Name: assessing whole-body lipid-handling capacity in mice
Uploaded: 2020-11-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 57 s
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Diese Arbeit wird unterstützt von den National Institutes of Health (NIH), Grant R00-DK114498, und dem United States Department of Agriculture (USDA), Grant CRIS: 3092-51000-062 an Y. Z.

Die Tiere werden unter standardisierten Bedingungen nach Tierpflege- und Versuchsprotokollen untergebracht, die vom Institutional Animal Care and Use Committee des Baylor College of Medicine (BCM) genehmigt wurden. Die Tiere werden mit einer Standard- oder Spezialdiät gefüttert, Wasser ad libitum und mit einem 12-Stunden-Tag-Nacht-Zyklus gehalten.
1. Messung von Nüchternserumlipiden
<ol><li>Übertragen Sie mäuse nach 17 Uhr in einen neuen Käfig und schnell mit freiem Zugang zu Wasser, über Nacht (mit etwa 16 Stunden Fasten vor dem Experiment). Das Fasten über Nacht sorgt für eine vollständige Entleerung des Magen-Darm-Traktes der Mäuse. HINWEIS: Mäuse essen ihren Kot während des Fastens, so dass der Nahrungsentzug nicht sicherstellen kann, dass sie ausreichend gefastet werden.</li>
	<li>Am nächsten Morgen fassen Sie die Maus am Schwanz und legen Sie sie auf eine Oberfläche. Ziehen Sie den Mausschwanz vorsichtig zurück, um die Maus in den Rückhalteer zu legen. Setzen Sie die Nasenrückhalteeinrichtung ein, um die Bewegung der Maus neu zu trainieren, während die Maus weiterhin atmen kann. Ziehen Sie den Knopf der Nasenrückhalteeinrichtung fest. Überwachen Sie brustbeenden Bewegungen, um sicherzustellen, dass das Tier normal atmet und minimieren Sie die Zeit, die eine Maus in Rückhaltemitteln verbringt.</li>
	<li>Machen Sie einen oberflächlichen Schnitt (Nick) in der Schwanzvene der sich frei bewegenden Maus und ziehen Sie 25 μL Blut aus dem Schnitt in eine Glaskapillar (die etwa 1/3 der Kapillare füllt), ohne die Maus zurückzuhalten. Blasen Sie das Blut schnell in ein Mikrozentrifugenröhrchen.</li>
	<li>Stoppen Sie die Blutung mit Styptic-Pulvern, füllen Sie das Futter im Käfig auf und stellen Sie sicher, dass die Mäuse keine Anzeichen von Stress zeigen.</li>
	<li>Vervollständigen Sie den Blutentzug für alle Mäuse.</li>
	<li>Lassen Sie das Blut gerinnen, indem Sie es 1 Stunde lang ungestört bei Raumtemperatur lassen. Drehen Sie die geronnenen Blutproben bei 2.000 x g bei 4 °C für 10 Minuten in einer gekühlten Tischmikrozentrifuge und übertragen Sie den Überstand (Serum) zur Analyse. HINWEIS: Das Serum kann bis zur Analyse mehrere Wochen bei –20 °C gelagert werden. Zur Langzeitlagerung das Serum bei –70°C aufbewahren.</li>
	<li>Analysieren Sie jeden Lipidmetaboliten mit dem vom Hersteller bereitgestellten Protokoll.</li>
</ol>2. Oraler Intralipidtoleranztest
<ol><li>Nach 17 Uhr wiegen Sie die Mäuse für die Berechnung des Intralipidvolumens, das ihnen am nächsten Tag verabreicht werden soll. Dann die Mäuse in einen neuen Käfig bringen und sie über Nacht (16 Stunden) fasten.</li>
	<li>Markieren Sie am nächsten Morgen die Schwänze der Mäuse, die in einem Käfig untergebracht sind, um sie in den nachfolgenden Blutungsschritten zu identifizieren.</li>
	<li>Machen Sie einen Nick in der Schwanzvene und ziehen Sie 15 μL Blut aus dem Schnitt in eine Glaskapillar (die etwa 1/5 der Kapillare füllt) und blasen Sie das Blut schnell in ein Mikrozentrifugenröhrchen für T = 0 Serum. HINWEIS: Es besteht keine Notwendigkeit, die Blutung während des Tests zu stoppen, es sei denn, die Mäuse zeigen übermäßige Blutungen.</li>
	<li>Gavage Mäuse 20% Intralipid mit einer 18G Gavage Nadel in einem Verhältnis von 15 μl pro Gramm Körpergewicht, unter Verwendung des Körpergewichts vor dem Fasten. Stapeln Sie jede Maus um 1 Minute. HINWEIS: Wiegen Sie das Tier und bestimmen Sie die geeignete Nadelgröße. Im Allgemeinen ist eine 18-Gauge-Gavage-Nadel für Mäuse >25 g geeignet, und eine 20-22 Gauge-Gavage-Nadel wäre für kleinere Tiere besser geeignet. Schuppen Sie die Maus und greifen Sie die Haut über die Schultern, um den Kopf des Tieres an Ort und Stelle zu halten. Legen Sie die Nadel in den Mund und bewegen Sie sich dann vorsichtig am oberen Gaumen entlang, bis die Speiseröhre erreicht ist. Das Rohr sollte widerstandslos passieren. Sobald die richtige Tiefe erreicht ist, kann das Intralipid langsam verabreicht werden. Entfernen Sie die Nadel vorsichtig im gleichen Winkel während des Einführens der Nadel nach der Verwaltung des Intralipids. Bringen Sie das Tier in den Käfig zurück und überwachen Sie auf Anzeichen von Atemnot oder anderer Belastung. HINWEIS: Forscher, die mit oralen Gavage- oder Schwanzblutungstechniken unerfahren sind, können jede Maus um 2 Minuten oder sogar länger stapeln.</li>
	<li>Blut bei T = 1, 2, 3, 4, 5 und 6 Stunden ziehen: Ziehen Sie 15 μL Blut (1/5 Kapillare) pro Maus durch Schwanzblutungen und blasen Sie das Blut schnell in ein Mikrozentrifugenröhrchen.</li>
	<li>Drehen Sie die Blutproben bei 2.000 x g bei Raumtemperatur für 10 Minuten in einer Mikrozentrifuge. Den Überstand, einschließlich der schwimmenden Fettschicht, zur Lagerung in ein PCR-Röhrchen geben. Der Überstand kann bis zur Analyse mehrere Wochen bei –20 °C gelagert werden. HINWEIS: Der Überstand sollte Plasma sein. Wenn einige Proben zum Zeitpunkt der Zentrifugation bereits gerinnt haben, hat dies keinen Einfluss auf die Triglyceridmessung.</li>
	<li>Stoppen Sie nach der letzten Blutentnahme die Blutung mit stypischen Pulvern, füllen Sie das Futter im Käfig auf und stellen Sie sicher, dass die Mäuse keine Anzeichen von extremem Stress zeigen.</li>
	<li>Laden Sie 2 μL Triglyceridstandard und gesammelte Überstände in eine 96-Well-Platte.</li>
	<li>Fügen Sie 200 μL Triglyceridreagenz hinzu und lassen Sie die Platte für 5 Minuten bei 37 °C zur Farbentwicklung inkubieren.</li>
	<li>Messen Sie die Absorption bei 500 nm mit einer Referenzwellenlänge von 660 nm in einem Laborplattenleser und berechnen Sie die Konzentration der Probe.</li>
</ol>3. β3 Adrenerger Rezeptoragonist CL 316.243 Stimulierter Lipolyse-Assay
<ol><li>CL 316.243 als Stammlösung von 5 mg/ml (50x) in steriler Kochsalzlösung zubereiten und bis zur Verwendung bei –20 °C lagern.</li>
	<li>Wiegen Sie morgens die Mäuse, um die Menge an verdünnter CL 316.243-Lösung zu berechnen, die für das Experiment benötigt wird. Die Maus erhält 10 μL pro Gramm Körpergewicht von verdünntem CL 316.243 für eine Enddosis von 1 mg/kg Körpergewicht.</li>
	<li>Bringen Sie die Mäuse in einen neuen Käfig mit freiem Zugang zu Wasser und fasten Sie sie für 4 Stunden.</li>
	<li>Machen Sie genug 1x CL 316.243 Lösung aus 50x Vorrat mit Kochsalzlösung. Die Endkonzentration von 1x CL 316.243 Lösung beträgt 0,1 mg/ml. Verwenden Sie Kochsalzlösung für die Kontrollbehandlungsgruppe.</li>
	<li>Markieren Sie die Schwänze der Mäuse, die im selben Käfig untergebracht sind, um sie während der Blutungsschritte leicht zu identifizieren.</li>
	<li>Machen Sie einen Nick in der Schwanzvene und ziehen Sie 15 μL Blut aus dem Schnitt in eine Glaskapillar (die etwa 1/5 der Kapillare füllt) und blasen Sie das Blut schnell in ein Mikrozentrifugenröhrchen für T = 0 Probe. HINWEIS: Es besteht keine Notwendigkeit, die Blutung während des Tests zu stoppen, es sei denn, die Mäuse zeigen übermäßige Blutungen.</li>
	<li>Injiziert verdünnte CL 316.243-Lösung (oder Kontrolle, falls im Experiment enthalten) intraperitoneal bei einem Volumen von 10 μL/g Körpergewicht. Stapeln Sie jede Maus um 1 Minute. Verwenden Sie maximal 5 Mäuse für jedes 60-minütige Experiment oder 10 Mäuse für ein Zwei-Personen-Team.</li>
	<li>Blutentnahme bei T = 5, 15, 30, 60 Minuten: Entnahme von 15 μL Blut (1/5 Kapillare) pro Maus durch Schwanzblutung.</li>
	<li>Stoppen Sie nach der letzten Blutentnahme die Blutung mit stypischen Pulvern, füllen Sie das Futter im Käfig auf und stellen Sie sicher, dass die Mäuse keine Anzeichen von extremem Stress zeigen.</li>
	<li>Blutproben bei 2.000 x g bei 4 °C für 5 Minuten in einer gekühlten Mikrozentrifuge drehen. Übertragen Sie den Überstand zur Lagerung in eine PCR-Röhre. Der Überstand kann bis zur Analyse mehrere Wochen bei –20°C gelagert werden.</li>
	<li>Laden Sie 1 μL mit 2x seriell verdünnten Glycerinstandards (0,156, 0,312, 0,625, 1,25 und 2,5 mg/ml Trioleine-Äquivalentkonzentrationen) und gesammelten Überständen in eine 96-Well-Platte. Fügen Sie 100 μL freies Glycerinreagenz hinzu und lassen Sie die Platte 5 Minuten bei 37 °C inkubieren, damit sich die Farbe entwickeln kann.</li>
	<li>Messen Sie die Absorption bei 540 nm mit einem Laborplattenleser und berechnen Sie die Konzentration der Probe.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Dixon, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+chylomicron+uptake+into+lacteals.">Mechanisms of chylomicron uptake into lacteals.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1207, 52-57 (2010).</li><li>Nuno, J., de Oya, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipoprotein+lipase:+review.">Lipoprotein lipase: review.</a> Revista Cl&#237;nica Espa&#241;ola. 170 (3-4), 83-87 (1983).</li><li>Williams, K. 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Presentation of a new animal model and mechanistic studies in human Apo A-I transgenic and control mice.</a> Journal of Clinical Investigation. 91 (4), 1665-1671 (1993).</li><li>Hogarth, C. A., Roy, A., Ebert, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+evidence+for+the+absence+of+a+functional+cholesteryl+ester+transfer+protein+gene+in+mice+and+rats.">Genomic evidence for the absence of a functional cholesteryl ester transfer protein gene in mice and rats.</a> Comparative Biochemistry and Physiology - Part B: Biochemistry &amp; Molecular Biology. 135 (2), 219-229 (2003).</li><li>Tall, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functions+of+cholesterol+ester+transfer+protein+and+relationship+to+coronary+artery+disease+risk.">Functions of cholesterol ester transfer protein and relationship to coronary artery disease risk.</a> Journal of Clinical Lipidology. 4 (5), 389-393 (2010).</li><li>Singh, A. K., Singh, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triglyceride+and+cardiovascular+risk:+A+critical+appraisal.">Triglyceride and cardiovascular risk: A critical appraisal.</a> Indian Journal of Endocrinology and Metabolism. 20 (4), 418-428 (2016).</li><li>Miller, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triglycerides+and+cardiovascular+disease:+a+scientific+statement+from+the+American+Heart+Association.">Triglycerides and cardiovascular disease: a scientific statement from the American Heart Association.</a> Circulation. 123 (20), 2292-2333 (2011).</li><li>Dron, J. S., Hegele, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+Hypertriglyceridemia.">Genetics of Hypertriglyceridemia.</a> Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 11, 455 (2020).</li><li>Dole, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+relation+between+non-esterified+fatty+acids+in+plasma+and+the+metabolism+of+glucose.">A relation between non-esterified fatty acids in plasma and the metabolism of glucose.</a> Journal of Clinical Investigation. 35 (2), 150-154 (1956).</li><li>Bartelt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brown+adipose+tissue+activity+controls+triglyceride+clearance.">Brown adipose tissue activity controls triglyceride clearance.</a> Nature Medicine. 17 (2), 200-205 (2011).</li><li>de Souza, C. J., Burkey, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta+3-adrenoceptor+agonists+as+anti-diabetic+and+anti-obesity+drugs+in+humans.">Beta 3-adrenoceptor agonists as anti-diabetic and anti-obesity drugs in humans.</a> Current Pharmaceutical Design. 7 (14), 1433-1449 (2001).</li><li>Braun, K., Oeckl, J., Westermeier, J., Li, Y., Klingenspor, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-adrenergic+control+of+lipolysis+and+thermogenesis+in+adipose+tissues.">Non-adrenergic control of lipolysis and thermogenesis in adipose tissues.</a> Journal of Experimental Biology. 221, (2018).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preiszugeben.

Die drei beschriebenen Assays funktionieren robust im Labor, mit einigen kritischen Überlegungen. Das Fasten über Nacht ist für die Bestimmung des Nüchternserumlipidspiegels und des oralen Intralipidtoleranztests erforderlich. Für den oralen Intralipidtoleranztest ist es wichtig, das Blut bei Raumtemperatur zu drehen, um die Bildung einer Fettschicht zu minimieren, insbesondere an den 1- und 2-Stunden-Zeitpunkten; Es ist wichtig, diese Fettschicht nicht zu verwerfen, wenn sie sich bildet. Stellen Sie sicher, dass Si...

Kohlenhydrate und Lipide sind zwei Hauptsubstrate für den Energiestoffwechsel. Der aberrante Fettstoffwechsel führt zu vielen menschlichen Krankheiten, einschließlich Typ-II-Diabetes, Herz-Kreislauf-Erkrankungen, Fettlebererkrankungen und Krebs. Diätetische Lipide, hauptsächlich Triglyceride, werden durch den Darm in das Lymphsystem aufgenommen und gelangen in Chylomikronen in der Nähe des Herzens in den venösen Kreislauf1. Lipide werden durch Lipoproteinpartikel im Blutkreislauf transportiert, wo die Fettsäuren durch die Wirkung der Lipoproteinlipase an peripheren Organen wie Muskel- und Fettgewebe freigesetzt werden2. Die verbleibenden cholesterinreichen Restpartikel werden von der Leberbeseitigt 3. Mäuse wurden in Labors häufig als Forschungsmodell zur Untersuchung des Fettstoffwechsels verwendet. Mit umfassenden genetischen Toolsets und einem relativ kurzen Brutzyklus sind sie ein leistungsfähiges Modell für die Untersuchung, wie Lipide absorbiert, synthetisiert und metabolisiert werden.
Aufgrund der Komplexität des Fettstoffwechsels werden in der Regel ausgefeilte Lipidomik-Studien oder Isotopen-Tracer-Studien verwendet, um Sammlungen von Lipidspezies oder lipidbezogenen Stoffwechselflüssen und -schicksalen zu quantifizieren4,5. Dies stellt Forscher ohne spezielle Ausrüstung oder Fachwissen vor eine große Herausforderung. In diesem Artikel stellen wir drei Assays vor, die als erste Tests dienen können, bevor technisch anspruchsvolle Techniken eingesetzt werden. Sie sind nicht-terminale Verfahren für die Mäuse und daher sehr nützlich, um mögliche Unterschiede in der Lipid-Handling-Kapazität zu identifizieren und die betroffenen Prozesse einzugrenzen.
Erstens kann die Messung von Nüchternserumlipidmolekülen helfen, das Gesamtlipidprofil einer Maus zu bestimmen. Mäuse sollten gefastet werden, da viele Lipidarten nach den Mahlzeiten aufsteigen und das Ausmaß des Anstiegs stark von der Zusammensetzung der Ernährung beeinflusst wird. Viele Lipidmoleküle, einschließlich Gesamtcholesterin, Triglycerid und nicht veresterte Fettsäure (NEFA), können mit einem kommerziellen Kit und einem Plattenleser gemessen werden, der die Absorption ablesen kann.
Zweitens bewertet ein oraler Intralipidtoleranztest die Fähigkeit zur Lipidhandhabung als Nettoeffekt von Absorption und Stoffwechsel. Ein oral verabreichtes Intralipid verursacht einen Anstieg der zirkulierenden Triglyceridspiegel (1-2 Stunden), wonach der Serumtriglyceridspiegel auf basale Werte (4-6 Stunden) zurückkehrt. Dieser Assay gibt Aufschluss darüber, wie gut eine Maus mit den exogenen Lipiden umgehen kann. Herz, Leber und braunes Fettgewebe sind aktive Konsumenten von Triglyceriden, während weißes Fettgewebe es als Energiereserve speichert. Änderungen in diesen Funktionen führen zu Unterschieden in den Testergebnissen.
Schließlich gilt die Förderung der Lipolyse zur Mobilisierung gespeicherter Lipide als eine mögliche Strategie zur Gewichtsabnahme. Der β3-adrenerge Rezeptorsignalweg im Fettgewebe spielt eine wichtige Rolle bei der Adipozytenlipolyse, und die Humangenetik hat einen Funktionsverlust-Polymorphismus Trp64Arg im β3-adrenergen Rezeptor identifiziert, der mit Fettleibigkeit korreliert6. CL 316,243, ein spezifischer und potenter β3-adrenerger Rezeptoragonist, stimuliert die Fettgewebslipolyse und die Freisetzung von Glycerin. Die Bewertung der Reaktion einer Maus auf CL 316.243 kann wertvolle Informationen über die Entwicklung, Verbesserung und das Verständnis der Wirksamkeit der Verbindung liefern.
Zusammen können diese Tests als Ersterbst für Veränderungen im Lipidstoffwechselzustand von Mäusen verwendet werden. Sie werden aufgrund der Zugänglichkeit der Instrumente und Reagenzien ausgewählt. Mit den Ergebnissen dieser Assays können sich Forscher ein Gesamtbild über die metabolische Fitness ihrer Tiere machen und sich für ausgefeiltere und gezieltere Ansätze entscheiden.

<table><tbody><tr><td>20% Intralipid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I141</td><td></td></tr><tr><td>BD Slip Tip Sterile Syringes 1ml</td><td>Shaotong</td><td>B07F1KRMYN</td><td></td></tr><tr><td>CL 316,243 Hydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5976</td><td></td></tr><tr><td>Curved Feeding Needles (18 Gauge)</td><td>Kent Scientific</td><td>FNC-18-2-2</td><td></td></tr><tr><td>Free Glycerol Reagent</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F6428</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol Standard Solution</td><td>Sigma</td><td>G7793</td><td></td></tr><tr><td>HR SERIES NEFA-HR(2)COLOR REAGENT A</td><td>Fujifilm Wako Diagnostics</td><td>999-34691</td><td></td></tr><tr><td>HR SERIES NEFA-HR(2)COLOR REAGENT B</td><td>Fujifilm Wako Diagnostics</td><td>991-34891</td><td></td></tr><tr><td>HR SERIES NEFA-HR(2)SOLVENT A</td><td>Fujifilm Wako Diagnostics</td><td>995-34791</td><td></td></tr><tr><td>HR SERIES NEFA-HR(2)SOLVENT B</td><td>Fujifilm Wako Diagnostics</td><td>993-35191</td><td></td></tr><tr><td>Matrix Plus Chemistry Reference Kit</td><td>Verichem</td><td>9500</td><td></td></tr><tr><td>Micro Centrifuge Tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-222-168</td><td></td></tr><tr><td>Microhematrocrit Capillary Tube, Not Heparanized</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-362-574</td><td></td></tr><tr><td>NEFA STANDARD SOLUTION</td><td>Fujifilm Wako Diagnostics</td><td>276-76491</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline</td><td>Boston Bioproducts</td><td>BM-220</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Triglycerides Reagent</td><td>Fisher Scientific</td><td>TR22421</td><td></td></tr><tr><td>Total Cholesterol Reagents</td><td>Thermo Scientifi</td><td>TR13421</td><td></td></tr></tbody></table>

assessing whole-body lipid-handling capacity in mice

Die Beurteilung des Fettstoffwechsels ist ein Eckpfeiler der Bewertung der Stoffwechselfunktion und wird als wesentlich für In-vivo-Stoffwechselstudien angesehen. Lipide sind eine Klasse von vielen verschiedenen Molekülen mit vielen Wegen, die an ihrer Synthese und ihrem Stoffwechsel beteiligt sind. Ein Ausgangspunkt für die Bewertung der Lipidmesmostase für die Ernährungs- und Adipositasforschung ist erforderlich. Dieses Papier beschreibt drei einfache und zugängliche Methoden, die wenig Fachwissen oder Übung erfordern und die von den meisten Labors angepasst werden können, um nach Fettstoffwechselanomalien bei Mäusen zu suchen. Diese Methoden sind (1) die Messung mehrerer Nüchternserumlipidmoleküle mit kommerziellen Kits, (2) die Bestimmung der diätetischen Lipidhandhabungsfähigkeit durch einen oralen Intralipidtoleranztest und (3) die Bewertung der Reaktion auf eine pharmazeutische Verbindung, CL 316.243, bei Mäusen. Zusammen werden diese Methoden einen Überblick über die Lipidhandhabungsfähigkeit bei Mäusen bieten.

Wir zeigen mit drei Ausschnitten, dass jeder Assay wertvolle Informationen über den Fettstoffwechsel der Mäuse bietet. Bei männlichen C57BL/6J-Mäusen, die durch acht Wochen fettreiche Ernährung (HFD) ab einem Alter von acht Wochen herausgefordert wurden, war der Gesamtcholesterinspiegel signifikant erhöht, während Serumtriglyycerid und NEFA nicht waren (Tabelle 1), was darauf hindeutet, dass Triglycerid und NEFA im Blut nicht überwiegend durch eine diätetische Fettherausforderung reguliert werde...

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Assessing Whole-Body Lipid-Handling Capacity in Mice

Dieses Papier bietet drei einfache und zugängliche Assays zur Beurteilung des Fettstoffwechsels bei Mäusen.

Beurteilung der Ganzkörper-Lipid-Handling-Kapazität bei Mäusen

Assessing lipid metabolism is a cornerstone of evaluating metabolic function, and it is considered essential for in vivo metabolism studies. Lipids are a ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Medicine

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Serie: Assessing Whole-Body Lipid-Handling Capacity in Mice

Determining Bile Duct Density in the Mouse Liver

Mouse is broadly used as a model organism to study biliary diseases. To evaluate the development and function of the biliary system, various techniques are used, including serum chemistry, histological analysis, and immunostaining for specific markers. Although these techniques can provide important information about the biliary system, they often do not present a full picture of bile duct (BD) developmental defects across the whole liver. This is in part due to the robust ability of the mouse liver to drain the bile even in animals with significant impairment in biliary development. Here we present a simple method to calculate the average number of BDs associated with each portal vein (PV) in sections covering all lobes of mutant/transgenic mice. In this method, livers are mounted and sectioned in a stereotypic manner to facilitate comparison among various genotypes and experimental conditions. BDs are identified via light microscopy of cytokeratin-stained cholangiocytes, and then counted and divided by the total number of PVs present in liver section. As an example, we show how this method can clearly distinguish between wild-type mice and a mouse model of Alagille syndrome. The method presented here cannot substitute for techniques that visualize the three-dimensional structure of the biliary tree. However, it offers an easy and direct way to quantitatively assess BD development and the degree of ductular reaction formation in mice.

We present a rather simple and sensitive method for accurate quantification of bile duct density in the mouse liver. This method can aid in determining the effects of genetic and environmental modifiers and the effectiveness of potential therapies in mouse models of biliary diseases.

Bestimmung der Gallengangsdichte in der Mausleber

Mouse is broadly used as a model organism to study biliary diseases. To evaluate the development and function of the biliary system, various techniques ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Shotgun Lipidomics of Rodent Tissues

Lipids play a vital role as essential components of all prokaryotic and eukaryotic cells. Constant technological improvements in mass spectrometry have made lipidomics a powerful analytical tool for monitoring tissue lipidome compositions in homeostatic as well as disease states. This paper presents a step-by-step protocol for a shotgun lipid analysis method that supports the simultaneous detection and quantification of a few hundred molecular lipid species in different tissue and biofluid samples at high throughput. This method leverages automated nano-flow direct injection of a total lipid extract spiked with labeled internal standards without chromatographic separation into a high-resolution mass spectrometry instrument. Starting from sub-microgram amounts of rodent tissue, the MS analysis takes 10 min per sample and covers up to 400 lipids from 14 lipid classes in mouse lung tissue. The method presented here is well suited for studying disease mechanisms and identifying and quantifying biomarkers that indicate early toxicity or beneficial effects within rodent tissues.

Shotgun mass spectrometry-based lipidomics delivers a sensitive quantitative snapshot of a broad spectrum of lipid classes simultaneously in a single measurement from various rodent tissues.

Schrotflinten-Lipidomik von Nagetiergewebe

Lipids play a vital role as essential components of all prokaryotic and eukaryotic cells. Constant technological improvements in mass spectrometry have ...

Biochemie

Optimized Analysis of In Vivo and In Vitro Hepatic Steatosis

Establishing a system of procedures to qualitatively and quantitatively characterize in vivo and in vitro hepatic steatosis is important for metabolic study in the liver. Here, numerous assays are described to comprehensively measure the phenotype and parameters of hepatic steatosis in mouse and hepatocyte models. 
Combining the physiological, histological, and biochemical methods, this system can be used to assess the progress of hepatic steatosis. In vivo, the measurements of body weight and nuclear magnetic resonance (NMR) provide a general understanding of mice in a non-invasive manner. Hematoxylin and Eosin (H&amp;E) and Oil Red O staining determine the histological morphology and lipid deposition of liver tissue under nutrient overload conditions, such as high-fat diet feeding. Next, the total lipid contents are isolated by chloroform/methanol extraction, which are followed by a biochemical analysis for triglyceride and cholesterol. Moreover, mouse primary hepatocytes are treated with high glucose plus insulin to stimulate lipid accumulation, an efficient in vitro model to mimic diet-induced hyperglycemia and hyperinsulinemia in vivo. Then, the lipid deposition is measured by Oil Red O staining and chloroform/methanol extraction. Oil Red O staining determines intuitive hepatic steatotic phenotypes, while the lipid extraction analysis determines the parameters that can be analyzed statistically. The present protocols are of interest to scientists in the fields of fatty liver diseases, insulin resistance, and type 2 diabetes.

Optimized Analysis of In Vivo and In Vitro Hepatic Steatosis

Here, optimized methods to generate in vivo and in vitro models of hepatic steatosis and to analyze the steatotic phenotypes and related physiological parameters are described.

Optimierte Analyse von<em&gt; In Vivo</em&gt; und<em&gt; In Vitro</em&gt; Hepatosteatose

Establishing a system of procedures to qualitatively and quantitatively characterize in vivo and in vitro hepatic steatosis is important for metabolic ...

Medizin

Quantification of Atherosclerosis in Mice

Cardiovascular disease is the main cause of death in the world. The underlying cause in most cases is atherosclerosis, which is in part a chronic inflammatory disease. Experimental atherosclerosis studies have elucidated the role of cholesterol and inflammation in the disease process. This has led to successful clinical trials with pharmaceutical agents that reduce clinical manifestations of atherosclerosis. Careful and well-controlled experiments in mouse models of the disease could further elucidate the pathogenesis of the disease, which is not fully understood. Standardized lesion analysis is important to reduce experimental variability and increase reproducibility. Determining lesion size in aortic root, aortic arch, and brachiocephalic artery are common endpoints in experimental atherosclerosis. This protocol provides a technical description for evaluation of atherosclerosis at all these sites in a single mouse. The protocol is particularly useful when material is limited, as is frequently the case when genetically modified animals are being characterized.

Murine models of atherosclerosis are useful tools to investigate pathogenic pathways on a molecular level, but require standardized quantification of lesion development. This protocol describes an optimized method to determine lesion size in the major arterial vessels including the aortic root, aortic arch, and brachiocephalic artery.

Quantifizierung von Atherosklerose bei Mäusen

Cardiovascular disease is the main cause of death in the world. The underlying cause in most cases is atherosclerosis, which is in part a chronic ...

Immunologie und Infektion

Body Composition and Metabolic Caging Analysis in High Fat Fed Mice

Alterations to body composition (fat or lean mass), metabolic parameters such as whole-body oxygen consumption, energy expenditure, and substrate utilization, and behaviors such as food intake and physical activity can provide important information regarding the underlying mechanisms of disease. Given the importance of body composition and metabolism to the development of obesity and its subsequent sequelae, it is necessary to make accurate measures of these parameters in the pre-clinical research setting. Advances in technology over the past few decades have made it possible to derive these measures in rodent models in a non-invasive and longitudinal fashion. Consequently, these metabolic measures have proven useful when assessing the response of genetic manipulations (for example knockout or transgenic mice, viral knock-down or overexpression of genes), experimental drug/compound screening and dietary, behavioral or physical activity interventions. Herein, we describe the protocols used to measure body composition and metabolic parameters using an animal monitoring system in chow-fed and high fat diet-fed mice.

This protocol describes the use of a body composition analyzer and metabolic animal monitoring system to characterize body composition and metabolic parameters in mice. An obesity model induced by high-fat feeding is used as an example for the application of these techniques.

Körperzusammensetzung und festsetzende Stoffwechselanalyse bei hohen Fett Fed Mäusen

Alterations to body composition (fat or lean mass), metabolic parameters such as whole-body oxygen consumption, energy expenditure, and substrate ...

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

The nematode C. elegans has emerged as an important model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as it relates to human obesity and its associated pathologies. Several previous methodologies developed for the visualization of C. elegans triglyceride-rich fat stores have proven to be erroneous, highlighting cellular compartments other than lipid droplets. Other methods require specialized equipment, are time-consuming, or yield inconsistent results. We introduce a rapid, reproducible, fixative-based Nile red staining method for the accurate and rapid detection of neutral lipid droplets in C. elegans. A short fixation step in 40% isopropanol makes animals completely permeable to Nile red, which is then used to stain animals. Spectral properties of this lipophilic dye allow it to strongly and selectively fluoresce in the yellow-green spectrum only when in a lipid-rich environment, but not in more polar environments. Thus, lipid droplets can be visualized on a fluorescent microscope equipped with simple GFP imaging capability after only a brief Nile red staining step in isopropanol. The speed, affordability, and reproducibility of this protocol make it ideally suited for high throughput screens. We also demonstrate a paired method for the biochemical determination of triglycerides and phospholipids using gas chromatography mass-spectrometry. This more rigorous protocol should be used as confirmation of results obtained from the Nile red microscopic lipid determination. We anticipate that these techniques will become new standards in the field of C. elegans metabolic research.

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

We present robust biochemical and microscopic methods for studying Caenorhabditis elegans lipid stores. A rapid, simple, fixing-staining procedure for fluorescent lipid droplet imaging leverages the spectral properties of the lipophilic dye Nile red. We then present biochemical measurement of triglycerides and phospholipids using solid phase extraction and gas chromatography-mass spectrometry.

Biochemische und High Throughput Mikroskopische Beurteilung der Fettmasse in<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

The nematode C. elegans has emerged as an important  model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as  it relates to human ...

Biologie

Imaging and Analysis of Oil Red O-Stained Whole Aorta Lesions in an Aneurysm Hyperlipidemia Mouse Model

Apolipoprotein E (Apoe)- or low density lipoprotein receptor (Ldlr)-deficient hyperlipidemic mice are the two most commonly used models for atherosclerosis research. They are used to study the impact of a various genetic factors and different cell types on atherosclerotic lesion formation and as well as test the development of new therapies. Isolation, excision of the whole aorta, and quantification of Oil Red O-stained atherosclerotic lesions are basic morphometric methods used to evaluate atherosclerotic burden. The goal of this protocol is to describe an optimized, step-by-step surgical method to dissect, perfuse-fix, isolate, stain, image and analyze atherosclerotic lesions in mouse aortas with Oil Red O. Because atherosclerotic lesions can form anywhere in the entire aortic tree, this whole aorta Oil Red O staining method has the advantage of evaluating lipid-laden plaques in the entire aorta and all branches in a single mouse. In addition to Oil Red O staining, fresh isolated whole aortas can be used for variety of in vitro and in vivo experiments and cell isolations.

This protocol provides a step-by-step procedure to analyze atherosclerotic burden in mice. Investigators can use this protocol to compare the abundance, location, and size of atherosclerotic lesions in different animals.

Bildgebung und Analyse von ölrot-o-gefärbten ganzen Aortenläsionen in einem Aneurysma-Hyperlipidämie-Mausmodell

Apolipoprotein E (Apoe)- or low density lipoprotein receptor (Ldlr)-deficient hyperlipidemic mice are the two most commonly used models for ...

Determination of Fatty Acid Oxidation and Lipogenesis in Mouse Primary Hepatocytes

Lipid metabolism in liver is complex. In addition to importing and exporting lipid via lipoproteins, hepatocytes can oxidize lipid via fatty acid oxidation, or alternatively, synthesize new lipid via de novo lipogenesis. The net sum of these pathways is dictated by a number of factors, which in certain disease states leads to fatty liver disease. Excess hepatic lipid accumulation is associated with whole body insulin resistance and coronary heart disease. Tools to study lipid metabolism in hepatocytes are useful to understand the role of hepatic lipid metabolism in certain metabolic disorders.
In the liver, hepatocytes regulate the breakdown and synthesis of fatty acids via &#946;-fatty oxidation and de novo lipogenesis, respectively. Quantifying metabolism in these pathways provides insight into hepatic lipid handling. Unlike in vitro quantification, using primary hepatocytes, making measurements in vivo is technically challenging and resource intensive. Hence, quantifying &#946;-fatty acid oxidation and de novo lipogenesis in cultured mouse hepatocytes provides a straight forward method to assess hepatocyte lipid handling. 
Here we describe a method for the isolation of primary mouse hepatocytes, and we demonstrate quantification of &#946;-fatty acid oxidation and de novo lipogenesis, using radiolabeled substrates.

De novo lipogenesis and &#946;-fatty acid oxidation constitute key metabolic pathways in hepatocyte, pathways that are perturbed in several metabolic disorders, including fatty liver disease. Here we demonstrate isolation of mouse primary hepatocytes and describe quantification of &#946;-fatty acid oxidation and lipogenesis.

Bestimmung der Fettsäureoxidation und Lipogenese in Maus primären Hepatozyten

Lipid metabolism in liver is complex. In addition to importing and exporting lipid via lipoproteins, hepatocytes can oxidize lipid via fatty acid ...

Untersuchung der HFpEF-Pathophysiologie in einem Hyperlipidämie-induzierten Mausmodell

A Murine Model of Hyperlipidemia&#45;Induced Heart Failure with Preserved Ejection Fraction

The pathophysiology of heart failure with preserved ejection fraction (HFpEF) driven by lipotoxicity is incompletely understood. Given the urgent need for animal models that accurately mimic cardio-metabolic HFpEF, a hyperlipidemia-induced murine model was developed by reverse engineering phenotypes seen in HFpEF patients. This model aimed to investigate HFpEF, focusing on the interplay between lipotoxicity and metabolic syndrome. Hyperlipidemia was induced in wild-type (WT) mice on a 129J strain background through bi-weekly intraperitoneal injections of poloxamer-407 (P-407), a block co-polymer that blocks lipoprotein lipase, combined with a single intravenous injection of adeno-associated virus 9-cardiac troponin T-low-density lipoprotein receptor (AAV9-cTnT-LDLR). Extensive assessments were conducted between 4 and 8 weeks post-treatment, including echocardiography, blood pressure recording, whole-body plethysmography, echocardiography (ECG) telemetry, activity wheel monitoring (AWM), and biochemical and histological analyses. The LDLR/P-407 mice exhibited distinctive features at four weeks, including diastolic dysfunction, preserved ejection fraction, and increased left ventricular wall thickness. Notably, blood pressure and renal function remained within normal ranges. Additionally, ECG and AWM revealed heart blocks and reduced activity, respectively. Diastolic function deteriorated at eight weeks, accompanied by a significant decline in respiratory rates. Further investigation into the double treatment model revealed elevated fibrosis, wet/dry lung ratios, and heart weight/body weight ratios. The LDLR/P-407 mice exhibited xanthelasmas, ascites, and cardiac ischemia. Interestingly, sudden deaths occurred between 6 and 12 weeks post-treatment. The murine HFpEF model offers a valuable and promising experimental resource for elucidating the intricacies of metabolic syndrome contributing to diastolic dysfunction within the context of lipotoxicity-mediated HFpEF.

Autor im Rampenlicht: Erforschung des Zusammenhangs zwischen Lipotoxizität und HFpEF 

This protocol presents a detailed approach to replicating a murine model of hyperlipidemia-induced heart failure with preserved ejection fraction (HFpEF). The design combines the administration of adeno-associated virus 9-cardiac troponin T-low-density lipoprotein receptor (AAV9-cTnT-LDLR) and poloxamer-407 (P-407).

Ein Mausmodell der Hyperlipidämie-induzierten Herzinsuffizienz mit erhaltener Ejektionsfraktion

The pathophysiology of heart failure with preserved ejection fraction (HFpEF) driven by lipotoxicity is incompletely understood. Given the urgent need for ...

Beurteilung der Ganzkörper-Lipid-Handling-Kapazität bei Mäusen

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Bestimmung der Gallengangsdichte in der Mausleber

Schrotflinten-Lipidomik von Nagetiergewebe

Optimierte Analyse von

Quantifizierung von Atherosklerose bei Mäusen

Körperzusammensetzung und festsetzende Stoffwechselanalyse bei hohen Fett Fed Mäusen

Biochemische und High Throughput Mikroskopische Beurteilung der Fettmasse in

Bildgebung und Analyse von ölrot-o-gefärbten ganzen Aortenläsionen in einem Aneurysma-Hyperlipidämie-Mausmodell

Bestimmung der Fettsäureoxidation und Lipogenese in Maus primären Hepatozyten

Ein Mausmodell der Hyperlipidämie-induzierten Herzinsuffizienz mit erhaltener Ejektionsfraktion

Ein Mausmodell der Hyperlipidämie-induzierten Herzinsuffizienz mit erhaltener Ejektionsfraktion