation protocol with fluorescent activated cell sorting (FACS). This method takes advantage of differences in the DNA content and nuclear density of discrete meiotic fractions.

Durchflusszytometrie Reinigung der Maus meiotischen Zellen

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

<meta charset="utf8"></head><body>Verfahren zur Injektion von runden Spermatiden an der Maus zur Untersuchung der Embryonalentwicklung

Mouse Round Spermatid Injection

Round spermatids, characterized by their haploid genetic content, represent the precursor cells to mature spermatozoa. Through the innovative technique of round spermatid injection (ROSI), oocytes can be successfully fertilized and developed into viable fetuses. In a groundbreaking milestone achieved in 1995, the first mouse fetus was born through ROSI technology. ROSI has since emerged as a pivotal tool for unraveling the intricate mechanisms governing embryonic development and holds significant potential in various applications, including the acceleration of mouse generation and the production of genetically modified mice. In 1996, a milestone was reached when the first human fetus was born through ROSI technology. However, the clinical applications of this method have shown a fluctuating pattern of success and failure. To date, ROSI technology has not found widespread application in clinical practice, primarily due to its low birth efficiency and insufficient validation of fetal safety. This article provides a comprehensive account of the precise methods of performing ROSI in mice, aiming to shed new light on basic research and its potential clinical applications.

<meta charset="utf8"></head><body>Runde Maus-Spermatiden-Injektion

Here, we introduce a method for performing round spermatid injection (ROSI) in mice, a technique with promising clinical applications and utility for investigating the mechanisms underlying embryonic development.

Runde Maus-Spermatiden-Injektion

Round spermatids, characterized by their haploid genetic content, represent the precursor cells to mature spermatozoa. Through the innovative technique of ...