Name: assessing whole-body lipid-handling capacity in mice
Uploaded: 2020-11-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 57 s
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Ce travail est soutenu par les National Institutes of Health (NIH), subvention R00-DK114498, et le Département de l’agriculture des États-Unis (USDA), subvention CRIS: 3092-51000-062 à Y. Z.

Les animaux sont logés dans des conditions normalisées selon des protocoles de soins et d’expérimentation approuvés par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux du Baylor College of Medicine (BCM). Les animaux sont nourris avec un régime alimentaire standard ou spécial, de l’eau ad libitum, et gardés avec un cycle jour/nuit de 12 heures.
1. Mesure des lipides sériques à jeun
<ol><li>Transférer les souris dans une nouvelle cage après 17 heures et rapidement avec un accès libre à l’eau, pendant la nuit (avec environ 16 heures de jeûne avant l’expérience). Le jeûne nocturne assure la vidange complète du tractus gastro-intestinal des souris. REMARQUE: Les souris mangent leurs excréments pendant le jeûne, de sorte que le sevrage alimentaire ne peut pas garantir qu’ils sont correctement à jeun.</li>
	<li>Le lendemain matin, saisissez la souris par la queue et placez-la sur une surface. Tirez doucement sur la queue de la souris pour placer la souris dans le frein. Placez le dispositif de retenue nasale pour réentraîner le mouvement de la souris tout en permettant à la souris de respirer. Serrez le bouton du dispositif de retenue nasale. Surveillez les mouvements de la poitrine pour vous assurer que l’animal respire normalement et minimisez le temps qu’une souris passe dans les contentions.</li>
	<li>Faites une incision superficielle (entaille) dans la veine caudale de la souris en mouvement libre et tirez 25 μL de sang de l’incision dans un capillaire en verre (remplissant environ 1/3 du capillaire) sans retenir la souris. Soufflez rapidement le sang dans un tube de microcentrifugation.</li>
	<li>Arrêtez le saignement en utilisant des poudres styptiques, remplissez l’aliment dans la cage et assurez-vous que les souris ne montrent aucun signe de stress.</li>
	<li>Complétez le prélèvement sanguin pour toutes les souris.</li>
	<li>Laissez le sang coaguler en le laissant intact à température ambiante pendant 1 heure. Faire tourner les échantillons de sang coagulé à 2 000 x g à 4 °C pendant 10 minutes dans une microcentrifugeuse de paillasse réfrigérée et transférer le surnageant (sérum) pour analyse. REMARQUE: Le sérum peut être conservé à -20 ° C pendant plusieurs semaines jusqu’à l’analyse. Pour un stockage à long terme, conservez le sérum à –70°C.</li>
	<li>Analysez chaque métabolite lipidique à l’aide du protocole fourni par le fabricant.</li>
</ol>2. Test de tolérance intralipidique orale
<ol><li>Après 17 heures, peser les souris pour le calcul du volume intralipidique à leur donner le lendemain. Ensuite, transférez les souris dans une nouvelle cage et jeûnez-les pendant la nuit (16 heures).</li>
	<li>Le lendemain matin, marquez les queues des souris logées dans une cage pour aider à les identifier dans les étapes de saignement suivantes.</li>
	<li>Faites une entaille dans la veine de la queue et tirez 15 μL de sang de l’incision dans un capillaire en verre (remplissant environ 1/5 du capillaire), et soufflez rapidement le sang dans un tube de microcentrifugation pour T = 0 sérum. REMARQUE: Il n’est pas nécessaire d’arrêter le saignement pendant le test, sauf si les souris présentent un saignement excessif.</li>
	<li>Souris Gavage 20% intralipides à l’aide d’une aiguille gavage 18G à un rapport de 15 μl par gramme de poids corporel, en utilisant le poids corporel pré-jeûne. Empilez chaque souris de 1 minute. REMARQUE: Pesez l’animal et déterminez la taille appropriée de l’aiguille de gavage. Généralement, une aiguille de gavage de calibre 18 convient aux souris >25 g, et une aiguille de gavage de calibre 20-22 serait plus appropriée pour les petits animaux. Frottez la souris, en saisissant la peau sur les épaules pour maintenir la tête de l’animal en place. Placez l’aiguille de gavage dans la bouche, puis avancez doucement le long du palais supérieur, jusqu’à ce que l’œsophage soit atteint. Le tube doit passer sans résistance. Une fois la profondeur appropriée atteinte, l’intralipide peut être administré lentement. Retirez doucement l’aiguille en suivant le même angle lors de l’insertion de l’aiguille après administration de l’intralipide. Revez l’animal dans la cage et surveillez les signes de respiration laborieuse ou d’autres détresses. REMARQUE: Les chercheurs qui n’ont pas d’expérience avec les techniques de gavage oral ou de saignement de la queue peuvent empiler chaque souris de 2 minutes ou même plus.</li>
	<li>Prélever du sang à T = 1, 2, 3, 4, 5 et 6 heures : Prélever 15 μL de sang (1/5 capillaire) par souris en saignant la queue et souffler rapidement le sang dans un tube de microcentrifugation.</li>
	<li>Faire tourner les échantillons de sang à 2 000 x g à température ambiante pendant 10 minutes dans une microcentrifugeuse. Transférer le surnageant, y compris la couche de graisse flottante, dans un tube PCR pour le stockage. Le surnageant peut être conservé à –20 °C pendant plusieurs semaines jusqu’à l’analyse. REMARQUE: Le surnageant doit être du plasma. Si certains échantillons ont déjà coagulé au moment de la centrifugation, cela n’affecte pas la mesure des triglycérides.</li>
	<li>Après la dernière collecte de sang, arrêtez le saignement à l’aide de poudres styptiques, remplissez l’aliment dans la cage et assurez-vous que les souris ne montrent aucun signe de stress extrême.</li>
	<li>Chargez 2 μL de triglycérides étalons et de surnageants collectés dans une plaque de 96 puits.</li>
	<li>Ajouter 200 μL de réactif triglycérides et laisser la plaque incuber pendant 5 minutes à 37 °C pour le développement de la couleur.</li>
	<li>Mesurez l’absorbance à 500 nm avec une longueur d’onde de référence de 660 nm dans un lecteur de plaques de laboratoire et calculez la concentration de l’échantillon.</li>
</ol>3. β3 Agoniste des récepteurs adrénergiques CL 316 243 Test de lipolyse stimulé
<ol><li>Préparer CL 316,243 sous forme de solution type de 5 mg/mL (50x) dans une solution saline stérile et conserver à -20 °C jusqu’à utilisation.</li>
	<li>Le matin, pesez les souris pour calculer la quantité de solution diluée de CL 316 243 nécessaire à l’expérience. La souris recevra 10 μL par gramme de poids corporel de CL 316 243 dilué, pour une dose finale de 1 mg/kg de poids corporel.</li>
	<li>Transférez les souris dans une nouvelle cage avec un accès libre à l’eau et jeûnez-les pendant 4 heures.</li>
	<li>Faire suffisamment de 1x CL 316,243 solution à partir de 50x stock en utilisant une solution saline. La concentration finale de 1x CL 316,243 solution est de 0,1 mg/mL. Utilisez une solution saline pour le groupe de traitement témoin.</li>
	<li>Marquez la queue des souris logées dans la même cage pour une identification facile pendant les étapes de saignement.</li>
	<li>Faites une entaille dans la veine caudale et tirez 15 μL de sang de l’incision dans un capillaire en verre (remplissant environ 1/5 du capillaire), puisez rapidement le sang dans un tube de microcentrifugation pour T = 0 échantillon. REMARQUE: Il n’est pas nécessaire d’arrêter le saignement pendant le test, sauf si les souris présentent un saignement excessif.</li>
	<li>Injecter une solution diluée de CL 316 243 (ou un témoin si inclus dans l’expérience) par voie intrapéritonéale à un volume de 10 μL/g de poids corporel. Empilez chaque souris de 1 minute. Utilisez un maximum de 5 souris pour chaque expérience de 60 minutes, ou 10 souris pour une équipe de deux personnes.</li>
	<li>Prélever du sang à T = 5, 15, 30, 60 minutes : prélever 15 μL de sang (1/5 capillaire) par souris par saignement de la queue.</li>
	<li>Après la dernière collecte de sang, arrêtez le saignement à l’aide de poudres styptiques, remplissez l’aliment dans la cage et assurez-vous que les souris ne montrent aucun signe de stress extrême.</li>
	<li>Faire tourner les échantillons de sang à 2 000 x g à 4 °C pendant 5 minutes dans une microcentrifugeuse réfrigérée. Transférez le surnageant dans un tube PCR pour le stockage. Le surnageant peut être conservé à -20°C pendant plusieurs semaines jusqu’à l’analyse.</li>
	<li>Charger 1 μL de 2x étalons de glycérol dilués en série (concentrations équivalentes à la trioléine de 0,156, 0,312, 0,625, 1,25 et 2,5 mg/ml d’équivalent trioléine) et recueillir les surnageants dans une plaque de 96 puits. Ajouter 100 μL de réactif glycérol libre et laisser la plaque incuber pendant 5 minutes à 37 °C pour que la couleur se développe.</li>
	<li>Mesurez l’absorbance à 540 nm à l’aide d’un lecteur de plaques de laboratoire et calculez la concentration de l’échantillon.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Dixon, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+chylomicron+uptake+into+lacteals.">Mechanisms of chylomicron uptake into lacteals.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1207, 52-57 (2010).</li><li>Nuno, J., de Oya, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipoprotein+lipase:+review.">Lipoprotein lipase: review.</a> Revista Cl&#237;nica Espa&#241;ola. 170 (3-4), 83-87 (1983).</li><li>Williams, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+processes+that+handle+--+and+mishandle+--+dietary+lipids.">Molecular processes that handle -- and mishandle -- dietary lipids.</a> Journal of Clinical Investigation. 118 (10), 3247-3259 (2008).</li><li>Burla, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MS-based+lipidomics+of+human+blood+plasma:+a+community-initiated+position+paper+to+develop+accepted+guidelines.">MS-based lipidomics of human blood plasma: a community-initiated position paper to develop accepted guidelines.</a> Journal of Lipid Research. 59 (10), 2001-2017 (2018).</li><li>Umpleby, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormone+measurement+guidelines:+Tracing+lipid+metabolism:+the+value+of+stable+isotopes.">Hormone measurement guidelines: Tracing lipid metabolism: the value of stable isotopes.</a> Journal of Endocrinology. 226 (3), 1-10 (2015).</li><li>Mitchell, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+paired+sibling+analysis+of+the+beta-3+adrenergic+receptor+and+obesity+in+Mexican+Americans.">A paired sibling analysis of the beta-3 adrenergic receptor and obesity in Mexican Americans.</a> Journal of Clinical Investigation. 101 (3), 584-587 (1998).</li><li>Mahoney, L. B., Denny, C. A., Seyfried, T. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caloric+restriction+in+C57BL/6J+mice+mimics+therapeutic+fasting+in+humans.">Caloric restriction in C57BL/6J mice mimics therapeutic fasting in humans.</a> Lipids in Health and Disease. 5, 13 (2006).</li><li>Hayek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dietary+fat+increases+high+density+lipoprotein+(HDL)+levels+both+by+increasing+the+transport+rates+and+decreasing+the+fractional+catabolic+rates+of+HDL+cholesterol+ester+and+apolipoprotein+(Apo)+A-I.+Presentation+of+a+new+animal+model+and+mechanistic+studies+in+human+Apo+A-I+transgenic+and+control+mice.">Dietary fat increases high density lipoprotein (HDL) levels both by increasing the transport rates and decreasing the fractional catabolic rates of HDL cholesterol ester and apolipoprotein (Apo) A-I. Presentation of a new animal model and mechanistic studies in human Apo A-I transgenic and control mice.</a> Journal of Clinical Investigation. 91 (4), 1665-1671 (1993).</li><li>Hogarth, C. A., Roy, A., Ebert, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+evidence+for+the+absence+of+a+functional+cholesteryl+ester+transfer+protein+gene+in+mice+and+rats.">Genomic evidence for the absence of a functional cholesteryl ester transfer protein gene in mice and rats.</a> Comparative Biochemistry and Physiology - Part B: Biochemistry &amp; Molecular Biology. 135 (2), 219-229 (2003).</li><li>Tall, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functions+of+cholesterol+ester+transfer+protein+and+relationship+to+coronary+artery+disease+risk.">Functions of cholesterol ester transfer protein and relationship to coronary artery disease risk.</a> Journal of Clinical Lipidology. 4 (5), 389-393 (2010).</li><li>Singh, A. K., Singh, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triglyceride+and+cardiovascular+risk:+A+critical+appraisal.">Triglyceride and cardiovascular risk: A critical appraisal.</a> Indian Journal of Endocrinology and Metabolism. 20 (4), 418-428 (2016).</li><li>Miller, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triglycerides+and+cardiovascular+disease:+a+scientific+statement+from+the+American+Heart+Association.">Triglycerides and cardiovascular disease: a scientific statement from the American Heart Association.</a> Circulation. 123 (20), 2292-2333 (2011).</li><li>Dron, J. S., Hegele, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+Hypertriglyceridemia.">Genetics of Hypertriglyceridemia.</a> Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 11, 455 (2020).</li><li>Dole, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+relation+between+non-esterified+fatty+acids+in+plasma+and+the+metabolism+of+glucose.">A relation between non-esterified fatty acids in plasma and the metabolism of glucose.</a> Journal of Clinical Investigation. 35 (2), 150-154 (1956).</li><li>Bartelt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brown+adipose+tissue+activity+controls+triglyceride+clearance.">Brown adipose tissue activity controls triglyceride clearance.</a> Nature Medicine. 17 (2), 200-205 (2011).</li><li>de Souza, C. J., Burkey, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta+3-adrenoceptor+agonists+as+anti-diabetic+and+anti-obesity+drugs+in+humans.">Beta 3-adrenoceptor agonists as anti-diabetic and anti-obesity drugs in humans.</a> Current Pharmaceutical Design. 7 (14), 1433-1449 (2001).</li><li>Braun, K., Oeckl, J., Westermeier, J., Li, Y., Klingenspor, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-adrenergic+control+of+lipolysis+and+thermogenesis+in+adipose+tissues.">Non-adrenergic control of lipolysis and thermogenesis in adipose tissues.</a> Journal of Experimental Biology. 221, (2018).</li></ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Les trois tests décrits fonctionnent de manière robuste en laboratoire, avec quelques considérations critiques. Le jeûne nocturne est nécessaire pour déterminer les taux sériques de lipides à jeun et le test de tolérance intralipidique orale. Pour le test de tolérance intralipidique orale, il est essentiel de faire tourner le sang à température ambiante pour minimiser la formation d’une couche de graisse, en particulier aux points de temps de 1 et 2 heures; il est important de ne pas jeter cette couche de g...

Les glucides et les lipides sont deux substrats majeurs pour le métabolisme énergétique. Le métabolisme aberrant des lipides entraîne de nombreuses maladies humaines, y compris le diabète de type II, les maladies cardiovasculaires, les maladies du foie gras et les cancers. Les lipides alimentaires, principalement les triglycérides, sont absorbés par l’intestin dans le système lymphatique et pénètrent dans la circulation veineuse dans les chylomicrons près du cœur1. Les lipides sont transportés par des particules de lipoprotéines dans la circulation sanguine, où les fractions d’acides gras sont libérées par l’action de la lipoprotéine lipase au niveau des organes périphériques tels que les muscles et le tissu adipeux2. Les particules restantes riches en cholestérol restantes sont éliminées par le foie3. Les souris ont été largement utilisées en laboratoire comme modèle de recherche pour étudier le métabolisme des lipides. Avec des outils génétiques complets disponibles et un cycle de reproduction relativement court, ils constituent un modèle puissant pour étudier comment les lipides sont absorbés, synthétisés et métabolisés.
En raison de la complexité du métabolisme des lipides, des études lipidomiques sophistiquées ou des études de traceurs isotopiques sont généralement utilisées pour quantifier des collections d’espèces lipidiques ou des flux métaboliques et des destins liés aux lipides4,5. Cela crée un énorme défi pour les chercheurs sans équipement ou expertise spécialisés. Dans cet article, nous présentons trois tests qui peuvent servir de tests initiaux avant que des techniques techniquement difficiles ne soient utilisées. Ce sont des procédures non terminales pour les souris, et donc très utiles pour identifier les différences potentielles dans la capacité de manipulation des lipides et réduire les processus affectés.
Tout d’abord, la mesure des molécules lipidiques sériques à jeun peut aider à déterminer le profil lipidique global d’une souris. Les souris doivent être à jeun, car de nombreuses espèces lipidiques augmentent après les repas et l’ampleur de l’augmentation est fortement affectée par la composition du régime alimentaire. De nombreuses molécules lipidiques, y compris le cholestérol total, les triglycérides et les acides gras non estérifiés (NEFA), peuvent être mesurées à l’aide d’un kit commercial et d’un lecteur de plaques pouvant lire l’absorbance.
Deuxièmement, un test de tolérance aux intralipides par voie orale évalue la capacité de manipulation des lipides en tant qu’effet net de l’absorption et du métabolisme. Un intralipide administré par voie orale provoque un pic dans les taux de triglycérides circulants (1 à 2 heures), après quoi les taux sériques de triglycérides reviennent aux niveaux basaux (4 à 6 heures). Ce test offre des informations sur la façon dont une souris peut gérer les lipides exogènes. Le cœur, le foie et le tissu adipeux brun sont des consommateurs actifs de triglycérides, tandis que le tissu adipeux blanc le stocke comme réserve d’énergie. Les changements dans ces fonctions entraîneront des différences dans les résultats des tests.
Enfin, favoriser la lipolyse pour mobiliser les lipides stockés est considéré comme une stratégie possible pour perdre du poids. La voie de signalisation du récepteur β3-adrénergique dans le tissu adipeux joue un rôle important dans la lipolyse adipocytaire, et la génétique humaine a identifié un polymorphisme de perte de fonction Trp64Arg dans le récepteur β3-adrénergique corrélé à l’obésité6. CL 316,243, un agoniste spécifique et puissant des récepteurs β3-adrénergiques, stimule la lipolyse du tissu adipeux et la libération de glycérol. L’évaluation de la réponse d’une souris au CL 316 243 peut fournir des informations précieuses sur le développement, l’amélioration et la compréhension de l’efficacité du composé.
Collectivement, ces tests peuvent être utilisés comme un dépistage initial des changements dans l’état métabolique lipidique des souris. Ils sont choisis pour l’accessibilité des instruments et des réactifs. Avec les résultats dérivés de ces tests, les chercheurs peuvent se faire une idée globale de la capacité métabolique de leurs animaux et décider d’approches plus sophistiquées et ciblées.

<table><tbody><tr><td>20% Intralipid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I141</td><td></td></tr><tr><td>BD Slip Tip Sterile Syringes 1ml</td><td>Shaotong</td><td>B07F1KRMYN</td><td></td></tr><tr><td>CL 316,243 Hydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5976</td><td></td></tr><tr><td>Curved Feeding Needles (18 Gauge)</td><td>Kent Scientific</td><td>FNC-18-2-2</td><td></td></tr><tr><td>Free Glycerol Reagent</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F6428</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol Standard Solution</td><td>Sigma</td><td>G7793</td><td></td></tr><tr><td>HR SERIES NEFA-HR(2)COLOR REAGENT A</td><td>Fujifilm Wako Diagnostics</td><td>999-34691</td><td></td></tr><tr><td>HR SERIES NEFA-HR(2)COLOR REAGENT B</td><td>Fujifilm Wako Diagnostics</td><td>991-34891</td><td></td></tr><tr><td>HR SERIES NEFA-HR(2)SOLVENT A</td><td>Fujifilm Wako Diagnostics</td><td>995-34791</td><td></td></tr><tr><td>HR SERIES NEFA-HR(2)SOLVENT B</td><td>Fujifilm Wako Diagnostics</td><td>993-35191</td><td></td></tr><tr><td>Matrix Plus Chemistry Reference Kit</td><td>Verichem</td><td>9500</td><td></td></tr><tr><td>Micro Centrifuge Tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-222-168</td><td></td></tr><tr><td>Microhematrocrit Capillary Tube, Not Heparanized</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-362-574</td><td></td></tr><tr><td>NEFA STANDARD SOLUTION</td><td>Fujifilm Wako Diagnostics</td><td>276-76491</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline</td><td>Boston Bioproducts</td><td>BM-220</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Triglycerides Reagent</td><td>Fisher Scientific</td><td>TR22421</td><td></td></tr><tr><td>Total Cholesterol Reagents</td><td>Thermo Scientifi</td><td>TR13421</td><td></td></tr></tbody></table>

assessing whole-body lipid-handling capacity in mice

L’évaluation du métabolisme des lipides est une pierre angulaire de l’évaluation de la fonction métabolique et est considérée comme essentielle pour les études in vivo sur le métabolisme. Les lipides sont une classe de nombreuses molécules différentes avec de nombreuses voies impliquées dans leur synthèse et leur métabolisme. Un point de départ pour évaluer l’hémostase lipidique pour la recherche sur la nutrition et l’obésité est nécessaire. Cet article décrit trois méthodes faciles et accessibles qui nécessitent peu d’expertise ou de pratique pour être maîtrisées, et qui peuvent être adaptées par la plupart des laboratoires pour dépister les anomalies du métabolisme des lipides chez la souris. Ces méthodes sont (1) la mesure de plusieurs molécules lipidiques sériques à jeun à l’aide de kits commerciaux (2) le dosage de la capacité de manipulation des lipides alimentaires par un test de tolérance intralipidique par voie orale, et (3) l’évaluation de la réponse à un composé pharmaceutique, CL 316,243, chez la souris. Ensemble, ces méthodes fourniront un aperçu de haut niveau de la capacité de manipulation des lipides chez la souris.

Nous montrons avec trois extraits que chaque test offre des informations précieuses sur le métabolisme lipidique des souris. Pour les souris mâles C57BL/6J, confrontées à huit semaines d’alimentation riche en graisses (HFD) à partir de l’âge de huit semaines, les taux de cholestérol total étaient significativement élevés, tandis que les triglyycérides sériques et les NEFA ne l’étaient pas(tableau 1),ce qui suggère que les triglycérides et les NEFA dans le sang ne sont pas principale...

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Assessing Whole-Body Lipid-Handling Capacity in Mice

Cet article fournit trois tests faciles et accessibles pour évaluer le métabolisme des lipides chez la souris.

Évaluation de la capacité de manipulation des lipides du corps entier chez la souris

Assessing lipid metabolism is a cornerstone of evaluating metabolic function, and it is considered essential for in vivo metabolism studies. Lipids are a ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

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Medicine

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Determining Bile Duct Density in the Mouse Liver

Mouse is broadly used as a model organism to study biliary diseases. To evaluate the development and function of the biliary system, various techniques are used, including serum chemistry, histological analysis, and immunostaining for specific markers. Although these techniques can provide important information about the biliary system, they often do not present a full picture of bile duct (BD) developmental defects across the whole liver. This is in part due to the robust ability of the mouse liver to drain the bile even in animals with significant impairment in biliary development. Here we present a simple method to calculate the average number of BDs associated with each portal vein (PV) in sections covering all lobes of mutant/transgenic mice. In this method, livers are mounted and sectioned in a stereotypic manner to facilitate comparison among various genotypes and experimental conditions. BDs are identified via light microscopy of cytokeratin-stained cholangiocytes, and then counted and divided by the total number of PVs present in liver section. As an example, we show how this method can clearly distinguish between wild-type mice and a mouse model of Alagille syndrome. The method presented here cannot substitute for techniques that visualize the three-dimensional structure of the biliary tree. However, it offers an easy and direct way to quantitatively assess BD development and the degree of ductular reaction formation in mice.

We present a rather simple and sensitive method for accurate quantification of bile duct density in the mouse liver. This method can aid in determining the effects of genetic and environmental modifiers and the effectiveness of potential therapies in mouse models of biliary diseases.

Détermination de la densité de duct biliaire dans le foie de souris

Mouse is broadly used as a model organism to study biliary diseases. To evaluate the development and function of the biliary system, various techniques ...

Recherche

Biologie du développement

Shotgun Lipidomics of Rodent Tissues

Lipids play a vital role as essential components of all prokaryotic and eukaryotic cells. Constant technological improvements in mass spectrometry have made lipidomics a powerful analytical tool for monitoring tissue lipidome compositions in homeostatic as well as disease states. This paper presents a step-by-step protocol for a shotgun lipid analysis method that supports the simultaneous detection and quantification of a few hundred molecular lipid species in different tissue and biofluid samples at high throughput. This method leverages automated nano-flow direct injection of a total lipid extract spiked with labeled internal standards without chromatographic separation into a high-resolution mass spectrometry instrument. Starting from sub-microgram amounts of rodent tissue, the MS analysis takes 10 min per sample and covers up to 400 lipids from 14 lipid classes in mouse lung tissue. The method presented here is well suited for studying disease mechanisms and identifying and quantifying biomarkers that indicate early toxicity or beneficial effects within rodent tissues.

Shotgun mass spectrometry-based lipidomics delivers a sensitive quantitative snapshot of a broad spectrum of lipid classes simultaneously in a single measurement from various rodent tissues.

Lipidomique de tissus de rongeurs

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Biochimie

Optimized Analysis of In Vivo and In Vitro Hepatic Steatosis

Establishing a system of procedures to qualitatively and quantitatively characterize in vivo and in vitro hepatic steatosis is important for metabolic study in the liver. Here, numerous assays are described to comprehensively measure the phenotype and parameters of hepatic steatosis in mouse and hepatocyte models. 
Combining the physiological, histological, and biochemical methods, this system can be used to assess the progress of hepatic steatosis. In vivo, the measurements of body weight and nuclear magnetic resonance (NMR) provide a general understanding of mice in a non-invasive manner. Hematoxylin and Eosin (H&amp;E) and Oil Red O staining determine the histological morphology and lipid deposition of liver tissue under nutrient overload conditions, such as high-fat diet feeding. Next, the total lipid contents are isolated by chloroform/methanol extraction, which are followed by a biochemical analysis for triglyceride and cholesterol. Moreover, mouse primary hepatocytes are treated with high glucose plus insulin to stimulate lipid accumulation, an efficient in vitro model to mimic diet-induced hyperglycemia and hyperinsulinemia in vivo. Then, the lipid deposition is measured by Oil Red O staining and chloroform/methanol extraction. Oil Red O staining determines intuitive hepatic steatotic phenotypes, while the lipid extraction analysis determines the parameters that can be analyzed statistically. The present protocols are of interest to scientists in the fields of fatty liver diseases, insulin resistance, and type 2 diabetes.

Optimized Analysis of In Vivo and In Vitro Hepatic Steatosis

Here, optimized methods to generate in vivo and in vitro models of hepatic steatosis and to analyze the steatotic phenotypes and related physiological parameters are described.

Analyse optimisée des<em&gt; In Vivo</em&gt; et<em&gt; In vitro</em&gt; Stéatose hépatique

Establishing a system of procedures to qualitatively and quantitatively characterize in vivo and in vitro hepatic steatosis is important for metabolic ...

Médecine

Quantification of Atherosclerosis in Mice

Cardiovascular disease is the main cause of death in the world. The underlying cause in most cases is atherosclerosis, which is in part a chronic inflammatory disease. Experimental atherosclerosis studies have elucidated the role of cholesterol and inflammation in the disease process. This has led to successful clinical trials with pharmaceutical agents that reduce clinical manifestations of atherosclerosis. Careful and well-controlled experiments in mouse models of the disease could further elucidate the pathogenesis of the disease, which is not fully understood. Standardized lesion analysis is important to reduce experimental variability and increase reproducibility. Determining lesion size in aortic root, aortic arch, and brachiocephalic artery are common endpoints in experimental atherosclerosis. This protocol provides a technical description for evaluation of atherosclerosis at all these sites in a single mouse. The protocol is particularly useful when material is limited, as is frequently the case when genetically modified animals are being characterized.

Murine models of atherosclerosis are useful tools to investigate pathogenic pathways on a molecular level, but require standardized quantification of lesion development. This protocol describes an optimized method to determine lesion size in the major arterial vessels including the aortic root, aortic arch, and brachiocephalic artery.

Quantification de l'athérosclérose chez les souris

Cardiovascular disease is the main cause of death in the world. The underlying cause in most cases is atherosclerosis, which is in part a chronic ...

Immunologie et infection

Body Composition and Metabolic Caging Analysis in High Fat Fed Mice

Alterations to body composition (fat or lean mass), metabolic parameters such as whole-body oxygen consumption, energy expenditure, and substrate utilization, and behaviors such as food intake and physical activity can provide important information regarding the underlying mechanisms of disease. Given the importance of body composition and metabolism to the development of obesity and its subsequent sequelae, it is necessary to make accurate measures of these parameters in the pre-clinical research setting. Advances in technology over the past few decades have made it possible to derive these measures in rodent models in a non-invasive and longitudinal fashion. Consequently, these metabolic measures have proven useful when assessing the response of genetic manipulations (for example knockout or transgenic mice, viral knock-down or overexpression of genes), experimental drug/compound screening and dietary, behavioral or physical activity interventions. Herein, we describe the protocols used to measure body composition and metabolic parameters using an animal monitoring system in chow-fed and high fat diet-fed mice.

This protocol describes the use of a body composition analyzer and metabolic animal monitoring system to characterize body composition and metabolic parameters in mice. An obesity model induced by high-fat feeding is used as an example for the application of these techniques.

Composition corporelle et l’analyse mise en cage métabolique in Mice Fed graisse haute

Alterations to body composition (fat or lean mass), metabolic parameters such as whole-body oxygen consumption, energy expenditure, and substrate ...

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

The nematode C. elegans has emerged as an important model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as it relates to human obesity and its associated pathologies. Several previous methodologies developed for the visualization of C. elegans triglyceride-rich fat stores have proven to be erroneous, highlighting cellular compartments other than lipid droplets. Other methods require specialized equipment, are time-consuming, or yield inconsistent results. We introduce a rapid, reproducible, fixative-based Nile red staining method for the accurate and rapid detection of neutral lipid droplets in C. elegans. A short fixation step in 40% isopropanol makes animals completely permeable to Nile red, which is then used to stain animals. Spectral properties of this lipophilic dye allow it to strongly and selectively fluoresce in the yellow-green spectrum only when in a lipid-rich environment, but not in more polar environments. Thus, lipid droplets can be visualized on a fluorescent microscope equipped with simple GFP imaging capability after only a brief Nile red staining step in isopropanol. The speed, affordability, and reproducibility of this protocol make it ideally suited for high throughput screens. We also demonstrate a paired method for the biochemical determination of triglycerides and phospholipids using gas chromatography mass-spectrometry. This more rigorous protocol should be used as confirmation of results obtained from the Nile red microscopic lipid determination. We anticipate that these techniques will become new standards in the field of C. elegans metabolic research.

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

We present robust biochemical and microscopic methods for studying Caenorhabditis elegans lipid stores. A rapid, simple, fixing-staining procedure for fluorescent lipid droplet imaging leverages the spectral properties of the lipophilic dye Nile red. We then present biochemical measurement of triglycerides and phospholipids using solid phase extraction and gas chromatography-mass spectrometry.

Biochimique et High Throughput évaluation microscopique de la masse grasse dans<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

The nematode C. elegans has emerged as an important  model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as  it relates to human ...

Biologie

Imaging and Analysis of Oil Red O-Stained Whole Aorta Lesions in an Aneurysm Hyperlipidemia Mouse Model

Apolipoprotein E (Apoe)- or low density lipoprotein receptor (Ldlr)-deficient hyperlipidemic mice are the two most commonly used models for atherosclerosis research. They are used to study the impact of a various genetic factors and different cell types on atherosclerotic lesion formation and as well as test the development of new therapies. Isolation, excision of the whole aorta, and quantification of Oil Red O-stained atherosclerotic lesions are basic morphometric methods used to evaluate atherosclerotic burden. The goal of this protocol is to describe an optimized, step-by-step surgical method to dissect, perfuse-fix, isolate, stain, image and analyze atherosclerotic lesions in mouse aortas with Oil Red O. Because atherosclerotic lesions can form anywhere in the entire aortic tree, this whole aorta Oil Red O staining method has the advantage of evaluating lipid-laden plaques in the entire aorta and all branches in a single mouse. In addition to Oil Red O staining, fresh isolated whole aortas can be used for variety of in vitro and in vivo experiments and cell isolations.

This protocol provides a step-by-step procedure to analyze atherosclerotic burden in mice. Investigators can use this protocol to compare the abundance, location, and size of atherosclerotic lesions in different animals.

Imagerie et analyse de lésions de l’aorte entière o-colorée à l’huile dans un modèle murin d’hyperlipidémie d’anévrisme

Apolipoprotein E (Apoe)- or low density lipoprotein receptor (Ldlr)-deficient hyperlipidemic mice are the two most commonly used models for ...

Determination of Fatty Acid Oxidation and Lipogenesis in Mouse Primary Hepatocytes

Lipid metabolism in liver is complex. In addition to importing and exporting lipid via lipoproteins, hepatocytes can oxidize lipid via fatty acid oxidation, or alternatively, synthesize new lipid via de novo lipogenesis. The net sum of these pathways is dictated by a number of factors, which in certain disease states leads to fatty liver disease. Excess hepatic lipid accumulation is associated with whole body insulin resistance and coronary heart disease. Tools to study lipid metabolism in hepatocytes are useful to understand the role of hepatic lipid metabolism in certain metabolic disorders.
In the liver, hepatocytes regulate the breakdown and synthesis of fatty acids via &#946;-fatty oxidation and de novo lipogenesis, respectively. Quantifying metabolism in these pathways provides insight into hepatic lipid handling. Unlike in vitro quantification, using primary hepatocytes, making measurements in vivo is technically challenging and resource intensive. Hence, quantifying &#946;-fatty acid oxidation and de novo lipogenesis in cultured mouse hepatocytes provides a straight forward method to assess hepatocyte lipid handling. 
Here we describe a method for the isolation of primary mouse hepatocytes, and we demonstrate quantification of &#946;-fatty acid oxidation and de novo lipogenesis, using radiolabeled substrates.

De novo lipogenesis and &#946;-fatty acid oxidation constitute key metabolic pathways in hepatocyte, pathways that are perturbed in several metabolic disorders, including fatty liver disease. Here we demonstrate isolation of mouse primary hepatocytes and describe quantification of &#946;-fatty acid oxidation and lipogenesis.

Détermination de oxydation des acides gras et de la lipogenèse dans les hépatocytes primaires de souris

Lipid metabolism in liver is complex. In addition to importing and exporting lipid via lipoproteins, hepatocytes can oxidize lipid via fatty acid ...

Étude de la physiopathologie de l’ICFEp dans un modèle murin induit par l’hyperlipidémie

A Murine Model of Hyperlipidemia&#45;Induced Heart Failure with Preserved Ejection Fraction

The pathophysiology of heart failure with preserved ejection fraction (HFpEF) driven by lipotoxicity is incompletely understood. Given the urgent need for animal models that accurately mimic cardio-metabolic HFpEF, a hyperlipidemia-induced murine model was developed by reverse engineering phenotypes seen in HFpEF patients. This model aimed to investigate HFpEF, focusing on the interplay between lipotoxicity and metabolic syndrome. Hyperlipidemia was induced in wild-type (WT) mice on a 129J strain background through bi-weekly intraperitoneal injections of poloxamer-407 (P-407), a block co-polymer that blocks lipoprotein lipase, combined with a single intravenous injection of adeno-associated virus 9-cardiac troponin T-low-density lipoprotein receptor (AAV9-cTnT-LDLR). Extensive assessments were conducted between 4 and 8 weeks post-treatment, including echocardiography, blood pressure recording, whole-body plethysmography, echocardiography (ECG) telemetry, activity wheel monitoring (AWM), and biochemical and histological analyses. The LDLR/P-407 mice exhibited distinctive features at four weeks, including diastolic dysfunction, preserved ejection fraction, and increased left ventricular wall thickness. Notably, blood pressure and renal function remained within normal ranges. Additionally, ECG and AWM revealed heart blocks and reduced activity, respectively. Diastolic function deteriorated at eight weeks, accompanied by a significant decline in respiratory rates. Further investigation into the double treatment model revealed elevated fibrosis, wet/dry lung ratios, and heart weight/body weight ratios. The LDLR/P-407 mice exhibited xanthelasmas, ascites, and cardiac ischemia. Interestingly, sudden deaths occurred between 6 and 12 weeks post-treatment. The murine HFpEF model offers a valuable and promising experimental resource for elucidating the intricacies of metabolic syndrome contributing to diastolic dysfunction within the context of lipotoxicity-mediated HFpEF.

Pleins feux sur l’auteur : Explorer la relation entre la lipotoxicité et l’ICFEp 

This protocol presents a detailed approach to replicating a murine model of hyperlipidemia-induced heart failure with preserved ejection fraction (HFpEF). The design combines the administration of adeno-associated virus 9-cardiac troponin T-low-density lipoprotein receptor (AAV9-cTnT-LDLR) and poloxamer-407 (P-407).

Modèle murin d’insuffisance cardiaque induite par l’hyperlipidémie avec fraction d’éjection préservée

The pathophysiology of heart failure with preserved ejection fraction (HFpEF) driven by lipotoxicity is incompletely understood. Given the urgent need for ...

Évaluation de la capacité de manipulation des lipides du corps entier chez la souris

Résumé

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Chapitres dans cette vidéo

Détermination de la densité de duct biliaire dans le foie de souris

Lipidomique de tissus de rongeurs

Analyse optimisée des

Quantification de l'athérosclérose chez les souris

Composition corporelle et l’analyse mise en cage métabolique in Mice Fed graisse haute

Biochimique et High Throughput évaluation microscopique de la masse grasse dans

Imagerie et analyse de lésions de l’aorte entière o-colorée à l’huile dans un modèle murin d’hyperlipidémie d’anévrisme

Détermination de oxydation des acides gras et de la lipogenèse dans les hépatocytes primaires de souris

Modèle murin d’insuffisance cardiaque induite par l’hyperlipidémie avec fraction d’éjection préservée

Modèle murin d’insuffisance cardiaque induite par l’hyperlipidémie avec fraction d’éjection préservée