ברצוננו להודות פרופסור אנדרס Jeppsson על העזרה במתן כלי דם בשימוש הניסויים. מחקר זה מומן על ידי המענק LUA אלף ל SSH.

הרקמה בשימוש, הפרוטוקול של המאמר עוקב אחר ההנחיות האתית של אוניברסיטת גטבורג.
1. רקמות הכנה ואחסון
<ol><li>חותכים את הרקמה שמסביב של וריד saphenous שאוחזרו באמצעות מלקחיים כירורגיים ומספריים. הערה: וריד saphenous הוא גזור מן האיבר התחתון של בני אדם על ידי מנתחים כלי הדם. וריד saphenous בשימוש הנייר הזה הוא חלק משולחים שאינם בשימוש לאחר ניתוח מעקפים.</li>
	<li>כדי למנוע דליפה במהלך זלוף, מאתרים ומפסיקים את כל הענפים בצד שלהם הקצוות עם התפרים וחדים.</li>
	<li>שמור את הוריד שפופרת 50 מ ל המכיל 40 מ ל תמיסת מאגר פוספט (PBS). לשטוף את הווריד על-ידי שינוי PBS 2 - 3 פעמים כדי להסיר את עודף דם. לאחסן את הווריד על ידי הקפאת ב-80 מעלות צלזיוס.</li>
</ol>2. הכנת Decellularization כיוונונים, ביוריאקטור Recellularization
הערה: באמצעות מספריים, חותכים את צינורות סיליקון כפי שמוצג בטבלה 1.
<ol><li>
הגדרת decellularization 1 (עבור טריטון X-100 זלוף, כביסה)
	<ol>
<li>כדי בשנה השנייה קאמרית (אמבטיה מפלסטיק), להקליט את כל שלוש חתיכות של שפופרת A כפי שמוצג באיור 1A. הערה: קלטת שפופרת אחת על קיר אחד שבו הקצה נוגע בתחתית התא (כניסת של דטרגנט) וצינורות שני אחרים לקיר הנגדי עם מרחק של 5-10 ס מ בין בהתאם לאורך הווריד. גם צריך להיות מודבק לפחות 5 ס מ של צינורות אלה רצפת החדר (הווריד של כניסת ולשקע).</li>
		<li>השימוש המחברים סכינים סטריליים זכר ונקבה, להתחבר בסדרה כניסת של הנוזל צינור אל הרכבת התחתית B ואחריו צינור F, שפופרת C, ולבסוף לים וריד. המקום הצינור F לתוך בקלטת של סחרור משאבה אני.</li>
		<li>. קח עוד צינור C, חבר קצה אחד לשקע הווריד. מניחים בצד השני צנצנת הזכוכית עם השקע הצינור התחתון ממוקם 45 ס מ מעל התא (דטרגנט outlet) והדבק כדי לאבטח. קח צינור G ו לדחוף קצה אחד לשקע צינור של צנצנת הזכוכית ולמקם את הקצה השני אל החדר וריד. הערה: התמונות של השלמת ההתקנה (חצים אדומים), הקאמרית כיוון הזרימה (החצים הלבנים) מוצגים איור 1A.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
הגדרת decellularization 2 (עבור TnBP זלוף)
	<ol>
<li>לקחת צנצנת זכוכית 1 ליטר, ולמקם קצה אחד של הצינור C (כניסת דטרגנט) לתוך הצנצנת עד הצינור נוגעת התחתון של הצנצנת.</li>
		<li>חבר את הקצה השני צינור F ואחריו צינור ג מקום הקצה השני של הרכבת התחתית C לתוך הצנצנת עד עומק חצי (כניסת של הווריד). למקם את צינור F הקלטת של משאבת סחרור אני.</li>
		<li>קח צינור D, למקם את קצה אחד הצנצנת (outlet של וריד) עד עומק חצי ואת הקצה השני לתוך צנצנת הזכוכית עם הצינור התחתון ממוקם בגובה 45 ס מ מ כניסת של הווריד של (דטרגנט עודפים). כדי לאבטח, קלטת צינורות כניסת ו עודפים של הנוזל.</li>
		<li>מניחים את צנצנת הזכוכית 1 ליטר על פגים ולשמור את המגנט שבתוך הבקבוק.</li>
		<li>קח צינור G ו לדחוף קצה אחד על גבי הצינור לשקע של צנצנת הזכוכית ומניחים בצד השני לתוך צנצנת זכוכית 1 ליטר. הערה: התמונה של השלמת ההתקנה (חצים אדומים), כיוון קאמרית וזרימה (החצים הלבנים) מוצג איור 1B.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
הגדרת decellularization 3 (עבור DNase זלוף)
	<ol>
<li>קח בקבוק זכוכית 250 מ ל, למקם את שני הקצוות של שפופרת ג מקום האזור האמצעי של הצינור בקלטת של משאבת סחרור II. הערה: קצה אחד של הצינור הוא הים פתרון, בקצה השני של הצינור מחובר כניסת של הווריד של. אאוטלט של הוריד נותר חופשי בתמיסה.</li>
		<li>למקם את כל הארגון כולל משאבת ב 37 º C. התמונה של השלמת ההתקנה, כיוון הזרימה מוצג באיור 1C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Recellularization ביוריאקטור
	<ol>
<li>שמור מוכן כל החלקים כפי שמוצג באיור 2A.</li>
		<li>כפי שמוצג באיור 2B, לקחת את הכובע ארבע יציאות להכניס כל יציאה, צינור H (outlet של וריד), צינור אני (המדיה כניסת) ו צינור J (כניסת של הווריד). הכנס את הקצה השני של הצינור H ליציאתה 4 (אמצעי התקשורת). הערה: התצוגה של הכיפה ארבע יציאות מלמעלה מוצג באיור 2C. להכנסה נוחה של צינורות, חותכים את הקצוות כדי ליצור קצה חד עם מספריים.</li>
		<li>לכופף את הקצה השני של הצינור J לצורת U, תקשור את זה. בתפר. להתחבר המחברים להפחית הקצוות הפנימיים של צינורות H & ג'יי</li>
		<li>להכניס את הצינור 60 מ עם בסיס שטוח בתוך בקבוק הזכוכית 250 מ ל ולאחר מכן מקם את ההתקנה עשוי לעיל לתוך הצינור כפי שמוצג באיור 2D. כפי שמוצג באיור 2E, מחברים צינורות K, E ו- K בסדרה. מחברים צינור אחד K כניסת של הווריד צינור אחר K לים מדיה. הערה: תרשים סכמטי של תוכנית ההתקנה, כיוון הזרימה הוא ראה ב 2F איור.</li>
		<li>לחטא את ביוריאקטור על-ידי autoclaving.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. אופן ההכנה של פתרונות
<ol><li>פתרון 1 (10 x מים): עד 1 L של הנדסה גנטית מים, להוסיף 2 g של אזיד הנתרן ו- g 18.6 של חומצה ethylenediaminetetraacetic (EDTA). מערבבים עד מלחים הם התפרקה.</li>
	<li>פתרון 2 (1 x מים): לקחת 100 מ של פתרון 1 ולהוסיף 900 מ ל מים הנדסה גנטית.</li>
	<li>פתרון 3 (5 x טריטון X-100): עד 950 מ"ל של מים הנדסה גנטית, להוסיף 50 מ של טריטון X-100 1g של אזיד הנתרן, 9.3 גר' EDTA. מערבבים עד התפרקה.</li>
	<li>פתרון 4 (1 x טריטון X-100): לקחת 200 מ של פתרון 3 ולהוסיף 800 מ ל מים הנדסה גנטית.</li>
	<li>פתרון 5 (1 x TnBP): להוסיף 10 מ של TnBP עם פיפטה 10 מ"ל 990 מ של פתרון 2.</li>
	<li>פתרון 6 (40 קוניץ יחידות/mL DNase): להוסיף קוניץ 2,000 יחידות של DNaseI 50 מ של Dulbecco פוספט מאגר מלוחים המכילים CaCl2 ו- MgCl2. להכין טרי ולהשתמש מיד.</li>
	<li>פתרון 7 (PBS): להוסיף 24 גר' נתרן כלורי, 0.6 גרם אשלגן כלורי, g 4.32 של סודיום פוספט ו- g 0.72 של אשלגן פוספט 3 לליטר מים הנדסה גנטית. מערבבים עד התפרקה. להתאים את ה-pH ל 7.4. לחטא 1 ליטר ל- PBS ב החיטוי ולאחסן בנפרד.</li>
	<li>פתרון 8 (0.1% חומצה Peracetic): 50 מ של פתרון סטרילי 7, להוסיף 50 µL של חומצה peracetic. להכין טרי ולהשתמש מיד.</li>
</ol>4. הכנת אנדותל בינוני
<ol><li>הוסף 5 מ לגלוטמין, 5 מ של אנטי אנטי, 50 מ של AB בנסיוב אדם ואת כל הרכיבים של EGM-2 ערכת פקטורי גדילה חוץ עוברית סרום שור עד 500 מ"ל של המדיום MCDB131 תחת כיסוי סטרילי.</li>
</ol>5. decellularization של וריד Saphenous
<ol><li>הפשרת וריד saphenous אנושי מ-80 מעלות צלזיוס בטמפרטורת החדר. להקפיא שוב ב-80 מעלות צלזיוס, להפשיר שוב בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>ביופסיה של 2 מ מ אורך באמצעות מספריים לחתוך ותקן בפורמלין במשך 24-48 שעות בטמפרטורת החדר. לקשור כל סוף הווריד כדי לחלקים של מחבר סכינים סטריליים זכר ונקבה בתפר.</li>
	<li>לחבר את הווריד להתקנת decellularization 1 ומלא 1 ליטר של פתרון 2. Perfuse במשך 15 דקות ב- 35 מ ל לדקה לרוקן את התוכן של ההתקנה.</li>
	<li>להוסיף 1 ליטר של פתרון 4, perfuse עבור 4 h ב- 35 מ ל לדקה לרוקן את התוכן של ההתקנה.</li>
	<li>להוסיף 500 מ"ל של פתרון 2, perfuse עבור 5 דק. לרוקן את התוכן של ההתקנה. חזור על שלב זה. נתק את הווריד מהגדרת זלוף 1 וחבר להתקנת זלוף 2.</li>
	<li>להוסיף 1 ליטר של פתרון 5, להפעיל את קדירות, perfuse במשך 4 שעות-35 mL/min. הערה: פתרון 5 נראה מעונן לאחר המפנה על בחישה את וברחבי זלוף.</li>
	<li>נתק את הווריד זלוף ההתקנה 2 ולשטוף את הווריד של מחוץ ובתוך עם מזרק או פיפטה של 10 מ"ל 4 שינויים של הנדסה גנטית מים למשך 5-10 דקות.</li>
	<li>לחבר את הווריד להתקנת זלוף 3, להוסיף 50 מ של פתרון 6, perfuse ב- 10 מ ל/דקה בתוך תא 37 ° C 4 h לרוקן את התוכן של ההתקנה, נתק את הווריד של ההתקנה.</li>
	<li>לחבר את הווריד להתקנת זלוף 1, מילוי 1 ליטר של פתרון 2, perfuse בין לילה-35 מ ל לדקה חזור על שלב 5.4 לשלב 5.9 4 פעמים (עבור סכום כולל של 5 מחזורים). לקחת ביופסיה שוב כפי שנקבע בשלב 5.2. הערה: לדלג על שלב 5.8 החלק השני במחזורים 1 ו- 3.</li>
	<li>רוקן את התוכן של ההתקנה. מילוי 1 ליטר של פתרון 2 ו perfuse עבור 24 שעות-35 מ ל לדקה שינוי פתרון 2 אחרי ה 12 לרוקן את התוכן של ההתקנה. מילוי 1 ליטר של המים הנדסה גנטית, perfuse עבור 24 שעות-35 מ ל לדקה שינוי המים הנדסה גנטית לאחר 12 h.Empty את התוכן של ההתקנה. מילוי 1 ליטר של פתרון 7, perfuse עבור 24 שעות-35 מ ל לדקה שינוי פתרון 7 אחרי 12 שעות.</li>
</ol>6. אימות של Decellularization
<ol><li>לשטוף את פורמלין קבוע ביופסיות במים הנדסה גנטית למשך 15 דקות תהליך בתוך מעבד רקמות בעקבות פרוטוקולים סטנדרטיים, להטביע פרפין22.</li>
	<li>לחתוך 5 מיקרומטר למקטעים באמצעות מיקרוטום של הכתם עם hematoxylin ו- 0.2% אלכוהוליים אאוזין מאייר (H & E) בעקבות פרוטוקולים סטנדרטיים22.</li>
	<li>הצג תחת מיקרוסקופ כדי לבדוק אם אובדן של גרעינים ברקמת decellularized בהשוואה הרקמות.</li>
</ol>7. recellularization
<ol><li>לחטא את הווריד על-ידי הצבתו בשפופרת 50 מ ל המכיל 50 מ של פתרון 8. להתסיס ב 80 סיבובים לדקה (סל ד) שייקר עבור h 1-37 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>להתמודד עם הווריד של תחת זרימה שכבתית (נולדנו) ארון מעכשיו לשמור על עקרות. העבר בעזרת מלקחיים סטרילי צינור 50 מ ל המכיל 50 מ של פתרון סטרילי 7 ו- 500 µL של אנטי-נגד. להתסיס לעיל עבור 12 ח' 7 פתרון שינוי לפחות פעמיים שביניהם.</li>
	<li>בעזרת מלקחיים סטרילי, להעביר את הווריד צינור 50 מ"ל ולהוסיף 50 מ של מדיה אנדותל. להתסיס לעיל עבור 11 h.</li>
	<li>להרכיב את ביוריאקטור שימוש בכפפות סטריליות תחת נולדנו הקבינט. לקשור את הווריד של ביוריאקטור כניסת הווריד, שקע עם תפר סטרילי וחדים.</li>
	<li>לחבר את הווריד ביוריאקטור, מילוי עם המדיום אותו. להוסיף הפארין 50 IU/mL ו- perfuse עבור h 1-2 mL/min ב- 37 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>לאסוף 15-25 מ של דם טרי (תלוי באורך של הוריד) מהתורם הפארין מצופה האגירה צינורות ו לדלל 1:1 עם פתרון סטין. מאוחר יותר, הוסף בלוטה אנדוקרינית-derived כלי הדם צמיחה אנדותל (EG-VEGF, 80 ng/mL), בסיסי פיברובלסט גורם גידול (b-FGF, µL 4/mL), חומצה אצטיל-סליצילית (5 µg/mL).</li>
	<li>לעבור את ביוריאקטור חממה 37 ° C עם 5% CO2 , perfuse במשך 48 שעות-2 mL/min.</li>
	<li>כ לאחר 12 שעות, לעבור את ביוריאקטור נולדנו ארונית, לקחת טיפת דם ומדידת גלוקוז באמצעות של הגלוקוז בדם פיקוח על המכשיר. אם הרמה היא פחות מ 3 mmol/L, להוסיף גלוקוזה להביא בטווח של 7-9 mmol/ל' חזור על צעד זה כל h 8-12.</li>
	<li>לאחר 48 שעות, להעביר את ביוריאקטור נולדנו הקבינט, לנקז את הדם מן ביוריאקטור. להוסיף 30 מ של פתרון סטרילי 7, perfuse עבור 5 דק סוחטים הפתרון. להוסיף 30 מ של פתרון סטרילי 7, perfuse עבור 5 דק חוזר פעמיים או עד צבע אדום blood אובד. הערה: ניתן לקחת הביופסיה לאימות של הקובץ המצורף התא. נתק את הווריד, לחתוך קצוות הווריד של 5 מ מ עם מספריים ולמחוק אותם. לקחת ביופסיה כאמור בשלב 5.2 וחבר את הווריד שוב ביוריאקטור (שלב אופציונלי).</li>
	<li>להוסיף 30-45 מ"ל של מדיום אנדותל, perfuse עבור h 96 בחממה ב 2 mL/min. הערה: הוסף אנדותל בינוני עד הווריד שקוע.</li>
	<li>להעביר את ביוריאקטור לתוך הארון נולדנו, נתק את הווריד recellularized, לגזור קצוות 5 מ מ בעזרת מספריים וזורקים. לקחת ביופסיה כאמור בשלב 5.2.</li>
</ol>8. אימות של Recellularization
<ol><li>ההוראות בסעיף 6 ולבצע H & E מכתים. לבחון את השקופיות תחת מיקרוסקופ נוכחות של תאים.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Brockbank, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+cryopreservation+upon+vein+function+in+vivo.">Effects of cryopreservation upon vein function in vivo.</a> Cryobiology. 31 (1), 71-81 (1994).</li><li>O'Donnell, T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+of+operative+findings+with+angiographic+and+noninvasive+hemodynamic+factors+associated+with+failure+of+polytetrafluoroethylene+grafts.">Correlation of operative findings with angiographic and noninvasive hemodynamic factors associated with failure of polytetrafluoroethylene grafts.</a> Journal of Vascular Surgery. 1 (1), 136-148 (1984).</li><li>Atala, A., Bauer, S. B., Soker, S., Yoo, J. J., Retik, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-engineered+autologous+bladders+for+patients+needing+cystoplasty.">Tissue-engineered autologous bladders for patients needing cystoplasty.</a> Lancet. 367 (9518), 1241-1246 (2006).</li><li>Raya-Rivera, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-engineered+autologous+urethras+for+patients+who+need+reconstruction:+an+observational+study.">Tissue-engineered autologous urethras for patients who need reconstruction: an observational study.</a> Lancet. 377 (9772), 1175-1182 (2011).</li><li>Macchiarini, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+transplantation+of+a+tissue-engineered+airway.">Clinical transplantation of a tissue-engineered airway.</a> Lancet. 372 (9655), 2023-2030 (2008).</li><li>Olausson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+an+allogeneic+vein+bioengineered+with+autologous+stem+cells:+a+proof-of-concept+study.">Transplantation of an allogeneic vein bioengineered with autologous stem cells: a proof-of-concept study.</a> Lancet. 380 (9838), 230-237 (2012).</li><li>Olausson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Application+of+Tissue-Engineered+Veins+Using+Autologous+Peripheral+Whole+Blood:+A+Proof+of+Concept+Study.">In Vivo Application of Tissue-Engineered Veins Using Autologous Peripheral Whole Blood: A Proof of Concept Study.</a> EBioMedicine. 1 (1), 72-79 (2014).</li><li>Ott, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+and+orthotopic+transplantation+of+a+bioartificial+lung.">Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung.</a> Nature Medicine. 16 (8), 927-933 (2010).</li><li>Uygun, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+reengineering+through+development+of+a+transplantable+recellularized+liver+graft+using+decellularized+liver+matrix.">Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix.</a> Nature Medicine. 16 (7), 814-820 (2010).</li><li>Conconi, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracheal+matrices,+obtained+by+a+detergent-enzymatic+method,+support+in+vitro+the+adhesion+of+chondrocytes+and+tracheal+epithelial+cells.">Tracheal matrices, obtained by a detergent-enzymatic method, support in vitro the adhesion of chondrocytes and tracheal epithelial cells.</a> Transplant International. 18 (6), 727-734 (2005).</li><li>Gilbert, T. W., Sellaro, T. L., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularization+of+tissues+and+organs.">Decellularization of tissues and organs.</a> Biomaterials. 27 (19), 3675-3683 (2006).</li><li>Zhang, Z. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+of+human+fetal+mesenchymal+stem+cells+for+off-the-shelf+bone+tissue+engineering+application.">The potential of human fetal mesenchymal stem cells for off-the-shelf bone tissue engineering application.</a> Biomaterials. 33 (9), 2656-2672 (2012).</li><li>Elebring, E., Kuna, V. K., Kvarnstrom, N., Sumitran-Holgersson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cold-perfusion+decellularization+of+whole-organ+porcine+pancreas+supports+human+fetal+pancreatic+cell+attachment+and+expression+of+endocrine+and+exocrine+markers.">Cold-perfusion decellularization of whole-organ porcine pancreas supports human fetal pancreatic cell attachment and expression of endocrine and exocrine markers.</a> Journal of Tissue Engineering. 8, 2041731417738145 (2017).</li><li>Masumoto, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+iPS+cell-engineered+cardiac+tissue+sheets+with+cardiomyocytes+and+vascular+cells+for+cardiac+regeneration.">Human iPS cell-engineered cardiac tissue sheets with cardiomyocytes and vascular cells for cardiac regeneration.</a> Science Reports. 4, 6716 (2014).</li><li>Wiles, K., Fishman, J. M., De Coppi, P., Birchall, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Host+Immune+Response+to+Tissue-Engineered+Organs:+Current+Problems+and+Future+Directions.">The Host Immune Response to Tissue-Engineered Organs: Current Problems and Future Directions.</a> Tissue Engineering Part B Reviews. 22 (3), 208-219 (2016).</li><li>Young, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cells+in+the+eyes+of+an+immunologist.">Endothelial cells in the eyes of an immunologist.</a> Cancer Immunology Immunotherapy. 61 (10), 1609-1616 (2012).</li><li>Graham, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+seeding+of+prosthetic+vascular+grafts:+early+experimental+studies+with+cultured+autologous+canine+endothelium.">Endothelial cell seeding of prosthetic vascular grafts: early experimental studies with cultured autologous canine endothelium.</a> Archives of Surgery. 115 (8), 929-933 (1980).</li><li>Onuki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+endothelialization+model+for+the+study+of+Dacron+graft+healing.">Accelerated endothelialization model for the study of Dacron graft healing.</a> Annals of Vascular Surgery. 11 (2), 141-148 (1997).</li><li>Clowes, A. W., Kirkman, T. R., Reidy, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+arterial+graft+healing.+Rapid+transmural+capillary+ingrowth+provides+a+source+of+intimal+endothelium+and+smooth+muscle+in+porous+PTFE+prostheses.">Mechanisms of arterial graft healing. Rapid transmural capillary ingrowth provides a source of intimal endothelium and smooth muscle in porous PTFE prostheses.</a> American Journal of Pathology. 123 (2), 220-230 (1986).</li><li>L'Heureux, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+tissue-engineered+blood+vessels+for+adult+arterial+revascularization.">Human tissue-engineered blood vessels for adult arterial revascularization.</a> Nature Medicine. 12 (3), 361-365 (2006).</li><li>Syedain, Z. H., Meier, L. A., Lahti, M. T., Johnson, S. L., Tranquillo, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implantation+of+completely+biological+engineered+grafts+following+decellularization+into+the+sheep+femoral+artery.">Implantation of completely biological engineered grafts following decellularization into the sheep femoral artery.</a> Tissue Engineering Part A. 20 (11-12), 1726-1734 (2014).</li><li>Cardiff, R. D., Miller, C. H., Munn, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manual+hematoxylin+and+eosin+staining+of+mouse+tissue+sections.">Manual hematoxylin and eosin staining of mouse tissue sections.</a> Cold Spring Harb Protocols. 2014 (6), 655-658 (2014).</li><li>Pollack, A. A., Taylor, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+exercise+and+body+position+on+the+venous+pressure+at+the+ankle+in+patients+having+venous+valvular+defects.">The effect of exercise and body position on the venous pressure at the ankle in patients having venous valvular defects.</a> Journal of Clinical Investigation. 28 (3), 559-563 (1949).</li><li>Li, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-molecular-weight+peptides+derived+from+extracellular+matrix+as+chemoattractants+for+primary+endothelial+cells.">Low-molecular-weight peptides derived from extracellular matrix as chemoattractants for primary endothelial cells.</a> Endothelium. 11 (3-4), 199-206 (2004).</li><li>van Ark, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+2+diabetes+mellitus+is+associated+with+an+imbalance+in+circulating+endothelial+and+smooth+muscle+progenitor+cell+numbers.">Type 2 diabetes mellitus is associated with an imbalance in circulating endothelial and smooth muscle progenitor cell numbers.</a> Diabetologia. 55 (9), 2501-2512 (2012).</li><li>Steen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+lungs+from+a+non-heart-beating+donor.">Transplantation of lungs from a non-heart-beating donor.</a> Lancet. 357 (9259), 825-829 (2001).</li><li>Van Raemdonck, D., Neyrinck, A., Cypel, M., Keshavjee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex-vivo+lung+perfusion.">Ex-vivo lung perfusion.</a> Transplant International. 28 (6), 643-656 (2015).</li><li>Cross, M. J., Claesson-Welsh, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF+and+VEGF+function+in+angiogenesis:+signalling+pathways,+biological+responses+and+therapeutic+inhibition.">FGF and VEGF function in angiogenesis: signalling pathways, biological responses and therapeutic inhibition.</a> Trends in Pharmacological Science. 22 (4), 201-207 (2001).</li><li>Peplow, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+factor-+and+cytokine-stimulated+endothelial+progenitor+cells+in+post-ischemic+cerebral+neovascularization.">Growth factor- and cytokine-stimulated endothelial progenitor cells in post-ischemic cerebral neovascularization.</a> Neural Regeneration Research. 9 (15), 1425-1429 (2014).</li><li>Xiao-Yun, X., Zhao-Hui, M., Ke, C., Hong-Hui, H., Yan-Hong, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucagon-like+peptide-1+improves+proliferation+and+differentiation+of+endothelial+progenitor+cells+via+upregulating+VEGF+generation.">Glucagon-like peptide-1 improves proliferation and differentiation of endothelial progenitor cells via upregulating VEGF generation.</a> Medical Science Monitor. 17 (2), BR35-BR41 (2011).</li><li>Dragoni, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+endothelial+growth+factor+stimulates+endothelial+colony+forming+cells+proliferation+and+tubulogenesis+by+inducing+oscillations+in+intracellular+Ca2++concentration.">Vascular endothelial growth factor stimulates endothelial colony forming cells proliferation and tubulogenesis by inducing oscillations in intracellular Ca2+ concentration.</a> Stem Cells. 29 (11), 1898-1907 (2011).</li><li>Sai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+fibroblast+growth+factor+is+essential+to+maintain+endothelial+progenitor+cell+phenotype+in+TR-BME2+cells.">Basic fibroblast growth factor is essential to maintain endothelial progenitor cell phenotype in TR-BME2 cells.</a> Biological and Pharmaceutical Bulletin. 37 (4), 688-693 (2014).</li><li>Gallus, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspirin+and+other+platelet-aggregation+inhibiting+drugs.">Aspirin and other platelet-aggregation inhibiting drugs.</a> Medical Journal of Asutralia. 142 (1), 41-47 (1985).</li></ol>

SSH מחזיק מניות ב- Verigraft, חברה יש רישיון הטכנולוגיה של רקמות הנדסת כלי הדם. המחברים האחרים אין לחשוף.

הטכניקה המובאת כאן עבור decellularization של הורידים saphenous גדולות היא שיטה קלה, פשוטה וחסכונית, באפשרותך גם להחיל על כל ורידים בקוטר קטן כמו ורידים הטבור ואת החלב. הפתרונות decellularization וריכוזי שלהם בשימוש בשיטה זו הם שלנו6,הקודם תוצאות7. אף-על-פי מומלץ 5 מחזורים של decellularization, בורידים מסוימים גם הבחנו decellularization מלאה ב- 3 מחזורים. עם זאת, תוצאות לשחזור התקבלו באמצעות 5 מחזורים. יישום פרוטוקול זה, אנחנו decellularized ורידים באורכים משתנים עד 30 ס מ בהצלחה (לא פורסם התוצאה). הרמה outlet של הפתרון decellularization 45 ס מ ייצור בלחץ של 33 מ מ כספית בתוך הווריד. מניסיוננו, שמנו לב זה כצעד מפתח ב decellularizing את הווריד כל בצורה אחידה, reproducibly 5 מחזורים. הלחץ שבחרת הוא גבוה פי 3 מאשר הלחץ הרגיל וריד saphenous (5-10 מ מ כספית) אבל שכמו פסול כלי הדם (ורידים)23. בנוסף, אנו משערים כי זו בלחץ גבוה תיצור כח משמעותי על קירות וריד, עשויים, לכן, לסייע בהסרת התאים באופן יעיל ומהיר.
מאז TnBP הממס אורגני מסיס במים, לערבב הנוזל עד שיהפוך מעונן חשובה; אחרת, הנוזל יצוף. מאותה סיבה, כדי לשמור על TnBP מעורבת בפתרון, הונח צינור עודפים של הנוזל בראש צנצנת הזכוכית עם השקע צינור. הסרה יעילה של TnBP מ הווריד לאחר השימוש בבכל מחזור ניתן לראות בגלל היעדר צף TnBP טיפות במים שטף. יש לנו גם לב כי דילוג על השלב DNase גם הפיק רקמה decellularized, אבל במקרים אחדים, תוכן ה-DNA יחסית גבוהה בתוך הרקמה decellularized היה לב. כפי בלחץ גבוה, זרימה גבוהה המחירים אינם נדרשים לפעילות DNase יעיל, עשוי לשמש שיעור נמוך זלוף (10 מ ל/דקה). משאבה סחרור שונות שימש כמו גודלו קטן עוזר בטיפול קל של ההתקנה. מאז ששמנו לב את הנזק של רוב התאים במהלך decellularization תוצאות במחזור 2, אנו מציעים דילוג על טיפול DNase במהלך מחזורי 1 ו- 3 (תוצאה שלא פורסמו). אף-על-פי אפיון של כימות של מטריצה חוץ-תאית חלבונים לא בוצעו כתב יד זה, ניסיון העבר שלנו עם פרוטוקולים decellularization דומה הראה על שימור נכסים ביו-מכני, מטריצה חוץ-תאית המבנה של חלבונים7. למרות ניסויים כימות הראשוני שלנו עם ורידים אלה הפיק תוצאה דומה (לא פורסם), התוצאות שפורסמו כבר שלנו יחזק את הביטחון הזה.
Recellularization דם הוא תהליך קל ונוח על תאים במח העצם מורחבת ככל אחד יכול להימנע זמן תא הרחבה פעמים, מוטציות ספונטניות תאים מורחבת, הפלישה כירורגית ו אי נוחות לחולה. כיוון שידוע כי endothelialization יכול להתרחש גם מלהסתובב EPCs, שיערנו כי זלוף בדם ואחריו זלוף בינונית אנדותל יהיה מספיק עבור recellularization. הבטיחות של וריד רקמות מהונדסים באמצעות שיטה דומה נראה מתוצאות מוצלחת של השתלת כאשר שני ורידים כאלה שהיו מושתלים לתוך ילדים עם הפרעה נוספת וריד שער7. אנו משערים כי הגורמים צמיחה decellularized מטריצה חוץ-תאית יאפשר את הקובץ המצורף של מחזורי EPCs מן הדם24. Recellularization של ורידים בעקבות פרוטוקול דומה הראתה. תאי חיובי עבור VEGF קולטן-2 ואשכול של בידול (CD) 14-לומן תוך CD45 התאים מבטאים נראו ב- adventitia7 אנו גם לדמיין כי שכבת אנדותל רציף לא ייבחנו בכל המקרים במיוחד בעת שימוש דם מחולים מבוגרים וחולים כפי שהוא מוכר כי אנשים כאלה פחתו מספרים של מחזורי תאים קדמון25. עם זאת, אנחנו בקביעתו כי זלוף עם האישי של המטופל דם עשוי להסוות רבים של אנטיגנים נחשפים בגלל decellularization, ובכך עשויה להקטין את הסיכויים של תגובות דלקתיות שליליות כאשר מושתלים בניגוד משתילים רק decellularized כלי הדם. בנוסף, הדם זלוף יכול להפקיד רמות גבוהות של גורמי גדילה לומן, adventitia אשר בתורו יכול לגייס מספר רב יותר של מחזורי ובתאים וכתוצאה מכך תהליך מהיר של recellularization ויוו.
היתרונות של עיצוב ביוריאקטור השתמשו במחקר זה הם autoclaving מלאה, הרכבה קלה, משתלמת, טיפול קל, את האפשרות לפחות של נזק. מניסיוננו, באמצעות העיצוב הנוכחי, הורידים עד 10 ס מ אורך היו recellularized. למרות הוורידים עד 25 ס מ אורך גם יכול להיות recellularized על ידי שמירה על הווריד של במצב "U" בתוך ביוריאקטור, זה לאמת. העיצוב ביוריאקטור מראה הכיוון של זרימה בווריד נגד כוח המשיכה תוכנן כך כי זה הכיוון הרגיל של הזרימה עבור ורידים אלה בבני אדם. זלוף 12 שעות של צעד בינוני אנדותל היא precondition את הווריד, להגדיל את הזיקה עבור החזקה של EPCs נכנסות. תוספת של הפארין נוספת זלוף עבור 1 h תפחית את הסיכון של יצירת קרישי דם בתוך הצינורות במהלך הדם זלוף.
נפח הדם הנדרש תלוי אורך הווריד. העיקרון הבסיסי שנעקוב אחרי עבור נפח הדם היא כי הווריד צריך להיות שקוע בתוך הדם. תוך כדי טיפול גדול יותר 45 מ ל דם כרכים, ערבוב מזדמן יידרש כדי למנוע הצטברות תאים בתחתית ביוריאקטור. הוספנו לפתרון של סטין דם כיוון שהוא מכיל כמות גבוהה של חלבונים, הרכיבים הדרושים כדי לשמור על רקמות בריא במהלך26,של השתלת איברים27. תוספת של VEGF ו- b-FGF מועיל כפי הם גורמי גדילה האנגיוגנזה חזק28 ומשרה את נוכחותם ההעברה, התפשטות, הבידול של EPCs29,30,31,32 . הכמות של VEGF הוסיף מבוסס על תוצאות שלא פורסמו הקודמת שלנו איפה ההתפשטות של EPCs נראתה ב- 80 ng/mL. תוספת של אספירין מעכב את ההפעלה של טסיות33 ובכך להקטין את הסיכוי שלהם מצורף שכבת אנדותל. ניטור רציף, תוספת של גלוקוז גם יהיה מועיל התפשטות תאים ולמניעת המוליזה של כדוריות דם אדומות.
מאז רק דגימת דם פשוטה נדרש מן הנמען, זה יכול להיות נחשב הליך קל של ריאלי הדורש מומחיות טכנית פחות. למרות, כל התהליך המוצג כאן מההתחלה לסיים לוקח 20 ימים, אחסון הורידים decellularized כמו מהמדף מוצר יקטין את ההליך כדי 8 ימים עבור חולים. למרות אחסון של ורידים decellularized טכנית לא תשפיע על היעילות recellularization, זה חייב להיות מוערך. רקמות מהונדסים ורידים שנוצר בעקבות הליך זה יכול לשמש במרפאה לניתוח מעקפים, החלפת חסמים ורידים, אי ספיקה ורידית מובילים דליות ורידים ללא צורך דיכוי המערכת החיסונית, ובכך לספק איכות טובה יותר של החיים עבור המטופל.

תעלות כלי דם יש צורך במספר תנאים קליניים כמו מפרצות, היצרות העורק הראשי, טרשת עורקים המובילים לבעיות קשות של כלי הדם. מנתחים להשתמש תעלות כלי דם עצמיים, allogeneic או סינתטיים כדי לשחזר את אספקת הדם פונקציונלי. למרות השימוש של כלי דם עצמיים עדיין נחשב הגישה האידיאלית, זמינות בחולים מוגבל צהובה. החלופות כגון שתלי allogeneic או סינתטי יש בעיות עמוקה עם טיפולים לדיכוי המערכת החיסונית ואת עני patency שמוביל reoperation1,2, וכתוצאה מכך הבריאותיות העיקריים בנטל כלכלי למדינות. הנדסת רקמות של כלי הדם שואפת לספק שתלי הומולוגיה הטבעי של תאים עצמיים. לפיכך, המערכת החיסונית הנמען מזהה השתל מהתורם העצמי, מאחר שתל כזה מכיל חלבונים טבעיים של תאים בתצורה המקורית, זה עשוי לתפקד טוב יותר לעומת החלופות הנוכחי. רקמות מהונדסים איברים, כמו למשל את שלפוחית השתן3, את השופכה4, קנה הנשימה5ו6,ורידים7, בהצלחה שימשו במרפאה.
הנדסת רקמות לייצר שתלים אישית דורשת השתלה מתורם ואחריו decellularization ו recellularization. Decellularization היא טכנולוגיה מבטיח להסיר תאים לרקמות ואיברים8,9,10. Decellularization יכול להתבצע על ידי שיטות ספציפיות פיזי, כימי אנזימטי11 או שילובם. -שימוש אופטימלי של שיטות אלה, רקמות decellularized יכולות להיות דומה חלבונים מבניים ופונקציונליים מטריצה חוץ-תאית דומה לרקמות מקורית. איברים כאלה בעלי יכולת מהותי כדי לשפר את הקובץ המצורף, הגירה, התפשטות, התמיינות של תאי גזע נכנסות.
Recellularization הוא תהליך דינאמי של זריעה תאים לתוך השתל, תאי גזע הנמען יכול לשמש עבור השתלת קליניים. תאי גזע בשימוש כיום למטרות כאלה כוללים מח העצם, mesenchymal איבר תושבים3,5,6. חיה ולימודי מחקר מונחה השתמשו בתאי גזע ממוצא mesenchymal שאינם pluripotent עוברית, מושרה12,13,14. תהליך זה דורש מגיב ביולוגי (חדר מחזיקה את הווריד ומספק את התנאים הנדרשים כמו טמפרטורה, גזים, pH לחץ), תאים ומדיה תרבות. האתגר של recellularization הוא כדי להשיג את המספר הנדרש של תאים של סוג מסוים של אסטרטגיה זריעה שבו תאים יכולים להגיע כל רקמה או איבר. למרות אין איבר או רקמה מלאה מבחינה מבנית והן מבחינה תפקודית יש כבר נוצר, מוערכים עד עכשיו, מספר הפיתוחים בשדה ואת תוצאות ראשוניות להראות את האפשרות העתידית15. הפונקציה מפתח של הווריד טמון אנדותל luminal השולטת חדירה של תאים דלקתיים ברקמות, השכבה האמצעית שריר חלק, מסייע לתעוקה ומספק גם את הכוח להחזיק את לחץ הדם16. מחקרים הראו כי במהלך נזק, endothelialization מתרחשת השקה או מלהסתובב אנדותל ובתאים (EPCs) דם17,18,19. האסטרטגיה שלנו עבור recellularization של ורידים מסתמך על EPCs ההווה במחזור הדם.
הנדסת רקמות של ורידים, עורקים בוצע על ידי מספר קבוצות עוקב אחר decellularization ו- recellularization אסטרטגיות20,21. הקבוצה שלנו יש גם לבצע ופיתח אסטרטגיות decellularization ו- recellularization ורידים iliac ואת החלב6,7. Decellularization בוצע על ידי חרדה הווריד ב טריטון X-100, tri-n-בוטיל פוספט (TnBP), וכן אנזים deoxyribonuclease (DNase). Recellularization בוצעה באמצעות מח עצם נגזר אנדותל וחלק שרירים תאים6 או דם היקפיים7. הורידים recellularized על-ידי פרוטוקול גם הראו הבטחה קליניים במתן אספקת דם תפקודי השתלת של ילדים חולים עם6,חסימה נוספת וריד שער7.
כיום פותחו גירסה שונה של פרוטוקול זהה עבור ביצועים משופרים וקל של decellularization, recellularization, ביוריאקטור טיפול ורידים בקוטר קטן. פרוטוקול decellularization הנוכחי נדרש זלוף של דטרגנטים דרך הווריד של באמצעות הלחץ במקום עצבנות עם דטרגנטים. פרוטוקול recellularization כרוך צעד נוסף של preconditioning לשיפור הידבקות תאים ותוספת של גורמי גדילה במחזור הדם לשיפור הידבקות תאים, הישרדות והתפשטות. גם שיפרנו את העיצוב של ביוריאקטור שימוש במוצרים זמינים מסחרית. בנייר זה, אנו מציגים תיאור מפורט של פרוטוקול שונה עבור ביצוע decellularization ו- recellularization של האדם הורידים saphenous גדולות.

<table><tbody><tr><td>4-Port Cap</td><td>CPLabSafety</td><td>WF-GL45-4Kit</td><td></td></tr><tr><td>Acetyl salicylic acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5376</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Anti</td><td>Life Technologies</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>B-FGF</td><td>Lonza</td><td>cc-4113B</td><td></td></tr><tr><td>Blood Glucose monitoring system - Free style Lite</td><td>Abbott</td><td>70808-70</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8769</td><td></td></tr><tr><td>DNase-I</td><td>Worthington</td><td>LS0020007</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s PBS with CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; and MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8662</td><td></td></tr><tr><td>EDTA disodium salt dihydrate</td><td>AlfaAesar</td><td>A15161.OB</td><td></td></tr><tr><td>EGM-2 Growth Factors Kit</td><td>Lonza</td><td>CC-4176</td><td></td></tr><tr><td>EG-VEGF</td><td>Peprotech</td><td>100-44</td><td></td></tr><tr><td>Glass bottle 250ml</td><td>VWR</td><td>2151593</td><td>Any bottle with GL45 cap can be used</td></tr><tr><td>Glass bottle 1L</td><td>VWR</td><td>2151595</td><td>Any bottle with GL45 cap can be used</td></tr><tr><td>Glass jar 500ml with bottom hose outlet</td><td>Kimble Chase Life Science</td><td>14607</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Leo</td><td>387107</td><td></td></tr><tr><td>Heparin Coated Vacutainer Tubes</td><td>Becton Dickinson</td><td>368480</td><td></td></tr><tr><td>Human AB Serum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3667</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Life Technologies</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Luer Female with 1/8&quot; ID Barb</td><td>Oina</td><td>LF-2PP-QC</td><td>For 3X5mm silicon tube</td></tr><tr><td>Luer Female with 3/32&quot; ID Barb</td><td>Oina</td><td>LF-1.5PP-QC</td><td>For 2X4mm silicon tube</td></tr><tr><td>Luer Male with 3/32&quot; ID Barb</td><td>Oina</td><td>LM-1.5PP-QC</td><td>For 2X4mm silicon tube</td></tr><tr><td>Luer Male with 1/8&quot; ID Barb</td><td>Oina</td><td>LM-2PP-QC</td><td>For 3X5mm silicon tube</td></tr><tr><td>Luer Male with 5/32&quot; ID Barb</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-45518-06</td><td>For 5X8mm silicon tube</td></tr><tr><td>MCDB 131</td><td>Life Technologies</td><td>10372-019</td><td></td></tr><tr><td>Per acetic acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>433241</td><td></td></tr><tr><td>Peristaltic pump I</td><td>Masterflex</td><td>7524-45</td><td>For Decellularization setup 1 and 2. The cassette used is 7519-75</td></tr><tr><td>Peristaltic pump II</td><td>Ismatec</td><td>ISM941</td><td>For Decellularization setup 3 and Recellularization bioreactor.</td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>Potassium hydrogen phosphate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>Reducing Connector 1.5mmX2.5mm</td><td>Biotech</td><td>ISM569A</td><td></td></tr><tr><td>Shaker</td><td>Ika</td><td>KS4000 i&amp;nbsp; control</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Azide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71290</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>13423</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydrogen phosphate</td><td>Merck</td><td>71640-M</td><td></td></tr><tr><td>Steen solution</td><td>Xvivo</td><td>19004</td><td></td></tr><tr><td>Suture</td><td>Agnthos</td><td>14817</td><td></td></tr><tr><td>Tri-n-butyl Phosphate</td><td>AlfaAesar</td><td>A16084.AU</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>AlfaAesar</td><td>A16046.OF</td><td></td></tr><tr><td>Tube 60ml with flat base</td><td>Sarstedt</td><td>60596</td><td></td></tr><tr><td>Tube A</td><td>VWR</td><td>2280706</td><td>Cut 3 pieces, each of 25 cm length for decellularization perfusion steup 1 and 2</td></tr><tr><td>Tube B</td><td>VWR</td><td>2280706</td><td>Cut 1 piece of 35 cm length for decellularization perfusion steup</td></tr><tr><td>Tube C</td><td>VWR</td><td>2280706</td><td>Cut 5 pieces, each of 75 cm length for decellularization perfusion steups 1-3</td></tr><tr><td>Tube D</td><td>VWR</td><td>2280706</td><td>Cut 1 piece of 90 cm length for decellularization perfusion steup 2</td></tr><tr><td>Tube E</td><td>VWR</td><td>2280706</td><td>Cut 1 piece of 20 cm length for recellularization perfusion steup</td></tr><tr><td>Tube F</td><td>VWR</td><td>2280713</td><td>Cut 2 pieces, each of 15 cm length for decellularization perfusion steup 1 and 2</td></tr><tr><td>Tube G</td><td>VWR</td><td>2280713</td><td>Cut 2 pieces, each of 60 cm length for decellularization perfusion steup 1 and 2</td></tr><tr><td>Tube H</td><td>VWR</td><td>2280703</td><td>Cut 1 piece of 15 cm length for recellularization perfusion steup</td></tr><tr><td>Tube I</td><td>VWR</td><td>2280703</td><td>Cut 1 piece of 20 cm length for recellularization perfusion steup</td></tr><tr><td>Tube J</td><td>VWR</td><td>2280703</td><td>Cut 1 piece of 25 cm length for recellularization perfusion steup</td></tr><tr><td>Tube K</td><td>VWR</td><td>2280703</td><td>Cut 2 pieces, each of 35 cm length for recellularization perfusion steup</td></tr></tbody></table>

decellularization and recellularization methodology for human saphenous veins

תעלות כלי דם בשימוש במהלך רוב ניתוחי כלי דם הם שתלים allogeneic או סינתטי לעיתים קרובות לגרום לסיבוכים הנגרמת על ידי החיסוני patency המסכן. הנדסת רקמות מציע פתרון חדשניים ליצירת שתלי אישית עם מטריצה חוץ-תאית טבעי המכיל התאים של המטופל באמצעות השיטה של decellularization ושל recellularization. אנו מראים שיטה מפורטת לביצוע decellularization של וריד saphenous אנושי, recellularization על ידי זלוף דם היקפיים. הווריד היה decellularized על-ידי % 1 פרפוזיה טריטון X-100, 1% tri-n-בוטיל-פוספט (TnBP) ו- 2,000 יחידות קוניץ של deoxyribonuclease (DNase). טריטון X-100 ו- TnBP היו perfused ב 35 מ ל/דקה במשך 4 שעות בעוד DNase היה perfused ב- 10 מ ל/דקה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 4 שעות. תקחי את שטף מים הנדסה גנטית, PBS, ואז מעוקר ב 0.1% חומצה peracetic. זה היה נשטף שוב ב- PBS, preconditioned בינוני אנדותל. הווריד מחובר מגיב ביולוגי, perfused בינונית אנדותל המכיל 50 IU/mL הפארין עבור ה 1 Recellularization בוצע על ידי מילוי של ביוריאקטור עם דם טרי, 1:1 מדולל בפתרון סטין, והוספת בלוטה אנדוקרינית-derived כלי דם גורמי גדילה אנדותל (80 ng/mL), גורמי גדילה בסיסי פיברובלסט (4 µL/mL), חומצה אצטיל-סליצילית (5 µg/mL). ביוריאקטור היה ואז עבר לגור אינקובטור, perfused במשך 48 שעות ב- 2 מ ל/דקה תוך שמירה על גלוקוז בין 3-9 mmol/ל' מאוחר יותר, הווריד היה נשטף עם PBS, מלא בינונית אנדותל, perfused עבור h 96 בחממה. טיפול עם טריטון X-100, TnBP ו- DNase decellularized וריד saphenous 5 מחזורים. הווריד decellularized נראה לבן בניגוד ורידים רגיל ו- recellularized (אדום בהיר). Hematoxylin & אאוזין (H & E) צביעת הראה הנוכחות של גרעינים רק רגיל אך לא ורידים decellularized. את תקחי את recellularized, H & E מכתים הראה הנוכחות של תאים על-פני luminal הווריד.

המורפולוגיה ברוטו של וריד נורמלי הוא האור האדום (איור 3 א). צבע אדום הולך לאיבוד decellularization מתקדמת מחזורים (מחזור 2, איור 3B; מחזור 3, איור 3C) על ידי מחזורth 5, וזה נראה חיוור ולבן (דמות תלת-ממד). הווריד recellularized לאחר הדם זלוף (איור 3E) זלוף מדיה אנדותל (איור 3F) נראה אדום בהיר בצבע. 5 מחזורי הטיפול decellularization בהצלחה להסיר את התאים הווריד כפי אין גרעינים כחול ב H & E ההכתמה (איור 4B) נראו. לעומת זאת, מספר גרעינים נראו בווריד נורמלי (איור 4A). הנוכחות של תאים המצורף בצד luminal נתפסת ב H & E מכתימה את תקחי את recellularized עם דם במשך 48 שעות (איור 4C, חצים שחורים) ואחרי זלוף עם המדיום אנדותל עבור h 96 (דמות תלת-ממד, חצים שחורים).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57803/57803fig1.jpg"> איור 1 : ייצור הייעודיות זלוף decellularization. A) התמונה שתציג את ההגדרה decellularization התאספו 1 עבור טריטון X-100 ושטיפת. החצים הלבנים הצגת הנתיב זרימה לפתרונות ולציין חצים אדומים אינלטס ועודפים וריד ופתרונות. B) התמונה מראה את הכיוונון שהורכב decellularization 2 עבור TnBP זלוף. באופן דומה, כמו decellularization התקנה 1, החצים הלבנים לציין את הנתיב זרימה עבור פתרונות, חיצים אדומים מציינים אינלטס ועודפים וריד ופתרונות. C) התמונה מראה את הכיוונון שהורכב decellularization 3 עבור deoxyribonuclease זלוף. החצים הלבנים הצגת הנתיב זרימה לפתרונות ולציין חצים אדומים אינלטס וריד ופתרונות. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/57803/57803fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a> 
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57803/57803fig2.jpg"> איור 2 : הכנה והרכבה של ביוריאקטור עבור recellularization. A) מראה החומרים הנדרשים להרכבת ביוריאקטור את התמונות. B) תמונה של החלק הפנימי של ארבע יציאות קאפ מציג את המיקום של הפחתת מחברים (חצים אדומים), נקודות חיבור כניסת הווריד, אאוטלט (החצים הלבנים), סידור צינורות H, אני, ג'יי בסוף חינם tube H ימוקם את ביוריאקטור להחזיר מדיה. C) ניתן לראות הצינורות המתאימים עולה ויורד מן הצד העליון של הכובע יציאה 4. D) תמונה המציגה את ביוריאקטור מורכבים. E) תמונה המציגה את הגדרת ביוריאקטור שלם עם המשאבה ממברנות. הצינורות K להאריך חיבורים ביוריאקטור המשאבה ממברנות. F) ייצוג סכמטי של מערכת זלוף ביוריאקטור כל. החיצים כתום לציין את כיוון הזרימה. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/57803/57803fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a> 
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57803/57803fig3.jpg"> איור 3 : ברוטו המורפולוגיה של ורידים במהלך decellularization, recellularization. A) המורפולוגיה ברוטו של וריד רגילה נראה אדום בהיר בצבע. הצבע אובד עם מספר גדל והולך של מחזורים decellularization B) מחזור 2, C) מחזור 3. D) על ידי 5 מחזורים, וריד נראה חיוור ולבן. הווריד לאחר פרפוזיה עם E) דם במשך 48 שעות ו- F) עם המדיום אנדותל עבור 96 h נראה אדום בהיר שוב בצבע. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/57803/57803fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57803/57803fig4.jpg"> איור 4 : אפיון של ורידים decellularized, recellularized. Hematoxylin של eosin צביעת תמונה של א) וריד נורמלי מכיל גרעינים כחולים רבים אך הם נעדרים ב B) וריד decellularized. את תקחי את recellularized עם C) דם במשך 48 שעות ועם D) בינוני אנדותל עבור h 96, מצורף של תאים (חיצים שחורים) על לומן היה לב. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/57803/57803fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Decellularization and Recellularization Methodology for Human Saphenous Veins at JoVE.com

Decellularization and Recellularization Methodology for Human Saphenous Veins

Decellularization ומתודולוגיה Recellularization עבור האדם הורידים saphenous גדולות

כאן, אנו מתארים את פרוטוקול להצפנה decellularization וריד saphenous באמצעות חומרי ניקוי, recellularization על ידי זלוף של הדם ההיקפיים, המדיום אנדותל.

Vascular conduits used during most vascular surgeries are allogeneic or synthetic grafts that often lead to complications caused by immunosuppression and ...

decellularization-recellularization-methodology-for-human-saphenous

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.1K Views.  University of Gothenburg. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול להצפנה decellularization וריד saphenous באמצעות חומרי ניקוי, recellularization על ידי זלוף של הדם ההיקפיים, המדיום אנדותל.

Video: Decellularization and Recellularization Methodology for Human Saphenous Veins

Decellularization and Recellularization of Whole Livers

The liver is a complex organ which requires constant perfusion for delivery of nutrients and oxygen and removal of waste in order to survive1. Efforts to recreate or mimic the liver microstructure with grounds up approach using tissue engineering and microfabrication techniques have not been successful so far due to this design challenge. In addition, synthetic biomaterials used to create scaffolds for liver tissue engineering applications have been limited in inducing tissue regeneration and repair in large part due to the lack of specific cell binding motifs that would induce the proper cell functions2. Decellularized native tissues such blood vessels3and skin4on the other hand have found many applications in tissue engineering, and have provided a practical solution to some of the challenges. The advantage of decellularized native matrix is that it retains, to an extent, the original composition, and the microstructure, hence enhancing cell attachment and reorganization5.
In this work we describe the methods to perform perfusion-decellularization of the liver, such that an intact liver bioscaffold that retains the structure of major blood vessels is obtained. Further, we describe methods to recellularize these bioscaffolds with adult primary hepatocytes, creating a liver graft that is functional in vitro, and has the vessel access necessary for transplantation in vivo.

Perfusion decellularization is a novel technique to produce whole liver scaffolds that retains the organ's extracellular matrix composition and microarchitecture. Herein, the method of preparing whole organ scaffolds using perfusion decellularization and subsequent repopulation with hepatocytes is described. Functional and transplantable liver grafts can be generated using this technique.

Decellularization ו Recellularization של כבדים שלמים

The liver is a complex organ which requires constant perfusion for delivery of nutrients and oxygen and removal of waste in order to survive1. Efforts to ...

Autologous Endothelial Progenitor Cell-Seeding Technology and Biocompatibility Testing For Cardiovascular Devices in Large Animal Model

Implantable cardiovascular devices are manufactured from artificial materials (e.g. titanium (Ti), expanded polytetrafluoroethylene), which pose the risk of thromboemboli formation1,2,3. We have developed a method to line the inside surface of Ti tubes with autologous blood-derived human or porcine endothelial progenitor cells (EPCs)4. By implanting Ti tubes containing a confluent layer of porcine EPCs in the inferior vena cava (IVC) of pigs, we tested the improved biocompatibility of the cell-seeded surface in the prothrombotic environment of a large animal model and compared it to unmodified bare metal surfaces5,6,7 (Figure 1). This method can be used to endothelialize devices within minutes of implantation and test their antithrombotic function in vivo. 
Peripheral blood was obtained from 50 kg Yorkshire swine and its mononuclear cell fraction cultured to isolate EPCs4,8. Ti tubes (9.4 mm ID) were pre-cut into three 4.5 cm longitudinal sections and reassembled with heat-shrink tubing. A seeding device was built, which allows for slow rotation of the Ti tubes. 
We performed a laparotomy on the pigs and externalized the intestine and urinary bladder. Sharp and blunt dissection was used to skeletonize the IVC from its bifurcation distal to the right renal artery proximal. The Ti tubes were then filled with fluorescently-labeled autologous EPC suspension and rotated at 10 RPH x 30 min to achieve uniform cell-coating9. After administration of 100 USP/ kg heparin, both ends of the IVC and a lumbar vein were clamped. A 4 cm veinotomy was performed and the device inserted and filled with phosphate-buffered saline. As the veinotomy was closed with a 4-0 Prolene running suture, one clamp was removed to de-air the IVC. At the end of the procedure, the fascia was approximated with 0-PDS (polydioxanone suture), the subcutaneous space closed with 2-0 Vicryl and the skin stapled closed. 
After 3 - 21 days, pigs were euthanized, the device explanted en-block and fixed. The Ti tubes were disassembled and the inner surfaces imaged with a fluorescent microscope.
We found that the bare metal Ti tubes fully occluded whereas the EPC-seeded tubes remained patent. Further, we were able to demonstrate a confluent layer of EPCs on the inside blood-contacting surface.
Concluding, our technology can be used to endothelialize Ti tubes within minutes of implantation with autologous EPCs to prevent thrombosis of the device. Our surgical method allows for testing the improved biocompatibility of such modified devices with minimal blood loss and EPC-seeded surface disruption.

A method for seeding titanium blood-contacting biomaterials with autologous cells and testing biocompatibility is described. This method uses endothelial progenitor cells and titanium tubes, seeded within minutes of surgical implantation into porcine venae cavae. This technique is adaptable to many other implantable biomedical devices.

עצמיים אבי האנדותל Cell-מתזמן טכנולוגיה בדיקה biocompatibility עבור התקנים לב וכלי דם במודל חיה גדולה

Implantable cardiovascular devices are manufactured from artificial materials (e.g. titanium (Ti), expanded polytetrafluoroethylene), which pose the risk ...

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Cancer is one of the leading causes of death worldwide. Current therapeutic strategies are predominantly developed in 2D culture systems, which inadequately reflect physiological conditions in vivo. Biological 3D matrices provide cells an environment in which cells can self-organize, allowing the study of tissue organization and cell differentiation. Such scaffolds can be seeded with a mixture of different cell types to study direct 3D cell-cell-interactions. To mimic the 3D complexity of cancer tumors, our group has developed a 3D in vitro tumor test system.	
	Our 3D tissue test system models the in vivo situation of malignant peripheral nerve sheath tumors (MPNSTs), which we established with our decellularized porcine jejunal segment derived biological vascularized scaffold (BioVaSc). In our model, we reseeded a modified BioVaSc matrix with primary fibroblasts, microvascular endothelial cells (mvECs) and the S462 tumor cell line. For static culture, the vascular structure of the BioVaSc is removed and the remaining scaffold is cut open on one side (Small Intestinal Submucosa SIS-Muc). The resulting matrix is then fixed between two metal rings (cell crowns).	
	Another option is to culture the cell-seeded SIS-Muc in a flow bioreactor system that exposes the cells to shear stress. Here, the bioreactor is connected to a peristaltic pump in a self-constructed incubator. A computer regulates the arterial oxygen and nutrient supply via parameters such as blood pressure, temperature, and flow rate. This setup allows for a dynamic culture with either pressure-regulated pulsatile or constant flow.	
	In this study, we could successfully establish both a static and dynamic 3D culture system for MPNSTs. The ability to model cancer tumors in a more natural 3D environment will enable the discovery, testing, and validation of future pharmaceuticals in a human-like model.

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Methods to create human 3D tumor tissues as test systems are described. These technologies are based on a decellularized Biological Vascularized Scaffold (BioVaSc), primary human cells and a tumor cell line, which can be cultured under static as well as under dynamic conditions in a flow bioreactor.

הנדסת רקמות של 3D אדם<em&gt; במבחנה</emמערכת מבחן גידול&gt;

Cancer is one of the leading causes of death worldwide.  Current therapeutic strategies are predominantly developed in 2D culture  systems, which ...

Generation and Grafting of Tissue-engineered Vessels in a Mouse Model

The construction of vascular conduits is a fundamental strategy for surgical repair of damaged and injured vessels resulting from cardiovascular diseases. The current protocol presents an efficient and reproducible strategy in which functional tissue engineered vessel grafts can be generated using partially induced pluripotent stem cell (PiPSC) from human fibroblasts. We designed a decellularized vessel scaffold bioreactor, which closely mimics the matrix protein structure and blood flow that exists within a native vessel, for seeding of PiPSC-endothelial cells or smooth muscle cells prior to grafting into mice. This approach was demonstrated to be advantageous because immune-deficient mice engrafted with the PiPSC-derived grafts presented with markedly increased survival rate 3 weeks after surgery. This protocol represents a valuable tool for regenerative medicine, tissue engineering and potentially patient-specific cell-therapy in the near future.

Here, we present a protocol to generate tissue engineered vessel grafts that are functional for grafting into mice by double seeding partially induced pluripotent stem cell (PiPSC) - derived smooth muscle cells and PiPSC - derived endothelial cells on a decellularized vessel scaffold bioreactor.

דור והארכת כלי רקמות מהונדסות במודל עכבר

The construction of vascular conduits is a fundamental strategy for surgical repair of damaged and injured vessels resulting from cardiovascular diseases. ...

Procedure for Human Saphenous Veins Ex Vivo Perfusion and External Reinforcement

The mainstay of contemporary therapies for extensive occlusive arterial disease is venous bypass graft. However, its durability is threatened by intimal hyperplasia (IH) that eventually leads to vessel occlusion and graft failure. Mechanical forces, particularly low shear stress and high wall tension, are thought to initiate and to sustain these cellular and molecular changes, but their exact contribution remains to be unraveled. To selectively evaluate the role of pressure and shear stress on the biology of IH, an ex&#160;vivo perfusion system (EVPS) was created to perfuse segments of human saphenous veins under arterial regimen (high shear stress and high pressure). Further technical innovations allowed the simultaneous perfusion of two segments from the same vein, one reinforced with an external mesh. Veins were harvested using a no-touch technique and immediately transferred to the laboratory for assembly in the EVPS. One segment of the freshly isolated vein was not perfused (control, day 0). The two others segments were perfused for up to 7 days, one being completely sheltered with a 4 mm (diameter) external mesh. The pressure, flow velocity, and pulse rate were continuously monitored and adjusted to mimic the hemodynamic conditions prevailing in the femoral artery. Upon completion of the perfusion, veins were dismounted and used for histological and molecular analysis. Under ex&#160;vivo conditions, high pressure perfusion (arterial, mean = 100 mm Hg) is sufficient to generate IH and remodeling of human veins. These alterations are reduced in the presence of an external polyester mesh.

Procedure for Human Saphenous Veins Ex Vivo Perfusion and External Reinforcement

The mechanisms leading to the development of intimal hyperplasia (IH) and vein graft failure are still poorly understood. This study describes an ex&#160;vivo system to perfuse human veins under controlled flow and pressure. Furthermore the efficiency of external mesh reinforcement to limit the development of IH was evaluated.

נוהל saphenous אדם הוורידים<em&gt; Ex Vivo</em&gt; זלוף וחיצוני חיזוק

The mainstay of contemporary therapies for extensive occlusive arterial disease is venous bypass graft. However, its durability is threatened by intimal ...

Medicine

Procurement and Perfusion-Decellularization of Porcine Vascularized Flaps in a Customized Perfusion Bioreactor

Large volume soft tissue defects lead to functional deficits and can greatly impact the patient&#39;s quality of life. Although surgical reconstruction can be performed using autologous free flap transfer or vascularized composite allotransplantation (VCA), such methods also have disadvantages. Issues such as donor site morbidity and tissue availability limit autologous free flap transfer, while immunosuppression is a significant limitation of VCA. Engineered tissues in reconstructive surgery using decellularization/recellularization methods represent a possible solution. Decellularized tissues are generated using methods that remove native cellular material while preserving the underlying extracellular matrix (ECM) microarchitecture. These acellular scaffolds can then be subsequently recellularized with recipient-specific cells.
This protocol details the procurement and decellularization methods used to achieve acellular scaffolds in a pig model. In addition, it also provides a description of the perfusion bioreactor design and setup. The flaps include the porcine omentum, tensor fascia lata, and the radial forearm. Decellularization is performed via ex vivo perfusion of low concentration sodium dodecyl sulfate (SDS) detergent followed by DNase enzyme treatment and peracetic acid sterilization in a customized perfusion bioreactor.
Successful tissue decellularization is characterized by a white-opaque appearance of flaps macroscopically. Acellular flaps show the absence of nuclei on histological staining and a significant reduction in DNA content. This protocol can be used efficiently to generate decellularized soft tissue scaffolds with preserved ECM and vascular microarchitecture. Such scaffolds can be used in subsequent recellularization studies and have the potential for clinical translation in reconstructive surgery.

The protocol describes the surgical procurement and subsequent decellularization of vascularized porcine flaps by the perfusion of sodium dodecyl sulfate detergent through the flap vasculature in a customized perfusion bioreactor.

רכש ופרפוזיה-דה-סלוליזציה של דשים וסקולריים חזיריים בביוריאקטור פרפוזיה מותאם אישית

Large volume soft tissue defects lead to functional deficits and can greatly impact the patient&#39;s quality of life. Although surgical reconstruction ...

Procurement and Decellularization of Rat Hindlimbs Using an Ex Vivo Perfusion-Based Bioreactor for Vascularized Composite Allotransplantation

Patients with severe traumatic injuries and tissue loss require complex surgical reconstruction. Vascularized composite allotransplantation (VCA) is an evolving reconstructive avenue for transferring multiple tissues as a composite subunit. Despite the promising nature of VCA, the long-term immunosuppressive requirements are a significant limitation due to the increased risk of malignancies, end-organ toxicity, and opportunistic infections. Tissue engineering of acellular composite scaffolds is a potential alternative in reducing the need for immunosuppression. Herein, the procurement of a rat hindlimb and its subsequent decellularization using sodium dodecyl sulfate (SDS) is described. The procurement strategy presented is based upon the common femoral artery. A machine perfusion-based bioreactor system was constructed and used for ex vivo decellularization of the hindlimb. Successful perfusion decellularization was performed, resulting in a white translucent-like appearance of the hindlimb. An intact, perfusable, vascular network throughout the hindlimb was observed. Histological analyses showed the removal of nuclear contents and the preservation of tissue architecture across all tissue compartments.

Procurement and Decellularization of Rat Hindlimbs Using an Ex Vivo Perfusion-Based Bioreactor for Vascularized Composite Allotransplantation

We describe the surgical technique and decellularization process for composite rat hindlimbs. Decellularization is conducted using low-concentration sodium dodecyl sulfate through an ex vivo machine perfusion system.

רכש ודה-סלוליזציה של חולדות אחוריות באמצעות ביוריאקטור מבוסס ex vivo perfusion עבור allotransplantation מרוכב וסקולרי

Patients with severe traumatic injuries and tissue loss require complex surgical reconstruction. Vascularized composite allotransplantation (VCA) is an ...

Synergizing Antegrade Endoscopic with Bridging Vein Harvesting for Improvement of Great Saphenous Vein Graft Quality from the Lower Leg

Antegrade endoscopic harvesting of autografts for bypass grafting may be an optimal strategy addressing excellent graft quality and reduced post-operative wound complications. This standardized protocol for antegrade endoscopic vein harvesting (EVH) from the lower leg has the potential to be introduced to routine coronary artery bypass grafting (CABG). Patients undergoing CABG surgery are positioned on a surgical table with two additional foam rollers below the extended legs, enabling antegrade EVH from the lower leg. Following minimally invasive surgical access through a bridging vein harvest technique, an endoscopic optical dissector is inserted antegrade into the wound. The main vessel and side branches are dissected under continuous optical control of vein quality status and the working channel. After, an endoscopic optical retractor is inserted with an internal bipolar electrocoagulation device for precise, safe, and tissue-protective interruption of side branches. After release of the vein, the vessel is cut off at the proximal and distal ends under optical control, retrieved from the wound, then cannulated and flushed with heparinized saline. Finally, all side branches of the vein graft are double-clipped. Vascular histology is analyzed in a randomized selection of vein samples. After applying this standardized EVH protocol, the learning curve was shown to be steep, and graft quality was sufficient for coronary artery bypass grafting in every case. There was no conversion to surgical harvesting and low risks for tissue damage and bleeding. Leg positioning and synergizing EVH with bridging vein harvesting improved procedural success and vein graft quality. In our hands, antegrade EVH from the lower leg was feasible, demonstrating straightforward graft dissection as well as adequate macroscopic and microscopic graft quality with preserved endothelial integrity. In conclusion, the introduced technique is safe, shows excellent vein autograft quality, and illustrates feasibility for elective and urgent isolated CABG and combined CABG scenarios.

Presented here is a protocol for antegrade endoscopic vein harvesting from the lower leg, which can safely be introduced in routine coronary artery bypass grafting. Vein grafts present excellent graft quality following this standardized protocol with positioning of the legs, minimally invasive access to the vein, and antegrade endoscopic vein harvesting.

סינגיזינג אנדוסקופי עם קציר וריד לשיפור איכות השתל וריד הגדול מהרגל התחתונה

Antegrade endoscopic harvesting of autografts for bypass grafting may be an optimal strategy addressing excellent graft quality and reduced post-operative ...

A Training and Testing System for Performing Vascular Reconstruction In Vitro

Manual vascular reconstruction training is essential for a beginner surgeon. However, an optimal training system for vascular reconstruction in vitro has yet to be developed. In this study, we introduce an in vitro training and testing system using a magnetic anchoring technique with which a trainee can practice manual vascular reconstruction individually. Additionally, this system can also be used to test the quality of the reconstruction. The described system includes a vascular reconstruction training machine, magnetic tractors, and a magnetic suture puller. In this manuscript, we detail an end-to-end vein anastomosis using porcine right and left iliac veins. To identify the potential damage caused by a magnetic suture puller on the suture, we created three groups with six segments of 4-0 polypropylene sutures each: a control group with no intervention on the polypropylene suture, a group in which the polypropylene suture is manually pulled with sterile gloves 20x, and a magnetic puller group in which the magnetic puller pulled the polypropylene suture 20x. These groups were tested by light microscopy and breaking strength tests, and the effect of reconstruction was assessed. In the light microscopy test, the control group was less likely to be damaged (p &#60; 0.05) and the number of damaged points of the manual group and magnetic puller group were similar (p &#62; 0.05). The results of the breaking strength test were compared across groups and no significant difference was observed (p &#62; 0.05). The end-to-end anastomosis of the porcine iliac veins was successfully performed using this training system, and the reconstructed veins could undergo 2.0 kPa perfusion pressure. Using this training and testing system the trainee can practice manual vascular reconstruction in vitro individually with the aid of magnetic tractors and a magnetic suture puller, and the quality of the reconstruction can be tested.

Here we present a training and testing system where a trainee can complete manual vascular reconstruction in vitro individually using a magnetic anchoring technique. The system can also be used to test the quality of reconstruction.

מערכת הדרכה ובדיקה לביצוע שחזור כלי דם במערכת החוץ

Manual vascular reconstruction training is essential for a beginner surgeon. However, an optimal training system for vascular reconstruction in vitro has ...

Occlusion of the Great and Small Saphenous Vein Using Copolymeric Glue Based on N-Butyl Cyanoacrylate and Methacryloxy Sulfolane

We present the preliminary results of a longitudinal observational study aimed at evaluating the effectiveness and safety at different short- and long-term follow-ups of vascular occlusion of the great saphenous vein (GSV) and small saphenous vein (SSV) affected by severe pathological reflux, using an innovative modified cyanoacrylate surgical glue composed of N-butyl cyanoacrylate and methacryloxy sulfolane (NBCA+MS). Ninety patients, prospectively recruited for 1 year, underwent the study with EcoColor-Doppler (ECD) to evaluate the maximum diameters of the GSV and SSV in the orthostatic position and the reflux time (RT). An RT greater than 0.5 s was considered pathologic. Clinical, etiology, anatomy, and pathophysiology (CEAP) assessment was used for the complete evaluation of each patient in the study. All the patients were treated by NBCA+MS glue to obtain vein occlusion and observed before treatment (baseline; T0), within 6 h after treatment (T1), 1 month after treatment (T2), 3 months after treatment (T3), 6 months after treatment (T4), and 1 year after treatment (T5). Chi-square (&#967;) analysis was performed to evaluate the effectiveness and safety of the treatment. All the patients participated in the entire duration of the study. Complete occlusion was maintained in 100% of patients at T1, 98.9% at T2 and T3, and 97.8% at T4 and T5 (p &lt; 0.001). None of the patients suffered from post-surgical thrombosis. No blue hyperpigmentation, or paresthesia was observed during the entire observation period. Immediately after treatment, 7.7% of patients needed painkillers; 1 week after treatment, 100% of patients returned to normal life. Vascular occlusion of the great or small saphenous vein using NBCA+MS glue is a safe procedure with persistent benefits after a 1 year follow-up. This procedure can be performed with local anesthesia, allowing a quick return to normal life. Thanks to its low invasiveness, the treatment is not painful.

Here, we present a protocol to treat the great saphenous vein (GSV) and the small saphenous vein (SSV) affected by severe pathological reflux, using an original sclerosing and embolizing cyanoacrylate-based glue composed of N-butyl cyanoacrylate and methacryloxy sulfolane (NBCA+MS).

Decellularization ומתודולוגיה Recellularization עבור האדם הורידים saphenous גדולות

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video