פרוטוקול ההמרה מבוסס NanoDispenser שפותח כדי לתאר בסרטון זה מייצג את שיטת ההמרה הראשונה של תפוקה גבוהה וידידותית למשתמש המאפשרת אפילו למתחילים בתחום להצליח. זה קל על טכניקת תפוקה גבוהה מאפשר transfection של תא עם 384 מצב עצמאי. נכון לעכשיו, השיטה היא עלות נמוכה בשל נפח ננו של reagent צורך.
כדי להגדיר את הפרמטרים הטובים ביותר transfection עבור כל סוג התא, אנו ממליצים לשמור על ריכוז DNA המקור קבוע, ושימוש בכמויות משתנות של DNA מנופל, reagent transfection, ומספר התאים. עבור חלוקת ההשעיה של 40 תאים מיקרוליטר, הר קלטת 10 מיקרוליטר במכשיר המטפל בנוזלים פריסטואליים והכן תוכנית מתאימה. ראשית, להתאים את הפרמטר קצב זרימה נמוך כדי לוותר על תאים במהירות נמוכה, כדי למנוע קידום נזק פוטנציאלי לתאים על ידי מתח עצום והשפעה גבוהה על החלק התחתון של בארות.
לאחר מכן, להתאים את גובה היתר ל 11.43 מילימטרים. הגובה חייב להיות גבוה מספיק כדי להוריד את השפעת התא על החלק התחתון של הבארות במהלך תהליך חלוקת, אבל נמוך מספיק כדי למנוע שמירה של טיפות על הראש מחלק. לאחר מכן, להתאים את הצלחת גובה ברור ל 16 מילימטרים כדי לאפשר תזוזה חופשית של הראש מחלק מעל הצלחת לאחר חלוקת כל שורה.
שלוט באופן חזותי בהגדרות המתאימות של גובה הראש של המטפל בנוזלים פריסטואליים. ודאו שלא נשמרות טיפות על קצות החלוקה תוך כדי חלוקה. כמו כן, ודא כי הראש גבוה מספיק כדי לאפשר עקירה של הראש לאחר חלוקת כל שורה.
כדי ליצור רשימות בחירה כדי להניע את ADE-dispensation, מאקרו גיליון אלקטרוני ידידותי למשתמש פותח כדי לנהל כמויות DNA ולערבב עד ארבעה פלסמידים בפורמט צלחת 384 היטב. אמצעי אחסון אופטימליים מתמלאים מראש בתאים מסוימים של הגיליון האלקטרוני, אך ניתן לשנותם. בשדות הוורודים, ערך התערובת transfection, או TR, מוגדר ל- 500 ננוליטר.
ערך הנפח המינימלי בארות לוח המקור מוגדר לארבעה מיקרוליטרים, והנפח המקסימלי בארות לוח המקור הוא 11.25 מיקרוליטרים. הזן 100 ננוגרם לכל DNA microliter החל ריכוזים בשדות הכחולים המתאימים ל- DNA הבסיסית. לאחר מכן, הזן את כמות הדנ"א הרצויה בשדות האפורים והירוקים המתאימים ל-384 בארות הצלחת.
הזן את הסכומים ואת שמות פלסמיד ולהבטיח את אותו איות משמש אם אותו פלסמיד צריך להיות מומר בכמה בארות. לחץ על יצירת רשימות בחירה כדי לאמת את הערכים שהוזנו, ואם יתבקש, תקן את התאים עם המילוי הכתום המציינים שגיאות או אמצעי אחסון שלא ניתן לטפל בהם על-ידי NanoDispenser. אם אף אחד מהם לא מזוהה, המאקרו ייצור את מדריך חלוקת הבאר 384, את קובץ רשימת הבחירה של הדנ"א ואת קובץ רשימת הבחירה של TR מנתונים שנאספו על הגליונות המתאימים.
הדפס את התבנית מתוך גליון לוח המקור כדי להמחיש את בארות שיש למלא לפני חלוקתן. שמות פלסמיד ונפחי מילוי מינימליים מסומנים. נפחי תערובת reagent Transfection כי יהיה מלא הבארים הבאים, מסומנים כמו TR מודגש בירוק.
כדי להכין את לוחית המקור של הדנ"א, לדלל את פלסמיד DNA מאוחסן ל 100 ננוגרם למיקרוליטר באמצעות מים מזוקקים. עכשיו, לכייל את רשת באר 384 למידות הלוח. פתח את יישום מדריך צינורות באר 384 בטאבלט.
מקם את מקום המקור ברשת במסך התחתון. בתפריט הכיול השמאלי העליון, לחץ על פלוס או מינוס כדי לשפר או להקטין את גודל הרשת וה בארות על מנת להתאים את הבארים הירוקות לארבע הבארים הפינתיות של הצלחת. בעזרת סרט הדבקה דו-צדדי, תן את מתאם הלוח המודפס בתלת-ממד על המסך כדי להימנע מתנועות לוח מקור בעת חלוקה.
במידת הצורך, הזז את הרשת המכוילת באמצעות חיצי הסיבוב ולחצנים למעלה, למטה, ימינה, שמאלה כדי להתאים את הרשת למיקום הלוח. לאחר שהרשתות והגדלים הטובים מכוילים וממוקמים כראוי, סמן את תיבת כיול הנעילה. לחץ על הקובץ ולפתוח את 384-בארות-Pipetting-מדריך.
קובץ csv. בצע את הוראות המסך כדי לוותר באופן ידני על נפח פלסמיד שצוין בריכוז שצוין לתוך לבן מסומן היטב שמתאים ליעד היעד הנכון של הצלחת הצפויה. השתמש מינוס או בתוספת חצים כדי לחזור או רחוק יותר בתהליך חלוקת ה- DNA.
להפסיק לוותר על הגעה לפתרון reagent transfection הראשון לטעון. לאחר סיום חלוקת הדנ"א, הסר את לוחית המקור מהמתאם. אם יש למלא מספר לוחות מקור, מניחים לוחית מקור חדשה על המתאם ופעלו בהתאם להוראות ההתחלקות.
צנטריפוגה צלחות המקור מלא DNA כדי להבטיח פילינג נוזלי תקין כדי להסיר בועות המוביל אי דיוק בהעברות בסיס ADE. כעת, הפעל סקר כדי לשלוט באמצעי האחסון שחולקו באופן ידני. במחשב NanoDispenser, הפעל את תוכנית NanoDispenser.
עבור אל כרטיסיית האבחון, סמן את תיבת הדואר היוצא של לוחית המקור, טען את לוח המקור במחזיק הלוח וסמן כדי להיכנס לצלחת. כשתתבקשו, בחרו 384LDV_AQ_B2 כדי להגדיר את ה-NanoDispenser למצב חלוקת מאגר מים וללחוץ על הלחצן 'אשר'. בחר סקר בתפריט ההגיוני. ולחץ על ההשקה.
בחר את הבארות שמולאו מראש כדי לנתח וללחוץ על כפתור Go. ודא שאמצעי האחסון שנמדדו תואמים לאמצעי האחסון הצפויים וודא שלא נטענו בארות עם אמצעי אחסון של יותר מ- 12 מיקרוליטרים. ראש הצינורות עם מדיום ללא סרום על ידי מילוי כלי סטרילי חדש עם 10 מיליליטר של מדיום חינם סרום מחומם מראש שקוע מארגן הצינור בו.
לחץ על הכפתור הראשי של המטפל בנוזלים פריסטואליים במשך כ -10 שניות. ודא שהטיפ אינו סתום על-ידי בדיקה חזותית של הזרימה מהראש המחלק. מניחים צלחת תרבות סטרילית 384 היטב על מנשא צלחת המטפל הנוזלי peristaltic, ולהסיר את המכסה שלה.
הפעל את התוכנית המכוילת מראש כדי לוותר על מיקרוליטר אחד בכל באר של צלחת 384 באר. זמן ההתחלקות הוא כשמונה שניות. ואז להחליף את המכסה של צלחת 384 היטב.
כדי להגדיר חלוקת דנ"א מונחית ADE, הפעל את תוכנת רשימת הבחירה. הגדר את 384 בארות שמקורן 384LDV. הגדר את ההתקן למצב חלוקת מאגר מים על-ידי בחירת 384LDV_AQ_B2.
וסוגי לוחיות היעד Greiner_384PS_781096. תפוקת העברה ממוטבת ללא שנתות. בחר כרטיסיית רשימת בחירה.
לחץ על ייבוא. ובחר את DNA_Picklist_CSV הקובץ. לאחר מכן, לחץ על משחק ולשמור את הפרוטוקול.
לחץ על לדמות כדי לבצע סימולציה של חלוקות התוכנית כדי לוודא כי רשימת הבחירה תואמת את העיצוב הניסיוני הצפוי. לחץ על כפתור ההפעלה והפעל את תוכנית ההתחלקות. כאשר תישאל, הכנס את לוח המקור המבוקש.
ואז צלחת היעד בננו-דיסקפנסר. כדי להקים את היתר reagent transfection, לעבוד ב ארון biosafety לדלל רגנט transfection lipopolyplex במדיום ללא סרום לריכוז אחד x הסופי מערבולת הצינור. מיד לוותר על תערובת TR על פי לוח המקור מוגדר מראש deigned על ידי המאקרו באמצעות יישום מדריך צינורות 384 מכויל מראש.
לאחר חלוקת TR, בצע סקר כדי לשלוט באמצעי האחסון שנטענו TR כפי שנעשה בעבר עבור ה- DNA שנטען. בחרו בתערובת התגובות של הטרנס-דביקות למילוי מקדים של בארות לניתוח. ולחץ על כפתור Go.
ודא שאמצעי האחסון שנמדדו תואמים לאמצעי האחסון הצפויים. ולהבטיח שלא נטענו בארות עם כרכים של יותר מ-12 מיקרוליטרים. כעת בצע איפוס של רשימת קוטפי הדנ"א בתוכנת רשימת הבחירה.
ודא כי פרמטרי ההתקן עדיין מוגדרים למאגרים מיוקוויים. הזינו את סוגי לוחות המקור והיעד הנכונים. בכרטיסיה רשימת בחירה, לחץ על איפוס כדי לנקות את הרשימה לדוגמה.
לאחר מכן לחץ על ייבוא ובחר את TR_Picklist. קובץ CSV. לחץ על המשחק.
שמור את הפרוטוקול אם תתבקש ולבצע סימולציה של התוכנית transfection reagent תערובת היתרים כדי להבטיח עיצוב נכון על ידי לחיצה על כפתור ההדמיה. כפי שנעשה בעבר, לאחר לחיצה על כפתור ההפעלה והתחלת תוכנית החלוקה למקם את צלחת המקור ולאחר מכן את צלחת היעד NanoDipsenser כמבוקשה. כדי לחלק את התאים, למלא כלי סטרילי חדש עם ההשעיה התא מוכן ומערבבים אותו כדי למנוע מעים המוביל אי דיוק וצפיפות התא.
הכנס את מארגן הצינור לפתרון. לאחר מכן, לחץ על הכפתור הראשי עד ההשעיה התא מתחיל לשטוף מהראש מחלק. ודא שהטיפ אינו סתום על ידי בדיקה חזותית של הזרימה מראש המחלק תוך כדי שטיפה ולהבטיח שכל צינור נטען עם השעיית תא.
עכשיו, לטעון את ה-DNA ו TR מילא 384 צלחת יעד היטב על המוביל צלחת מטפל נוזלי peristaltic ולהסיר את המכסה שלה. הפעל את התוכנית המכוילת מראש כדי לוותר על 40 מיקרוליטרים של מתלי התא על צלחת 384 באר מלאה. זמן ההתחלקות הוא כ-45 שניות.
לבסוף, להחליף את המכסה של צלחת 384 היטב. ההיפוכות של תאי הלה באמצעות רגנט lipopolyplex היה מוצלח. כמויות דנ"א שנעו בין 5 ל-30 ננוגרם הראו את אותה יעילות ועד 90% ניתוף תאים בנפח אחד של דילואנט מיקרוליטר.
לעומת זאת, כמויות גבוהות יותר גרמו לירידה פתאומית באחוז התאים המותבים. כמויות שונות של דילואנטים שנעו בין 15 ננוליטר לארבעה מיקרוליטרים נבדקו ומיקרוליטר אחד זוהה כמצב הטוב ביותר. כדי לשפר עוד יותר את תפוקת פרוטוקול זה שתי שיטות אחסון DNA יעילות נבדקו כלומר יבש אחסון הצלחת או אחסון קפוא.
שתי שיטות האחסון לא הובילו לתוצאות שונות באופן משמעותי מאשר פתרון DNA טרי שאוחסן עד שבעה ימים. כמו transfection פלזמה בדרך כלל מעסיקה לפחות שתי plasmids שונים, יכולת מולטיפלקסינג DNA של פרוטוקול זה נבדק באמצעות התנאים המזוהים ביותר. החלבון הפלואורסצנטי האדום tdTomato ששימש בעבר לבטא פלסמיד שונה כדי לבטא mVenus חלבון פלואורסצנטי צהוב בהיר ושניהם שימשו אז בניסיונות cotransfection.
ניתוח תאים חיוביים פלואורסצנטיים אדומים או ירוקים הראה את יעילות ההמרה להיות כ 80%עם זאת, כמעט 100% מהתאים האדומים היו גם cotransfected עם mVenus להביע פלסמיד כפי שניתן לראות בניתוח תמונה מבוסס תוכנה ייצוגית. לאחר DNAs כבר מחלק בצלחת המקור. בצע סקר כדי להבטיח שאמצעי האחסון הצפויים נטענו ולא יעלו על 12 מיקרוליטרים.
בעת חלוקת רגנט transfection בצלחת המקור, לנסות למנוע בועות כמו צנטריפוגה צלחות משנה יגרום לאובדן מוחלט של יעילות transfection. שיטה זו יכולה להיות מיושמת על ניסוי ביולוגי, פשעים, ו transfection והוא מתאים בעיקר כי ניתן לבצע בפורמט צלחת 384 היטב. Transfection עמיד לחלוטין סולל את הדרך עבור יישומים חדשים כגון פלסמיד מבוסס ידוע גישות חדות יותר יצוק אי הקרנה המאפשר ניטור של השפעה לסירוגין כרגע לא ניתן למיין באסטרטגיות גרועות.
