Name: assessing whole-body lipid-handling capacity in mice
Uploaded: 2020-11-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 57 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessing Whole-Body Lipid-Handling Capacity in Mice at JoVE.com

עבודה זו נתמכת על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (NIH), מענק R00-DK114498, ומשרד החקלאות של ארצות הברית (USDA), מענק CRIS: 3092-51000-062 ל- Y. Z.

בעלי חיים שוכנים בתנאים סטנדרטיים בעקבות טיפול בבעלי חיים ופרוטוקולים ניסיוניים שאושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש במכללת ביילור לרפואה (BCM). בעלי חיים מקבלים תזונה סטנדרטית או מיוחדת, מים ad libitum, ונשמר עם מחזור יום / לילה 12 שעות ביממה.
1. מדידת שומנים בסרום צום
<ol><li>מעבירים עכברים לכלוב חדש אחרי השעה 17:00 ומהר עם גישה חופשית למים, לילה (עם כ -16 שעות של צום לפני הניסוי). צום הלילה מבטיח ריקון מלא של מערכת העיכול של העכברים. הערה: עכברים אוכלים את הצואה שלהם במהלך הצום, ולכן גמילה ממזון אינה יכולה להבטיח שהם צמים כראוי.</li>
	<li>למחרת בבוקר, לתפוס את העכבר בזנב ולהניח אותו על משטח. משוך לאחור בעדינות על זנב העכבר כדי למקם את העכבר במרסן. הנח את ריסון האף כדי לאמן מחדש את תנועת העכבר תוך מתן אפשרות לעכבר לנשום. הדק את הידית של ריסון האף. נטר את תנועות החזה כדי לוודא שבעל החיים נושם כרגיל ולמזער את הזמן שעכבר מבלה באזיקים.</li>
	<li>לעשות חתך שטחי (ניק) בווריד הזנב של העכבר הנע חופשי, ולמשוך 25 μL של דם מן החתך לתוך נימי זכוכית (מילוי על 1/3 של נימי) מבלי לרסן את העכבר. לפוצץ במהירות את הדם לתוך צינור microcentrifuge.</li>
	<li>להפסיק את הדימום באמצעות אבקות styptic, למלא את ההזנה בכלוב, ולוודא העכברים להראות שום סימנים של מתח.</li>
	<li>להשלים את נסיגת הדם לכל העכברים.</li>
	<li>אפשר לדם להישרש על ידי השארתו ללא הפרעה בטמפרטורת החדר במשך שעה אחת. סובבו את דגימות הדם הקרישו ב-2,000 x גרם ב-4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות במיקרוצנטריפוגה בקירור, והעבירו את הסופר-נטינט (סרום) לניתוח. הערה: סרום ניתן לאחסן ב -20 °C (70 °F) במשך מספר שבועות עד ניתוח. לאחסון לטווח ארוך, יש לשמור על הסרום ב-70°C.</li>
	<li>לנתח כל מטבוליט שומנים באמצעות הפרוטוקול שסופק על ידי היצרן.</li>
</ol>2. בדיקת סובלנות תוך ליפידית אוראלי
<ol><li>לאחר השעה 17:00, שקול את העכברים לחישוב הנפח התוך-ליפידי שיינתן להם למחרת. לאחר מכן, להעביר את העכברים לתוך כלוב חדש לצום אותם לילה (16 שעות).</li>
	<li>למחרת בבוקר, סמנו זנבות של העכברים השוכן בכלוב אחד כדי לסייע בזיהוים בשלבי הדימום הבאים.</li>
	<li>לעשות ניק בווריד הזנב ולשאוב 15 μL של דם מן החתך לתוך נימי זכוכית (מילוי על 1/5 של נימי), במהירות לפוצץ את הדם לתוך צינור microcentrifuge עבור T = 0 סרום. הערה: אין צורך לעצור את הדימום במהלך ההסתה אלא אם כן העכברים מראים דימום עודף.</li>
	<li>עכברי Gavage 20% תוך ליפיד באמצעות מחט gavage 18G ביחס של 15 מיקרול לגרם של משקל גוף, באמצעות משקל הגוף טרום הצום. עורמים כל עכבר בדקה אחת. הערה: שקול את החיה ולקבוע את גודל מחט gavage המתאים. בדרך כלל, מחט gavage 18 מד מתאים לעכברים >25 גרם, ומחט 20-22 מד gavage יהיה מתאים יותר לבעלי חיים קטנים יותר. קשקוש העכבר, אוחז בעור מעבר לכתפיים כדי להחזיק את ראשו של החיה במקומו. מניחים את מחט הגאבג'י בפה ולאחר מכן מתקדמים בעדינות לאורך החיך העליון, עד להגעה לוושט. הצינור צריך לעבור ללא התנגדות. ברגע שמגיעים לעומק הנכון, ניתן לנהל לאט לאט את העומק האינטרליפידי. הסר בעדינות את המחט בעקבות אותה זווית במהלך החדרת מחט לאחר ניהול Intralipid. החזר את החיה לכלוב ולפקח על סימנים של נשימה מאומצת או מצוקה אחרת. הערה: חוקרים שאינם מנוסים עם gavage או טכניקות דימום זנב או זנב יכול לערום כל עכבר על ידי 2 דקות או אפילו יותר.</li>
	<li>משוך דם ב- T = 1, 2, 3, 4, 5 ו- 6 שעות: צייר 15 μL של דם (1/5 נימי) לעכבר באמצעות דימום בזנב, ופוצץ במהירות את הדם לתוך צינור microcentrifuge.</li>
	<li>סובבו את דגימות הדם ב-2,000 על גרם בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות במיקרו-צנטריפוגה. העבר את supernatant, כולל שכבת השומן הצפה, לצינור PCR לאחסון. Supernatant ניתן לאחסן ב -20 °C (70 °F) במשך מספר שבועות עד ניתוח. הערה: סופר-נט צריך להיות פלזמה. אם כמה דגימות כבר קרישה על ידי זמן צנטריפוגה, זה לא משפיע על מדידת טריגליצריד.</li>
	<li>לאחר איסוף הדם האחרון, לעצור את הדימום באמצעות אבקות styptic, למלא את ההזנה בכלוב, ולוודא העכברים להראות שום סימנים של מתח קיצוני.</li>
	<li>טען 2 μL של תקן טריגליצריד ואסף supernatants לתוך צלחת 96 טוב.</li>
	<li>הוסף 200 μL של ריאגנט טריגליצריד ולתת את הצלחת לדגור במשך 5 דקות ב 37 °C (77 °F) להתפתחות צבע.</li>
	<li>מדוד את הספיגה ב 500 ננומטר עם אורך גל התייחסות של 660 ננומטר בקורא לוחות מעבדה, ולחשב את ריכוז המדגם.</li>
</ol>3. β3 קולטן אדראנג'י אגוניסט CL 316,243 ליפוזיס מגורה
<ol><li>הכן CL 316,243 כתמיסת מלאי של 5 מ"ג /מ"ל (50x) מלוחים סטריליים, ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס עד לשימוש.</li>
	<li>בבוקר, לשקול את העכברים כדי לחשב את כמות CL מדולל 316,243 פתרון הדרוש לניסוי. העכבר יקבל 10 μL לגרם של משקל גוף של CL מדולל 316,243, עבור מנה סופית של 1 מ"ג / קילוגרם משקל גוף.</li>
	<li>מעבירים את העכברים לכלוב חדש עם גישה חופשית למים, ומהר אותם במשך 4 שעות.</li>
	<li>הפוך מספיק 1x CL 316,243 פתרון מתוך 50x מלאי באמצעות מלוחים. הריכוז הסופי של 1x CL 316,243 פתרון הוא 0.1 מ"ג / מ"ל. השתמש מלוחים עבור קבוצת הטיפול בקרה.</li>
	<li>סמן את זנבות העכברים השוכן באותו כלוב לזיהוי קל במהלך שלבי הדימום.</li>
	<li>לעשות ניק בווריד הזנב, ולשאוב 15 μL של דם מן החתך לתוך נימי זכוכית (מילוי על 1/5 של נימי), במהירות לפוצץ את הדם לתוך צינור microcentrifuge עבור T = 0 מדגם. הערה: אין צורך לעצור את הדימום במהלך ההסתה אלא אם כן העכברים מראים דימום עודף.</li>
	<li>הזרקת תמיסה מדוללת CL 316,243 (או שליטה אם כלול בניסוי) תוך-איטרא-אקריטונית בנפח של 10 μL/g משקל גוף. עורמים כל עכבר בדקה אחת. השתמש לכל היותר 5 עכברים עבור כל ניסוי של 60 דקות, או 10 עכברים עבור צוות של שני אנשים.</li>
	<li>להקיז דם ב T = 5, 15, 30, 60 דקות: לצייר 15 μL של דם (1/5 נימי) לכל עכבר דרך דימום הזנב.</li>
	<li>לאחר איסוף הדם האחרון, לעצור את הדימום באמצעות אבקות styptic, למלא את ההזנה בכלוב, ולוודא העכברים להראות שום סימנים של מתח קיצוני.</li>
	<li>ספין דגימות דם ב 2,000 x g ב 4 °C (5 °F) במשך 5 דקות ב microcentrifuge בקירור. העבר את supernatant לצינור PCR לאחסון. ניתן לאחסן את הסופר-נט ב-20 מעלות צלזיוס למשך מספר שבועות עד לניתוח.</li>
	<li>טען 1 μL של 2x תקנים גלילסול מדולל באופן סדרתי (0.156, 0.312, 0.625, 1.25, ו 2.5 מ"ג / מיליליטר טריאולאין שווה ערך) ואסף supernatants לתוך צלחת 96 טוב. הוסף 100 μL של ריאגנט גליצ'רול חינם, ולתת את הצלחת לדגור במשך 5 דקות ב 37 °C (77 °F) עבור הצבע לפתח.</li>
	<li>מדוד את הספיגה ב 540 ננומטר באמצעות קורא לוחות מעבדה, ולחשב את ריכוז המדגם.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Dixon, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+chylomicron+uptake+into+lacteals.">Mechanisms of chylomicron uptake into lacteals.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1207, 52-57 (2010).</li><li>Nuno, J., de Oya, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipoprotein+lipase:+review.">Lipoprotein lipase: review.</a> Revista Cl&#237;nica Espa&#241;ola. 170 (3-4), 83-87 (1983).</li><li>Williams, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+processes+that+handle+--+and+mishandle+--+dietary+lipids.">Molecular processes that handle -- and mishandle -- dietary lipids.</a> Journal of Clinical Investigation. 118 (10), 3247-3259 (2008).</li><li>Burla, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MS-based+lipidomics+of+human+blood+plasma:+a+community-initiated+position+paper+to+develop+accepted+guidelines.">MS-based lipidomics of human blood plasma: a community-initiated position paper to develop accepted guidelines.</a> Journal of Lipid Research. 59 (10), 2001-2017 (2018).</li><li>Umpleby, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormone+measurement+guidelines:+Tracing+lipid+metabolism:+the+value+of+stable+isotopes.">Hormone measurement guidelines: Tracing lipid metabolism: the value of stable isotopes.</a> Journal of Endocrinology. 226 (3), 1-10 (2015).</li><li>Mitchell, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+paired+sibling+analysis+of+the+beta-3+adrenergic+receptor+and+obesity+in+Mexican+Americans.">A paired sibling analysis of the beta-3 adrenergic receptor and obesity in Mexican Americans.</a> Journal of Clinical Investigation. 101 (3), 584-587 (1998).</li><li>Mahoney, L. B., Denny, C. A., Seyfried, T. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caloric+restriction+in+C57BL/6J+mice+mimics+therapeutic+fasting+in+humans.">Caloric restriction in C57BL/6J mice mimics therapeutic fasting in humans.</a> Lipids in Health and Disease. 5, 13 (2006).</li><li>Hayek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dietary+fat+increases+high+density+lipoprotein+(HDL)+levels+both+by+increasing+the+transport+rates+and+decreasing+the+fractional+catabolic+rates+of+HDL+cholesterol+ester+and+apolipoprotein+(Apo)+A-I.+Presentation+of+a+new+animal+model+and+mechanistic+studies+in+human+Apo+A-I+transgenic+and+control+mice.">Dietary fat increases high density lipoprotein (HDL) levels both by increasing the transport rates and decreasing the fractional catabolic rates of HDL cholesterol ester and apolipoprotein (Apo) A-I. Presentation of a new animal model and mechanistic studies in human Apo A-I transgenic and control mice.</a> Journal of Clinical Investigation. 91 (4), 1665-1671 (1993).</li><li>Hogarth, C. A., Roy, A., Ebert, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+evidence+for+the+absence+of+a+functional+cholesteryl+ester+transfer+protein+gene+in+mice+and+rats.">Genomic evidence for the absence of a functional cholesteryl ester transfer protein gene in mice and rats.</a> Comparative Biochemistry and Physiology - Part B: Biochemistry &amp; Molecular Biology. 135 (2), 219-229 (2003).</li><li>Tall, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functions+of+cholesterol+ester+transfer+protein+and+relationship+to+coronary+artery+disease+risk.">Functions of cholesterol ester transfer protein and relationship to coronary artery disease risk.</a> Journal of Clinical Lipidology. 4 (5), 389-393 (2010).</li><li>Singh, A. K., Singh, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triglyceride+and+cardiovascular+risk:+A+critical+appraisal.">Triglyceride and cardiovascular risk: A critical appraisal.</a> Indian Journal of Endocrinology and Metabolism. 20 (4), 418-428 (2016).</li><li>Miller, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triglycerides+and+cardiovascular+disease:+a+scientific+statement+from+the+American+Heart+Association.">Triglycerides and cardiovascular disease: a scientific statement from the American Heart Association.</a> Circulation. 123 (20), 2292-2333 (2011).</li><li>Dron, J. S., Hegele, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+Hypertriglyceridemia.">Genetics of Hypertriglyceridemia.</a> Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 11, 455 (2020).</li><li>Dole, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+relation+between+non-esterified+fatty+acids+in+plasma+and+the+metabolism+of+glucose.">A relation between non-esterified fatty acids in plasma and the metabolism of glucose.</a> Journal of Clinical Investigation. 35 (2), 150-154 (1956).</li><li>Bartelt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brown+adipose+tissue+activity+controls+triglyceride+clearance.">Brown adipose tissue activity controls triglyceride clearance.</a> Nature Medicine. 17 (2), 200-205 (2011).</li><li>de Souza, C. J., Burkey, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta+3-adrenoceptor+agonists+as+anti-diabetic+and+anti-obesity+drugs+in+humans.">Beta 3-adrenoceptor agonists as anti-diabetic and anti-obesity drugs in humans.</a> Current Pharmaceutical Design. 7 (14), 1433-1449 (2001).</li><li>Braun, K., Oeckl, J., Westermeier, J., Li, Y., Klingenspor, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-adrenergic+control+of+lipolysis+and+thermogenesis+in+adipose+tissues.">Non-adrenergic control of lipolysis and thermogenesis in adipose tissues.</a> Journal of Experimental Biology. 221, (2018).</li></ol>

למחברים אין מה לחשוף.

שלושת הבדיקות המתוארות מתפקדות היטב במעבדה, עם כמה שיקולים קריטיים. צום בן לילה נדרש לקביעת רמות השומנים בסרום הצום ובדיקת סובלנות תוך ליפיד דרך הפה. עבור בדיקת סובלנות תוך ליפיד אוראלי, זה קריטי לסובב את הדם בטמפרטורת החדר כדי למזער את היווצרות שכבת השומן, במיוחד בנקודות זמן של שעה ו 2 שעו?...

פחמימות ושומנים הם שני מצעים עיקריים לחילוף חומרים של אנרגיה. חילוף חומרים חריג של שומנים בדם גורם למחלות אנושיות רבות, כולל סוכרת מסוג II, מחלות לב וכלי דם, מחלות כבד שומני וסרטן. שומנים תזונתיים, בעיקר טריגליצרידים, נספגים דרך המעי לתוך מערכת הלימפה ונכנסים למחזור הדם הוורי ב chylomicrons ליד הלב1. שומנים נישאים על ידי חלקיקי ליפופרוטאין במחזור הדם, שם moieties חומצת שומן משוחררים על ידי הפעולה של ליפופרוטאין ליפאז באיברים היקפיים כגון שריר ורקמתשומן 2. שאריות השרידים העשירות בכולסטרול מנוקות על ידי הכבד3. עכברים היו בשימוש נרחב במעבדות כמודל מחקר לחקר חילוף החומרים של השומנים. עם ערכות כלים גנטיות מקיפות זמינות ומחזור רבייה קצר יחסית, הם מודל רב עוצמה לחקר האופן שבו שומנים נספגים, מסונתזים ומטבוליזם.
בשל המורכבות של חילוף החומרים של השומנים, מחקרי lipidomics מתוחכמים או מחקרי מעקב איזוטופיים משמשים בדרך כלל כדי לכמת אוספים של מינים שומנים או שטפים מטבוליים הקשורים שומניםוגורלות 4,5. זה יוצר אתגר עצום לחוקרים ללא ציוד מיוחד או מומחיות. במאמר זה, אנו מציגים שלוש בדיקות שיכולות לשמש מבדיקות ראשוניות לפני שימוש בטכניקות מאתגרות מבחינה טכנית. הם נהלים שאינם סופניים עבור העכברים, ולכן שימושי מאוד לזיהוי הבדלים פוטנציאליים ביכולת טיפול בשומנים וצמצום התהליכים המושפעים.
ראשית, מדידת מולקולות השומנים בסרום בצום יכולה לעזור לוודא את פרופיל השומנים הכללי של העכבר. עכברים צריכים להיות צמים, כי מינים שומנים רבים לעלות לאחר הארוחות, ואת היקף הגידול מושפע מאוד על ידי הרכב הדיאטה. מולקולות שומנים רבים, כולל כולסטרול כולל, טריגליצריד וחומצת שומן לא אסטרית (NEFA), ניתן למדוד באמצעות ערכה מסחרית וקורא לוחות שיכול לקרוא ספיגה.
שנית, בדיקת סובלנות תוך ליפיד אוראלי מעריכה את יכולת הטיפול בשומנים כהשפעה נטו של ספיגה וחילוף חומרים. אינטרליפיד המנוהל בעל פה גורם לעלייה חדה ברמות הטריגליצריד במחזור (1-2 שעות), ולאחר מכן רמות הטריגליצריד בסרום חוזרות לרמות בזאליות (4-6 שעות). זה assay מציע מידע על כמה טוב עכבר יכול להתמודד עם שומנים אקסוגניים. רקמת שומן לב, כבד וחום הם צרכנים פעילים של טריגליצרידים, ואילו רקמת שומן לבנה מאחסנת אותה כמאגר אנרגיה. שינויים בפונקציות אלה יובילו להבדלים בתוצאות הבדיקה.
לבסוף, קידום lipolysis לגייס שומנים מאוחסנים נחשב אסטרטגיה אפשרית לירידה במשקל. מסלול איתות קולטן β3-adrenergic ברקמת השומן ממלא תפקיד חשוב בליפוליזה אדיפוזיט, והגנטיקה האנושית זיהתה פולימורפיזם Trp64Arg אובדן תפקוד ב β3-קולטן adrenergic בקורלציה עם השמנת יתר6. CL 316,243, אגוניסט קולטן β3-adrenergic ספציפי וחזק, מגרה ליפוליזה של רקמת שומן ושחרור של גליסול. הערכה של תגובת העכבר CL 316,243 יכול לספק מידע בעל ערך על הפיתוח, שיפור, והבנה של היעילות של המתחם.
באופן קולקטיבי, בדיקות אלה יכולות לשמש כמסך ראשוני לשינויים במצב חילוף החומרים של השומנים של עכברים. הם נבחרים לנגישות של המכשירים והריגנטים. עם התוצאות הנגזרות מבדים אלה, החוקרים יכולים ליצור תמונה כוללת של הכושר המטבולי של בעלי החיים שלהם ולהחליט על גישות מתוחכמות וממוקדמות יותר.

<table><tbody><tr><td>20% Intralipid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I141</td><td></td></tr><tr><td>BD Slip Tip Sterile Syringes 1ml</td><td>Shaotong</td><td>B07F1KRMYN</td><td></td></tr><tr><td>CL 316,243 Hydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5976</td><td></td></tr><tr><td>Curved Feeding Needles (18 Gauge)</td><td>Kent Scientific</td><td>FNC-18-2-2</td><td></td></tr><tr><td>Free Glycerol Reagent</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F6428</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol Standard Solution</td><td>Sigma</td><td>G7793</td><td></td></tr><tr><td>HR SERIES NEFA-HR(2)COLOR REAGENT A</td><td>Fujifilm Wako Diagnostics</td><td>999-34691</td><td></td></tr><tr><td>HR SERIES NEFA-HR(2)COLOR REAGENT B</td><td>Fujifilm Wako Diagnostics</td><td>991-34891</td><td></td></tr><tr><td>HR SERIES NEFA-HR(2)SOLVENT A</td><td>Fujifilm Wako Diagnostics</td><td>995-34791</td><td></td></tr><tr><td>HR SERIES NEFA-HR(2)SOLVENT B</td><td>Fujifilm Wako Diagnostics</td><td>993-35191</td><td></td></tr><tr><td>Matrix Plus Chemistry Reference Kit</td><td>Verichem</td><td>9500</td><td></td></tr><tr><td>Micro Centrifuge Tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-222-168</td><td></td></tr><tr><td>Microhematrocrit Capillary Tube, Not Heparanized</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-362-574</td><td></td></tr><tr><td>NEFA STANDARD SOLUTION</td><td>Fujifilm Wako Diagnostics</td><td>276-76491</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline</td><td>Boston Bioproducts</td><td>BM-220</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Triglycerides Reagent</td><td>Fisher Scientific</td><td>TR22421</td><td></td></tr><tr><td>Total Cholesterol Reagents</td><td>Thermo Scientifi</td><td>TR13421</td><td></td></tr></tbody></table>

assessing whole-body lipid-handling capacity in mice

הערכת חילוף החומרים של השומנים היא אבן יסוד בהערכת תפקוד חילוף החומרים, והיא נחשבת חיונית למחקרי חילוף החומרים של vivo. שומנים הם סוג של מולקולות רבות ושונות עם מסלולים רבים המעורבים בסינתזה שלהם ואת חילוף החומרים. נקודת התחלה להערכת hemostasis שומנים עבור תזונה ומחקר השמנת יתר יש צורך. מאמר זה מתאר שלוש שיטות קלות ונגישות הדורשות מעט מומחיות או תרגול כדי לשלוט, וזה יכול להיות מותאם על ידי רוב המעבדות כדי לסנן עבור חריגות חילוף החומרים השומנים בעכברים. שיטות אלה הן (1) מדידה מספר מולקולות שומנים בסרום צום באמצעות ערכות מסחריות (2) בדיקה ליכולת טיפול שומנים תזונתיים באמצעות בדיקת סובלנות תוך ליפיד אוראלי, ו -(3) הערכת התגובה לתרכובת תרופות, CL 316,243, בעכברים. יחד, שיטות אלה יספקו סקירה ברמה גבוהה של יכולת טיפול בשומנים בעכברים.

אנו מראים עם שלושה קטעים כי כל מטען מציע מידע בעל ערך על חילוף החומרים של השומנים של העכברים. עבור עכברים זכרים C57BL/6J, מאותגרים על ידי שמונה שבועות של תזונה עתירת שומן (HFD) האכלה החל משמונה שבועות של גיל, רמות הכולסטרול הכולל היו גבוהות באופן משמעותי, בעוד טריגליצריד סרום ו- NEFA לא היו (טבלה...

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Whole-Body Lipid-Handling Capacity in Mice at JoVE.com

Assessing Whole-Body Lipid-Handling Capacity in Mice

מאמר זה מספק שלוש גישות קלות ונגישות להערכת חילוף החומרים של השומנים בעכברים.

הערכת יכולת טיפול בליפידים בכל הגוף בעכברים

Assessing lipid metabolism is a cornerstone of evaluating metabolic function, and it is considered essential for in vivo metabolism studies. Lipids are a ...

assessing-whole-body-lipid-handling-capacity-in-mice

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Medicine

3.9K Views.  Baylor College of Medicine. מאמר זה מספק שלוש גישות קלות ונגישות להערכת חילוף החומרים של השומנים בעכברים.

Video: Assessing Whole-Body Lipid-Handling Capacity in Mice

Determining Bile Duct Density in the Mouse Liver

Mouse is broadly used as a model organism to study biliary diseases. To evaluate the development and function of the biliary system, various techniques are used, including serum chemistry, histological analysis, and immunostaining for specific markers. Although these techniques can provide important information about the biliary system, they often do not present a full picture of bile duct (BD) developmental defects across the whole liver. This is in part due to the robust ability of the mouse liver to drain the bile even in animals with significant impairment in biliary development. Here we present a simple method to calculate the average number of BDs associated with each portal vein (PV) in sections covering all lobes of mutant/transgenic mice. In this method, livers are mounted and sectioned in a stereotypic manner to facilitate comparison among various genotypes and experimental conditions. BDs are identified via light microscopy of cytokeratin-stained cholangiocytes, and then counted and divided by the total number of PVs present in liver section. As an example, we show how this method can clearly distinguish between wild-type mice and a mouse model of Alagille syndrome. The method presented here cannot substitute for techniques that visualize the three-dimensional structure of the biliary tree. However, it offers an easy and direct way to quantitatively assess BD development and the degree of ductular reaction formation in mice.

We present a rather simple and sensitive method for accurate quantification of bile duct density in the mouse liver. This method can aid in determining the effects of genetic and environmental modifiers and the effectiveness of potential therapies in mouse models of biliary diseases.

קביעת צפיפות צינור המרה בכבד העכבר

Mouse is broadly used as a model organism to study biliary diseases. To evaluate the development and function of the biliary system, various techniques ...

Developmental Biology

Shotgun Lipidomics of Rodent Tissues

Lipids play a vital role as essential components of all prokaryotic and eukaryotic cells. Constant technological improvements in mass spectrometry have made lipidomics a powerful analytical tool for monitoring tissue lipidome compositions in homeostatic as well as disease states. This paper presents a step-by-step protocol for a shotgun lipid analysis method that supports the simultaneous detection and quantification of a few hundred molecular lipid species in different tissue and biofluid samples at high throughput. This method leverages automated nano-flow direct injection of a total lipid extract spiked with labeled internal standards without chromatographic separation into a high-resolution mass spectrometry instrument. Starting from sub-microgram amounts of rodent tissue, the MS analysis takes 10 min per sample and covers up to 400 lipids from 14 lipid classes in mouse lung tissue. The method presented here is well suited for studying disease mechanisms and identifying and quantifying biomarkers that indicate early toxicity or beneficial effects within rodent tissues.

Shotgun mass spectrometry-based lipidomics delivers a sensitive quantitative snapshot of a broad spectrum of lipid classes simultaneously in a single measurement from various rodent tissues.

Shotgun Lipidomics של רקמות מכרסם

Lipids play a vital role as essential components of all prokaryotic and eukaryotic cells. Constant technological improvements in mass spectrometry have ...

Biochemistry

Optimized Analysis of In Vivo and In Vitro Hepatic Steatosis

Establishing a system of procedures to qualitatively and quantitatively characterize in vivo and in vitro hepatic steatosis is important for metabolic study in the liver. Here, numerous assays are described to comprehensively measure the phenotype and parameters of hepatic steatosis in mouse and hepatocyte models. 
Combining the physiological, histological, and biochemical methods, this system can be used to assess the progress of hepatic steatosis. In vivo, the measurements of body weight and nuclear magnetic resonance (NMR) provide a general understanding of mice in a non-invasive manner. Hematoxylin and Eosin (H&amp;E) and Oil Red O staining determine the histological morphology and lipid deposition of liver tissue under nutrient overload conditions, such as high-fat diet feeding. Next, the total lipid contents are isolated by chloroform/methanol extraction, which are followed by a biochemical analysis for triglyceride and cholesterol. Moreover, mouse primary hepatocytes are treated with high glucose plus insulin to stimulate lipid accumulation, an efficient in vitro model to mimic diet-induced hyperglycemia and hyperinsulinemia in vivo. Then, the lipid deposition is measured by Oil Red O staining and chloroform/methanol extraction. Oil Red O staining determines intuitive hepatic steatotic phenotypes, while the lipid extraction analysis determines the parameters that can be analyzed statistically. The present protocols are of interest to scientists in the fields of fatty liver diseases, insulin resistance, and type 2 diabetes.

Optimized Analysis of In Vivo and In Vitro Hepatic Steatosis

Here, optimized methods to generate in vivo and in vitro models of hepatic steatosis and to analyze the steatotic phenotypes and related physiological parameters are described.

ניתוח אופטימלי של<em&gt; In vivo</em&gt; ו<em&gt; במבחנה</em&gt; כבדית steatosis

Establishing a system of procedures to qualitatively and quantitatively characterize in vivo and in vitro hepatic steatosis is important for metabolic ...

Quantification of Atherosclerosis in Mice

Cardiovascular disease is the main cause of death in the world. The underlying cause in most cases is atherosclerosis, which is in part a chronic inflammatory disease. Experimental atherosclerosis studies have elucidated the role of cholesterol and inflammation in the disease process. This has led to successful clinical trials with pharmaceutical agents that reduce clinical manifestations of atherosclerosis. Careful and well-controlled experiments in mouse models of the disease could further elucidate the pathogenesis of the disease, which is not fully understood. Standardized lesion analysis is important to reduce experimental variability and increase reproducibility. Determining lesion size in aortic root, aortic arch, and brachiocephalic artery are common endpoints in experimental atherosclerosis. This protocol provides a technical description for evaluation of atherosclerosis at all these sites in a single mouse. The protocol is particularly useful when material is limited, as is frequently the case when genetically modified animals are being characterized.

Murine models of atherosclerosis are useful tools to investigate pathogenic pathways on a molecular level, but require standardized quantification of lesion development. This protocol describes an optimized method to determine lesion size in the major arterial vessels including the aortic root, aortic arch, and brachiocephalic artery.

קוונפיקציה של טרשת עורקים בעכברים

Cardiovascular disease is the main cause of death in the world. The underlying cause in most cases is atherosclerosis, which is in part a chronic ...

Immunology and Infection

Body Composition and Metabolic Caging Analysis in High Fat Fed Mice

Alterations to body composition (fat or lean mass), metabolic parameters such as whole-body oxygen consumption, energy expenditure, and substrate utilization, and behaviors such as food intake and physical activity can provide important information regarding the underlying mechanisms of disease. Given the importance of body composition and metabolism to the development of obesity and its subsequent sequelae, it is necessary to make accurate measures of these parameters in the pre-clinical research setting. Advances in technology over the past few decades have made it possible to derive these measures in rodent models in a non-invasive and longitudinal fashion. Consequently, these metabolic measures have proven useful when assessing the response of genetic manipulations (for example knockout or transgenic mice, viral knock-down or overexpression of genes), experimental drug/compound screening and dietary, behavioral or physical activity interventions. Herein, we describe the protocols used to measure body composition and metabolic parameters using an animal monitoring system in chow-fed and high fat diet-fed mice.

This protocol describes the use of a body composition analyzer and metabolic animal monitoring system to characterize body composition and metabolic parameters in mice. An obesity model induced by high-fat feeding is used as an example for the application of these techniques.

הרכב הגוף וניתוח מטבולית שכולאת בעכברים פד שומן גבוה

Alterations to body composition (fat or lean mass), metabolic parameters such as whole-body oxygen consumption, energy expenditure, and substrate ...

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

The nematode C. elegans has emerged as an important model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as it relates to human obesity and its associated pathologies. Several previous methodologies developed for the visualization of C. elegans triglyceride-rich fat stores have proven to be erroneous, highlighting cellular compartments other than lipid droplets. Other methods require specialized equipment, are time-consuming, or yield inconsistent results. We introduce a rapid, reproducible, fixative-based Nile red staining method for the accurate and rapid detection of neutral lipid droplets in C. elegans. A short fixation step in 40% isopropanol makes animals completely permeable to Nile red, which is then used to stain animals. Spectral properties of this lipophilic dye allow it to strongly and selectively fluoresce in the yellow-green spectrum only when in a lipid-rich environment, but not in more polar environments. Thus, lipid droplets can be visualized on a fluorescent microscope equipped with simple GFP imaging capability after only a brief Nile red staining step in isopropanol. The speed, affordability, and reproducibility of this protocol make it ideally suited for high throughput screens. We also demonstrate a paired method for the biochemical determination of triglycerides and phospholipids using gas chromatography mass-spectrometry. This more rigorous protocol should be used as confirmation of results obtained from the Nile red microscopic lipid determination. We anticipate that these techniques will become new standards in the field of C. elegans metabolic research.

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

We present robust biochemical and microscopic methods for studying Caenorhabditis elegans lipid stores. A rapid, simple, fixing-staining procedure for fluorescent lipid droplet imaging leverages the spectral properties of the lipophilic dye Nile red. We then present biochemical measurement of triglycerides and phospholipids using solid phase extraction and gas chromatography-mass spectrometry.

הערכה ביוכימית ותפוקה גבוהה מיקרוסקופית של מסת שומן ב<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

The nematode C. elegans has emerged as an important  model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as  it relates to human ...

Biology

Imaging and Analysis of Oil Red O-Stained Whole Aorta Lesions in an Aneurysm Hyperlipidemia Mouse Model

Apolipoprotein E (Apoe)- or low density lipoprotein receptor (Ldlr)-deficient hyperlipidemic mice are the two most commonly used models for atherosclerosis research. They are used to study the impact of a various genetic factors and different cell types on atherosclerotic lesion formation and as well as test the development of new therapies. Isolation, excision of the whole aorta, and quantification of Oil Red O-stained atherosclerotic lesions are basic morphometric methods used to evaluate atherosclerotic burden. The goal of this protocol is to describe an optimized, step-by-step surgical method to dissect, perfuse-fix, isolate, stain, image and analyze atherosclerotic lesions in mouse aortas with Oil Red O. Because atherosclerotic lesions can form anywhere in the entire aortic tree, this whole aorta Oil Red O staining method has the advantage of evaluating lipid-laden plaques in the entire aorta and all branches in a single mouse. In addition to Oil Red O staining, fresh isolated whole aortas can be used for variety of in vitro and in vivo experiments and cell isolations.

This protocol provides a step-by-step procedure to analyze atherosclerotic burden in mice. Investigators can use this protocol to compare the abundance, location, and size of atherosclerotic lesions in different animals.

הדמיה וניתוח של שמן אדום O מוכתם כולו אבי העורקים נגעים במודל עכבר היפרליפידמיה מפרצת

Apolipoprotein E (Apoe)- or low density lipoprotein receptor (Ldlr)-deficient hyperlipidemic mice are the two most commonly used models for ...

Determination of Fatty Acid Oxidation and Lipogenesis in Mouse Primary Hepatocytes

Lipid metabolism in liver is complex. In addition to importing and exporting lipid via lipoproteins, hepatocytes can oxidize lipid via fatty acid oxidation, or alternatively, synthesize new lipid via de novo lipogenesis. The net sum of these pathways is dictated by a number of factors, which in certain disease states leads to fatty liver disease. Excess hepatic lipid accumulation is associated with whole body insulin resistance and coronary heart disease. Tools to study lipid metabolism in hepatocytes are useful to understand the role of hepatic lipid metabolism in certain metabolic disorders.
In the liver, hepatocytes regulate the breakdown and synthesis of fatty acids via &#946;-fatty oxidation and de novo lipogenesis, respectively. Quantifying metabolism in these pathways provides insight into hepatic lipid handling. Unlike in vitro quantification, using primary hepatocytes, making measurements in vivo is technically challenging and resource intensive. Hence, quantifying &#946;-fatty acid oxidation and de novo lipogenesis in cultured mouse hepatocytes provides a straight forward method to assess hepatocyte lipid handling. 
Here we describe a method for the isolation of primary mouse hepatocytes, and we demonstrate quantification of &#946;-fatty acid oxidation and de novo lipogenesis, using radiolabeled substrates.

De novo lipogenesis and &#946;-fatty acid oxidation constitute key metabolic pathways in hepatocyte, pathways that are perturbed in several metabolic disorders, including fatty liver disease. Here we demonstrate isolation of mouse primary hepatocytes and describe quantification of &#946;-fatty acid oxidation and lipogenesis.

קביעת חומצות שומן החמצון וLipogenesis בעכבר העיקרי hepatocytes

Lipid metabolism in liver is complex. In addition to importing and exporting lipid via lipoproteins, hepatocytes can oxidize lipid via fatty acid ...

חקירת פתופיזיולוגיה HFpEF במודל עכבר המושרה על ידי היפרליפידמיה

A Murine Model of Hyperlipidemia&#45;Induced Heart Failure with Preserved Ejection Fraction

The pathophysiology of heart failure with preserved ejection fraction (HFpEF) driven by lipotoxicity is incompletely understood. Given the urgent need for animal models that accurately mimic cardio-metabolic HFpEF, a hyperlipidemia-induced murine model was developed by reverse engineering phenotypes seen in HFpEF patients. This model aimed to investigate HFpEF, focusing on the interplay between lipotoxicity and metabolic syndrome. Hyperlipidemia was induced in wild-type (WT) mice on a 129J strain background through bi-weekly intraperitoneal injections of poloxamer-407 (P-407), a block co-polymer that blocks lipoprotein lipase, combined with a single intravenous injection of adeno-associated virus 9-cardiac troponin T-low-density lipoprotein receptor (AAV9-cTnT-LDLR). Extensive assessments were conducted between 4 and 8 weeks post-treatment, including echocardiography, blood pressure recording, whole-body plethysmography, echocardiography (ECG) telemetry, activity wheel monitoring (AWM), and biochemical and histological analyses. The LDLR/P-407 mice exhibited distinctive features at four weeks, including diastolic dysfunction, preserved ejection fraction, and increased left ventricular wall thickness. Notably, blood pressure and renal function remained within normal ranges. Additionally, ECG and AWM revealed heart blocks and reduced activity, respectively. Diastolic function deteriorated at eight weeks, accompanied by a significant decline in respiratory rates. Further investigation into the double treatment model revealed elevated fibrosis, wet/dry lung ratios, and heart weight/body weight ratios. The LDLR/P-407 mice exhibited xanthelasmas, ascites, and cardiac ischemia. Interestingly, sudden deaths occurred between 6 and 12 weeks post-treatment. The murine HFpEF model offers a valuable and promising experimental resource for elucidating the intricacies of metabolic syndrome contributing to diastolic dysfunction within the context of lipotoxicity-mediated HFpEF.

מחבר זרקור: חקר הקשר בין ליפוטוקסיות ו- HFpEF 

This protocol presents a detailed approach to replicating a murine model of hyperlipidemia-induced heart failure with preserved ejection fraction (HFpEF). The design combines the administration of adeno-associated virus 9-cardiac troponin T-low-density lipoprotein receptor (AAV9-cTnT-LDLR) and poloxamer-407 (P-407).

מודל מורין של אי ספיקת לב הנגרמת על ידי היפרליפידמיה עם מקטע פליטה שמור

The pathophysiology of heart failure with preserved ejection fraction (HFpEF) driven by lipotoxicity is incompletely understood. Given the urgent need for ...

הערכת יכולת טיפול בליפידים בכל הגוף בעכברים

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

קביעת צפיפות צינור המרה בכבד העכבר

Shotgun Lipidomics של רקמות מכרסם

ניתוח אופטימלי של

קוונפיקציה של טרשת עורקים בעכברים

הרכב הגוף וניתוח מטבולית שכולאת בעכברים פד שומן גבוה

הערכה ביוכימית ותפוקה גבוהה מיקרוסקופית של מסת שומן ב

הדמיה וניתוח של שמן אדום O מוכתם כולו אבי העורקים נגעים במודל עכבר היפרליפידמיה מפרצת

קביעת חומצות שומן החמצון וLipogenesis בעכבר העיקרי hepatocytes

מודל מורין של אי ספיקת לב הנגרמת על ידי היפרליפידמיה עם מקטע פליטה שמור

מודל מורין של אי ספיקת לב הנגרמת על ידי היפרליפידמיה עם מקטע פליטה שמור