Questo protocollo può essere utilizzato per analizzare i meccanismi di divisione cellulare nel contesto di tessuti viventi e intatti utilizzando la microscopia a fluorescenza. Il vantaggio principale di questa tecnica è che gli ambienti fisiologici nativi delle cellule sono preservati, consentendo al contempo l'imaging dal vivo per lunghi corsi di tempo. La parte più importante di questa tecnica è assicurarsi che i tester non siano danneggiati durante la dissezione o il montaggio.
Questa è un'abilità che si acquisisce con un po 'di tempo e pratica. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, perché mostra come identificare e isolare i tester e come montarli per l'imaging senza danneggiare il tessuto. Prepara animali, strumenti e media come descritto nel manoscritto.
Prima di iniziare la dissezione, utilizzare la siringa filtrante riempita di supporto per espellere tre gocce di supporti ciascuno 50 microlitri nella parte superiore, centrale e inferiore di uno scivolo di vetro. Utilizzando una sonda di sezionazione, trasferire da cinque a 10 larve di instar o pupe precolari alla goccia superiore del supporto sullo scivolo. Agitare delicatamente le larve e le pupe nel supporto con la sonda di sezionazione per rimuovere qualsiasi cibo o detriti.
Utilizzare la sonda di sezionazione per ruotare una singola larva o pupe su un lato. Cerca i due teste bilaterali che appaiono come strutture ovali traslucide sul terzo posteriore del corpo. Gli animali privi di teste sono femmine e dovrebbero essere scartati.
Quando si trovano larve o pupe maschili ed è pulito, spostarlo alla seconda goccia di media. Ripetere fino a quando tre o quattro larve o pupe maschili sono state trasferite alla seconda goccia di media. Quindi lavorando nella seconda goccia di media, afferrare un singolo animale con un paio di forcep nella sua regione centrale, appena anteriore ai teste.
Usa un secondo paio di forcep per strappare delicatamente l'animale a metà. Usando un paio di forcep, tenere l'estremità posteriore dell'animale giù sullo scivolo di vetro. Partendo proprio accanto alle forcep, spingere verso il basso sulla cuticola usando il bordo del bisturi.
Spostare il bisturi verso l'estremità tagliata dell'animale. Questo espellerà gli organi interni dell'animale, che includono budella, corpi grassi e teste. I teste sono organi ovali incolori e quasi trasparenti incorporati in nastri di corpo grasso.
Prendere delicatamente in giro i teste dal resto degli organi. Per trasferire i tester uno alla volta, inserire il bordo del bisturi sotto il corpo grasso, sollevare il tessuto dal supporto e spostarlo rapidamente alla terza goccia. Se non c'è abbastanza corpo grasso ancora attaccato ai teste per sollevare il tessuto con il bisturi utilizzare una pipetta Pasteur di vetro che è stata prewetted con mezzo di dissezione.
Lavorando nella terza goccia di mezzo, utilizzare l'estremità affilata del bisturi per affettare delicatamente il corpo grasso in eccesso dai teste, lasciando solo un piccolo bordo di corpo grasso intorno ai bordi. In primo luogo, utilizzare la siringa filtrante per depositare una singola goccia del mezzo Schneider circa 30 microlitri al centro di un piatto di coltura permeabile al gas da 50 millimetri. Utilizzando lo strumento bisturi o una pipetta Pasteur prerivolta trasferire fino a cinque dei tester preparati alla goccia sul piatto.
Successivamente, utilizzare lo strumento bisturi per spingere delicatamente i testoli verso il basso sulla membrana permeabile al gas e al centro della goccia di mezzo. Utilizzando una siringa millilitro, posizionare quattro gocce di olio di alocarbonio sulla membrana permeabile al gas che circonda la goccia di mezzo. Le posizioni delle gocce dovrebbero corrispondere ai quattro angoli di una coverlip di classe di 22 millimetri.
Quindi allineare gli angoli di un coverslip di vetro di 22 millimetri con le quattro gocce di olio di alocarbonio e abbassare delicatamente il coverslip sul supporto e sull'olio. Lasciare depositare il coperchio e per il supporto contenente i teste la diffusione tra le gocce di olio. Mettere il piatto della coltura al microscopio di sezionamento.
Per rimuovere i supporti in eccesso, inserire l'angolo di una delicata salvietta dell'attività sotto il copriscivolo. Assorbi abbastanza supporti per la coverlip di vetro per direttamente a contatto con la superficie del testicolo più grande. Non rimuovere troppi supporti e abbassare troppo il coverslip.
Ciò eserciterà pressione sui tester e potrebbe causarne la rottura. Infine, posizionare una goccia di olio ad immersione sul coperchio del vetro appena sopra i testelli. Girare il piatto e posizionarlo sul palco del microscopio.
Spostare l'obiettivo del microscopio 40 o 60 X nell'olio fino a quando non è appena sotto i tester. Usa la luce trasmessa per trovare un singolo testicolo e rlo a fuoco. Posizionare 0,5 millilitri di paraformaldeide all'8% in PBSTx in un pozzo di un piatto da nove ben sezionando.
Utilizzare una pipetta Pasteur in vetro per trasferire fino a 10 dei tester nel pozzo. Assicurarsi che i teste siano sdraiati sul fondo del pozzo. Dopo 20 minuti, trasferire i tester in un pozzo contenente 0,5 millilitri di PBSTx.
Lavare i tester agitando delicatamente per cinque minuti. Lavare altre due volte in nuovi pozzi con PBSTx fresco. Preparare una diluizione dell'anticorpo primario in un tubo di microcentrifugo da 1,5 millilitri come descritto nel manoscritto.
Quindi trasferire i tester dal piatto di sezionatura in vetro a nove pozzi al tubo. Incubare il tubo durante la notte a quattro gradi Celsius con dolce dondolo o nutazione. La procedura per la colorazione dei teste con l'anticorpo secondario è simile.
Vedi il manoscritto per i dettagli. In primo luogo, utilizzando una pipetta Pasteur, trasferire i tester dalla piastra dei nove pozzi su uno scivolo di microscopia in vetro. Se necessario, utilizzare il bordo del bisturi per spingere i tester verso il basso sulla superficie dello scivolo.
Quindi, utilizzare l'angolo di una delicata salvietta per eliminare il liquido in eccesso dai teste. Rimuovere il più liquido possibile. Quindi applicare una goccia da 30 a 50 microliter di supporto di montaggio per microscopia ai tester.
Infine, posizionare un coverslip di 22 millimetri sulla goccia del mezzo di montaggio. Lasciare depositare il coperchio e stendere il mezzo di montaggio sotto il coverslip. Se necessario, applicare una leggera pressione sul coperchio per spremere il mezzo di montaggio in eccesso e lasciare riposare il coperchio sulla superficie dei tester.
Quando questo protocollo viene eseguito correttamente, l'organizzazione cellulare dei testicoli viene preservata e la progressione della differenziazione cellulare da un'estremità all'altra del testicolo è visibile. Gli spermatociti che iniziano la meiosi e quelli in metafase possono essere identificati. Nei test preparati utilizzando questo protocollo, l'analisi dell'imaging dal vivo mostra la riorganizzazione dinamica del reticolo endoplasmatico e dei micro tubuli nella divisione degli spermatociti.
Come descritto nel protocollo, occorre fare molta attenzione a non esercitare pressioni che provocano lo scoppio dei teste. Le cisti degli spermatociti scorrono rapidamente da un testicolo rotto, rendendo difficile l'imaging in tempo reale. Questo protocollo è ottimizzato per l'imaging che divide gli spermatociti nel tessuto vivente e intatto.
Pertanto, è essenziale che i tester non siano danneggiati durante la dissezione o il montaggio. Il nostro metodo dovrebbe anche essere adatto per tecniche di imaging a super risoluzione, come la microscopia ad illuminazione strutturata, fornendo nuove informazioni sui processi subcellulari dinamici che governano la divisione cellulare.
